Name: מודל חזק המושרה לקשירה של חניכיים Murine להערכת הנויטרופילים אוראלי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: למדו מודל קשירה מושרה לחניכיים Murine להערכת נויטרופילים אוראליים בדלקת חניכיים. שיטה זו מגדילה את נפח הרקמות הדלקתיות ומפחיתה שימוש בבעלי חיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ג. וו. סי נתמך על ידי המכונים הקנדיים לחקר הבריאות (CIHR). המחברים רוצים להודות ד ר Chunxiang Sun על הסיוע שלה בביצוע הטריכתמים כחול.

כל מחקרים מורטין נענו לתקנות המוסריות הרלוונטיות ואושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת טורונטו ומועצת האתיקה של המחקר (פרוטוקול 20011930).
1. התקנת קשירה
הערה: זהו נוהל כירורגי לא סטרילי שניתן לבצע באולם הפעלה רגיל. השימוש בבעלי חיים ללא חיידקים (לא מכוסה כאן) מנדטים טיפול בתוך הקבינט אבטחה, שימוש במכשירים סטרילי, והחיסון של חלל הפה עם פתוגנים חניכיים כדי לגרום לביטויים הקליניים של חניכיים.
<ol><li>לנהל את ההרדמה התוך הצפק ל 8 – 12 שבוע בן זכר C57BL/6 עכברים, אשר צריך להיות הסתגלות למתקן הדיור שלהם, באמצעות 0.5 "26 גרם מחט תת-עורית סטרילי ו 1 מזרק mL על פי מאושר טיפול בעלי חיים מוסדיים ולהשתמש הוועדה (IACUC) הנחיות. הערה: שילוב של קטמין (100 מ"ג/ק"ג) ו xylazine (10 מ"ג/ק"ג) הרדמה במהירות ובאופן אמין משרה את רמת ההרדמה המתאימה במשך ההליך.</li>
	<li>להעריך את עומק ההרדמה לפני ו כל 15 דקות במהלך ההליך כפי שמעידים על ידי אובדן של רפלקס הדוושה.</li>
	<li>מקמו את העכבר על מצע כירורגי מחומם (איור 1א). ייצוב לסת והלסת התחתונה במצב פתוח באמצעות להקות אלסטיים והשען את הצוואר עם גליל כותנה כדי לשמור על לסת בכיוון אופקי יותר (איור 1B). מכסים את הגוף ואת הזנב של בעל החיים כדי לרכך את אובדן החום במהלך ההליך.</li>
	<li>מקמו את המיקרוסקופ הכירורגי על ההגדלה הרצויה והתאורה (אם לא רכוב ישירות על המיקרוסקופ) על חלל הפה עבור ויזואליזציה של שיניים. בעוד ההגדלה הרצויה היא תלוית המפעיל, הדמיה אופטימלית של חלל הפה מתקבל ב 16x.</li>
	<li>התקנת לתפור מ5-0 סטרילית משי קלועה סביב הראשון (M1) ושנית (M2) מקסלסת טוחנות בתוך חניכיים sulcus באמצעות מלקחיים קיסם. הערה: התפרים ממשי קלוע של מד קטן יותר ניתן להשתמש למטרה זו כדי להקל על התקנה מהירה יותר ולהפחית את האפשרות של נזק רקמות רכות רך.<ol>
<li>מקמו את הזנב המרוחק של התפר בצד החכי של השיניים והכניסו את הקטע הטוב ביותר בין המגע של M2 ו-M3 (איור 2א).</li>
		<li>לעטוף את התפר סביב משטח בוצ של M2 ולהכניס אותו בין המגע של M1 ו-M2. ודא כי שני הקצוות של תפר משכו היטב כדי לנהוג תפר לתוך חניכיים sulcus ולהסיר את כל המרווח (איור 2ב).</li>
		<li>לעטוף את מקטע תפר הטוב ביותר סביב M1, מתחת לגובהו של קונטור, ולהוסיף אותו בין המגע של M1 ו-M2. משוך את הזנב האבובי של תפר הדוק כדי לנהוג תפר לתוך חניכיים sulcus ולהסיר את כל המרווח (איור 2ג). הערה: אם ההתנגדות נצפתה בעת הכנסת תפר בין M1 ו-M2 או M2 ו-M3, איש הקשר עשוי להיות פתוח במקצת באמצעות שיניים סטנדרטיות אקספלורר.</li>
		<li>לקשור את קצות תפר עם קשר של מנתח לקצץ את זנבות קצר ככל האפשר. מניחים את הקשר בתוך החניכיים בטוח בין M1 ו-M2 בצד השני של שיניים מקסימום הלסת (איור 2ד). הערה: צעדים 1.4.1 – 1.4.4 ניתן לחזור על הצד השני, במידת הצורך.</li>
		<li>מחטא את כלי הניתוח בתוך מעקר הזכוכית החמה בין כל נושא בעל חיים. התראה: קצות המלקחיים חדים מאוד ויכולים בקלות לגרום לטראומה אוראלית ולדימום משמעותי. הכינו קטעים קטנים של גזה כדי להסיר דם מחלל הפה ולהפעיל לחץ על פצעים מדממים פעיל.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאחר התקנת ליגטורה, להסיר את העכבר ממנגנון כירורגי, מקום לכלוב נקי תחת מנורת חום לצג עד התאושש לחלוטין.</li>
	<li>הבית בנפרד כל עכבר עם העשרה הסביבה המתאימה ולאפשר גישה מודעות למים מסוננים ומחית האוכל רגיל בסביבה מבוקרת טמפרטורה ולחות (12-h אור/12-h מחזור כהה) במשך 7 – 11 ימים. הערה: מחית האוכל מקטינה את הכוחות הנדרשים להסטיק ובכך מפחיתה את הכאב הקשור להזנה, ומסייעת למנוע אובדן מוקדם של החיבור המותקן.</li>
</ol>2. אוסף דוגמאות
<ol><li>המתת חסד על פי ההנחיות המאושרות IACUC. הערה: המתת חסד אישית באמצעות תא CO2 ולאחריה פריקה צוואר הרחם היא השיטה המועדפת עבור פרוטוקול זה. הדבר עשוי להשתנות בהתאם לניסויים הדורשים קצירת רקמות נוספות.</li>
	<li>באמצעות הפיפטה, מיד לשטוף את חלל הפה עם 100 μL של עיקור 4 ° c מפוספז-מלוחים באגירה (PBS) ללא סידן ומגנזיום עבור 10 s.</li>
	<li>חזור על השלב 2.2 2x ולמקם כל אחד לשטוף 15 mL במבחנה אחת של פוליפרופילן בדיקה סטרילית.</li>
	<li>להעביר את התוכן למבחנה 50 mL של פוליפרופילן בדיקה סטרילית על-ידי הפעלת אותם באמצעות מסנן רשת הפעלה 40 של שינוי.</li>
	<li>העבר את התכנים הללו למבחנה חדשה של פוליפרופילן 5 מ ל במבחנה סטרילית. הערה: ההעברה הסופית של המדגם לצינורית קטנה יותר מאפשרת את ההדמיה המשופרת של הגלולה הסלולרית בשלבים הקרבים.<ol>
<li>אם תרצה, להסיר את הקשירה טוחנת (s) ומקום לתוך 300 μL של מעוקר 1x PBS (4 ° צ', ללא סידן ומגנזיום) ב 15 מ"ל שפופרת של פוליפרופילן בדיקה וסטרילי בנפרד. מתפרעים בעדינות ומסירים. את התפר מהצינור מדגם זה מטופל באופן זהה לדגימת השטיפה האוראלית מנקודה זו והלאה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הוסף 33.3 μL של 16% פאראפורמלדהיד (בתחתית) כדי להקל על קיבוע המדגם.</li>
	<li>וורטקס את הדגימות מיד. ומכאן על הקרח במשך 15 דקות</li>
	<li>ממלאים את הצינור כדי 15 mL עם PBS 1x כדי לדלל את המשחק, ואז צנטריפוגה ב 1000 x g ו 4 ° צ' עבור 5 דקות.</li>
	<li>מפני שהוא מאחר ומשהה את הגלולה ב-1 מ ל של מיון תאים המופעל באמצעות קרינה פלואורסצנטית (FACS) ב -4 ° c. ספירת תאים על מונה הומוציטוטומטר או תא אוטומטי.</li>
	<li>צנטריפוגה את המדגם שוב ב 1000 RCF ו 4 ° צ' עבור 5 דקות.</li>
	<li>מזף את supernatant ולהשעות את הגלולה בנפח מתאים של מאגר FACS עבור ריכוז סופי של 0.5 – 1.0 x 106 תאים/50 μl של מאגר facs.</li>
</ol>3. מכתים נוגדנים לניתוח ציטומטלי זרימה
הערה: סמן והכה את כל צינורות ה-FACS הנדרשים לפני השימוש.
<ol><li>הוסף 1 μL של סרום חולדה 2 μL של נוגדן IgG אנטי עכבר כדי 50 μL של המדגם, מערבולת מיד, ולחסום על קרח עבור 20 דקות.</li>
	<li>הוסף את הנוגדנים המתאימים לכל מדגם, מערבולת מיד, ו הדגירה על הקרח 30 דקות בחושך. הערה: בחירה וכמויות של נוגדנים תלויות בניסויים של טייס מיטוב מוקדם המותאמים לטכניקה ספציפית זו.</li>
	<li>שטוף דגימות עם 1 מ ל של מאגר FACS, vortexing בקצרה ותפרידו עבור 5 דקות ב 1000 x g ו 4 ° c. חזור על שלב 2x זה.</li>
	<li>השהה דגימות מחדש ב-250 μL של מאגר FACS, כיסוי צינורות עם סרט פרפין, עטוף ברדיד אלומיניום ומחזיק ב -4 ° צ' עד לניתוח. הערה: הוא אידיאלי לנתח דגימות תוך שעות של השלמת הפרוטוקול עקב אובדן של אות פלורסנט במשך פרקי זמן ארוכים של אחסון. עם זאת, ניתן לנתח דגימות 2 – 3 ימים לאחר מכן אם נדרש בהחלט.</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

האלמנט הקריטי ביותר המשויך לשימוש של מודל המושרה לקשירה murine של חניכיים ממורכז סביב שמירה של ליגטורה עד לזמן ההקרבה או הסרה מכוונת. החיבור המותקן-רגיש פרטים-הקשירה מסוגל לגרימת אובדן משמעותי של גובה העצם מכתשיים כמו 6 ימים, את בין 11 – 16 תקופת היום39. ההחלטה להקריב נושאי בעלי חיים לפני התקופה המקסימלית של אובדן העצם, עיבוד זה מודל קצר הרבה יותר של חניכיים המושרה לקשירה, נבחר כדי להקטין עוד יותר את השכיחות של לקשירה מוקדמת הנגרמת, מוגדר כאובדן הקשירה לפני זמן ההקרבה, אשר הופך את בעל החיים לא אבח...

מחלת חניכיים (PD) היא מחלה אוסטאופתית הקשורה בתחלואה מארח משמעותי ונטל כלכלי, אשר מתבטא על ידי דלקת חניכיים ואובדן של שתי מצורף רקמה רכה ו osseous תמיכה עבור שיניים מושפעות1,2,3,4. תהליך זה נשלט על ידי אינטראקציות בין מיקרוביוטה אוראלי לבין המערכת החיסונית הטבועה של המארח. הוא קשור גם עם החרפה של מחלות דלקתיות אחרות כולל סוכרת, מחלות לב וכלי דם, סרטן5,6,7,8. מבחינה היסטורית, זה היה שיערו כי הפתוגנזה המשטרה תלויה בכמויות גדולות של חיידקים ספציפיים כגון פוררומונס חניכיים מסוים9. עם זאת, ראיות שאירעו לאחרונה מצביעות על כך שרכיב החיידקים של המשטרה מתווך על-ידי השימוש בסוגי השיניים. הביוilm היא קהילה מאורגנת ומורכבת של מיקרואורגניזמים רבים, שיכולים להתקיים במצב שיתופי והרסני בלתי-מצבי10,11. המבנה האוראלי מעניק בדרך כלל עמידות למחשב המארח על ידי מניעת הקמתה של החיידק הפתוגניים ומקדם את מבנה רקמת חניכיים אידיאלי ותפקוד באמצעות רגולציה של התגובה החיסונית מארח12,13. רטבאליות של היחסים equilibrious בין אורגניזמים בתוך חלל הפה ואת המערכת החיסונית מארח עלול להוביל שינויים בהומאוסטזיס רקמות, וכתוצאה מכך ההתפתחות של הופעות המחקר הקליני והרדיוגרפיה של המשטרה5,10,12,13,14.
מעניין, הקמת הדיסקטאוזיס אוראלי, בעוד הנדרש ליזום של PD, אינו מספיק כדי לנהוג במשטרה בכל האנשים, הימנעות לקראת היכולת של התגובה החיסונית מארח לחתור במעבר של microbiota בין שיתופי ודיסביוטית מדינות15. זה מציב זרקור מסוים על האמצעים שבהם המשטרה משפיעה על אחד הדמויות המובילות של מערכת החיסון המולדת, כלומר הפולימיוולוייט (pmn), או נויטרופילים, מתוך פרספקטיבות מקומיות מערכתית16,17.
בבני אדם, PMNs מגויסים מהמחזור בקצב של ~ 2 x 106 תאים/h ברקמות החיבור חניכיים בריאים, שם הם האוכלוסייה הלוקוציט בעלת הדירוג. כאן, הם גורשו לאחר מכן מן החניכיים sulcus לתוך חלל אוראלי כרכיב של נוזל חניכיים crevicular. בנוכחות המשטרה, נויטרופילים מתבטא בתוך מחזור הדם וחלל הפה, שבו התאים האלה אפקטור להחזיק פנוטיפ היפרסטרומה שמוביל להרס הנ ל של החניכיים17,18,19,20,21,22. לכן, הבנת התפקיד של PMNs ב PD ומצבים דלקתיים אחרים מערכתית הוא בעל חשיבות עליונה.
למרות שהוא מקובל שמחלות כרוניות מקושרות באופן הדדי למשטרה, המנגנונים הבסיסיים עדיין לא הגיעו לידי בקשה, ותורמים לקשיים בניהול התנאים הללו והקטלניים. מספר מודלים בעלי חיים ניסיוניים, כל אחד עם יתרונות וחסרונות ייחודיים, כבר נוצל לחקור את הפתופסולוגיה של PD23,24. התמקדות ספציפית על דגמי murine, ישנם מגוון של פרוטוקולים שדרכם לימוד של PD הוא הקלה; עם זאת, הם בעלי מספר חסרונות טכניים ופיזיולוגיים25,26,27,28,29,30,31.
הראשון, gavage אוראלי מודל העכבר דורש רבים אוראלי החיסונים של פתוגנים חניכיים אנושיים כדי ליצור דלקת חניכיים ואובדן העצם. בנוסף, הוא בדרך כלל לפניו על ידי תקופה של טיפול אנטיביוטי כדי לחתור תחת המודר מורלין פלורה אוראלי25. מודל זה דורש לעתים קרובות הכשרה מיוחדת לבצע בבטחה את gavage אוראלי, משתמשת רק חלק קטן של פתוגנים חניכיים מתוך microbiome האנושית מורכבים יותר, ודורש מספר חודשים כדי ליצור אובדן העצם מכתשיים.
לעומת זאת, המושרה כימית מודלים murine לנצל את מסירת אוראלי של חומצה sulfonic בנזן (TNBS) או הנתרן דטרן סולפט (DSS), סוכני בשימוש נפוץ בהקמת מודלים murine של קוליטיס על פני תקופה של מספר חודשים כדי לגרום לאובדן העצם חניכיים26. מודלים מבוססי פנים וחוץ לפנים הינם זמינים, אשר כרוכים בחותכות murine ורקמות של dorsum, כמו גם calvarium, בהתאמה. במודל מורסה לשעבר, כמה זריקות של חיידקים מנוהלים, יצירת אבצס חניכיים מרובים ומחסור של אובדן העצם מכתשיים, הגבלת השימוש שלהם במחקר של PD. הדגמים האחרונים מורסה מתאים יותר באופן משמעותי כדי ללמוד התקפה בקטריאלי, דלקת, וספיגת עצם באתרים מחוץ לחלל הפה, אשר מבטלת את ההערכה של החניכיים ומיקרובידום בעל פה27,28,29,30,31.
באמצעות מודל המושרה לקשירה של חניכיים, תפר ממשי קלוע הותקנה בדרך כלל סביב הטוחנת השנייה. כחלופה, מקטע ליניארי אחד של חומר תפר ניתן להוסיף בין הראשון והשני טוחנות32,33. המטרה של מיקום לקשירה היא להקל על הצטברות חיידקים וליצור דיסביוזיס בתוך חניכיים sulci, וכתוצאה מכך דלקת חניכיים והשמדת הרקמות ההלחנה של החניכיים. בעיקר, מודל זה מסוגל לייצר משמעותית יותר מכתשיים אובדן העצם בהשוואה לgavage הנפוץ יותר בשימוש אוראלי דגם34. עוד מסבך את השימוש במודל gavage אוראלי הוא ההתנגדות הטבעית על ידי מספר זנים של עכברים (כלומר, C57BL/6) כדי לפתח אובדן העצם מכתשיים. זה גם בעייתי, כמו זן זה הוא הנפוץ ביותר בתחום מחקר בעלי חיים מבוסס מורלין35.
הליכים קיימים המתוארים על-ידי מרצ ואח ' ואייב והאג שנגלי המציאו כדי לפשט את הפעולה הטכנית של הצבת ליגטורה33,36. למרבה הצער, הפרוטוקול לשעבר דורש מיוחדות 3D ציוד מודפס, בעלי פוטנציאל אובדן לקשירה מוקדמת, ובכך להגדיל את השימוש בעלי חיים ואת העלויות הקשורות בזמן נוסף שהושקע בחדר הניתוח. יתר על כן, שני הפרוטוקולים מייצרים רק אזורים קטנים של החניכיים החולים זמין למחקר.
היתרונות הטמונים בטכניקה זו מבוססים על מחקר סימולטני של ביוביוזיס ואימונולוגיה ששולטים על החניכיים, ניצול של בעלי חיים בעלי עלות נמוכה עם רקעים גנטיים מגוונים, ושיטות דיור פשוטות ובעלי גידול. ככאלה, על המטרות להיות מגדילים את הכרכים של הרקמה החולה, ובניסיונות לתרגל את עקרונות הירידה במחקר בעלי חיים, לצמצם את צריכת החיות לרמה נמוכה ככל האפשר. זה דורש להבטיח כי כל בעלי החיים מסוגלים להיכלל בניתוח ניסיוני37. עם זאת, יש לציין כי לא משנה איזה מודל בעלי חיים של מחלת חניכיים מנוצל, אין מודל יחיד המקיף את כל האלמנט של משטרת האנושות pathפסיולוגיה.
פרוטוקול חדש זה מפעיל את המיקום של ליגטורה סביב שיניים מרובות מקסימום הלסת הטוחנת באמצעות מיכשור וחומרים שנמצאים ברוב המעבדות. זה מאפשר כמות מספקת של זמן בקלות ובביטחון להתקין ליגטורה כי סביר avulse בטרם עת. בסופו של דבר, כמו PMNs לבצע את ההרס של החניכיים במשטרה, מתודולוגיה הרומן לשחזר נויטרופילים אוראלי באופן אנלוגי לבני אדם מוצג גם.

<table><tbody><tr><td>נגד עכבר F4/80 נוגדן</td><td>BioLegend</td><td>123131</td><td>BV421, שיבוט BM8</td></tr><tr><td>נגד עכבר Ly6G נוגדן</td><td>BD</td><td>560602</td><td>PerCP-CY5.5, שיבוט 1A8</td></tr><tr><td>C57BL/6 עכברים זכרים</td><td>צ'ארלס ריבר</td><td></td><td>8 עד 12 שבועות</td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה חרוטי</td><td>FroggaBio</td><td>TB15-500</td><td>15 מ"ל</td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה חרוטי</td><td>FroggaBio</td><td>TB50-500</td><td>50 מ"ל</td></tr><tr><td>FACS Buffer</td><td>מרובה</td><td></td><td>1% BSA (BioShop), 2mM EDTA (Merck), 1x HBSS-/- (Gibco)</td></tr><tr><td>FACSDiva</td><td>BD</td><td></td><td>v8.0.1</td></tr><tr><td>Fibre-Lite</td><td>Dolan-Jenner</td><td></td><td>דגם 180</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>Tree Star</td><td></td><td>v10.0.8r1</td></tr><tr><td>משאבת טיפול בחום</td><td>Hallowell</td><td></td><td>HTP-1500</td></tr><tr><td>מעקר חרוזי זכוכית חמה</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>66118-10</td><td>נביטה 500</td></tr><tr><td>מספריים קשתית</td><td>Almedic</td><td>7602-A8-684</td><td></td></tr><tr><td>ישר קטמין</td><td>וטוקינול</td><td></td><td>100 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>LSRFortessa</td><td>BD</td><td></td><td>X-20</td></tr><tr><td>סרום עכבר</td><td>Sigma</td><td>M5905-5ML</td><td></td></tr><tr><td>מסנן רשת ניילון</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>22-363-547</td><td>40 & מיקרו; m</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>28908</td><td>16% (w/v), ללא מתנול</td></tr> ללא <tr><td>פוספט חוצץ</td><td>מלח Sigma</td><td>D1408-500ML</td><td>ללא CaCl2 ו-MgCl2, 10x</td></tr><tr><td>מזרקים חד פעמיים מפלסטיק</td><td>BD</td><td>309659</td><td>1 מ"ל</td></tr><tr><td>סרום חולדה</td><td>Sigma</td><td>R9759-5ML</td><td></td></tr><tr><td>תפר משי</td><td>Covidien</td><td>SS652</td><td>C13 USP 5-0</td></tr><tr><td>מלקחיים רסיסים</td><td>אלמדיק</td><td>7726-A10-700</td><td>#1</td></tr><tr><td>מלקחיים רסיסים</td><td>אלמדיק</td><td>7727-A10-704</td><td>#5</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ ניתוח סטריאו</td><td>Carl Zeiss</td><td>28865</td><td>Photo-Zusatz</td></tr><tr><td>מחט היפודמית סטרילית</td><td>BD</td><td>305111</td><td>26G X 1/2</td></tr> <tr><td>אינץ' מזרק</td><td>BD</td><td>309659</td><td>1 מ"ל</td></tr><tr><td>קסילזין</td><td>רומפון</td><td></td><td>20 מ"ג/מ"ל</td></tr></tbody></table>

מודל חזק המושרה לקשירה של חניכיים murine להערכת הנויטרופילים אוראלי

Robust Ligature-Induced Model of Murine Periodontitis for the Evaluation of Oral Neutrophils

היתרונות העיקריים של לימוד פתופסולוגיה של מחלת חניכיים ניצול מודלים murine הם עלות מופחתת של בעלי חיים, מערך של זנים מהונדסים גנטית, המספר המכריע של ניתוחים שניתן לבצע על שנקטפו ברקמות רכות וקשות. עם זאת, רבות ממערכות אלה כפופות לביקורות פרוצדורליות. כחלופה, המודל המושרה לקשירה של מחלת חניכיים, מונע על ידי פיתוח ושמירה של מיקרובידום אוראלי בלתי מהימן, יכול להיות מועסק, אשר המושרה במהירות ואמין יחסית. למרבה הצער, הווריאציות של פרוטוקול חניכיים murine הנגרמת לקשירה מבודדים לאזורים מוקד של החניכיים ובכפוף לציון בטרם עת של החיבור המותקן. זה ממזער את כמות הרקמה הזמינה לניתוחים הבאים ומגבירה את מספר בעלי החיים הנדרשים למחקר. פרוטוקול זה מתאר את המניפולציות המדויקות הדרושות כדי למקם ליגטורות טוחנת מורחבת עם שמירה ושימוש משופר של טכניקת לשטוף רומן לשחזר נויטרופילים אוראלי בעכברים עם גישה חלופית המשקל את השערים לעיל אתגרים טכניים.

זרם הנציג cy, לנסות נתונים מדגימות לשטוף אוראלי של נאיבי (איור 3a) ו מודלק (איור 3ב) חלל הפה מוריין משני המושרה לקשירה חניכיים מסופקים. התאוששות של PMNs מתוך ליגטורה מותקן הפגינו גם (איור 3ג). זרם cytometer ערוץ המתח מכויל באופן ידני, ואת הפיצויים בוצע עם חרוזים בעלי פיצוי חד מוכתם. PMNs הוגדרו כ-Ly6G+ veF4/80-ve באמצעות מיתאר האסטרטגיה38</sup...

מאמר זה מציג פרוטוקול להקמת מודל המושרה לקשירה של חניכיים מורטין מעורבים טוחנות הלסת הכפולה מרובים, וכתוצאה מכך אזורים גדולים יותר של רקמת חניכיים מעורב ועצם עבור ניתוח עוקבות, כמו גם השימוש מופחת בעלי חיים. טכניקה להערכת נויטרופילים אוראלי באופן אנלוגי לנושאים אנושיים מתואר גם.

מודל חזק המושרה לקשירה של חניכיים Murine להערכת הנויטרופילים אוראלי

The main advantages of studying the pathophysiology of periodontal disease utilizing murine models are the reduced cost of animals, array of genetically ...

הפרוטוקול המתואר כאן מספק לחוקרים שיטה לחקור נויטרופילים אוראליים בתוך מודל בעלי חיים הנגרמת על ידי קשירה של מחלת חניכיים באופן מקביל למשתתפים אנושיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו מודגש על ידי נפח מוגבר של רקמות חניכיים מודלק זמין לניתוח הבא, אשר מפחית את השימוש בבעלי חיים. היכולת שלנו לאחזר את הקשירה מצופה הביופילם מסביב לשיניים מאפשרת סימולציה של טיפול יעיל במחלת חניכיים מקומית.השימוש במודל זה יכול להיות מיושם בחקר ההשפעות המערכתיות של חניכיים במודל של בעלי חיים, בשל האזורים המוגברים של רקמות חניכיים מודלק. היכרות עם השימוש במכשירים מיקרוכירורגיים ומיקרוסקופים ניתוח, כמו גם קשירת קשרים של מנתח לפני הטיפול בנושאים בעלי חיים חיים, מומלץ מאוד. הדגמה חזותית של טכניקה זו היא קריטית בהפחתת אורך עקומת הלמידה הנדרשת להשגת מיקום קשירה מיומן.מדגים את ההליך יהיה ג'ף צ'דוויג, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. התחל על ידי מיקום העכבר על פלטפורמה כירורגית מחוממת. לאחר הבטחת כי העכבר הוא הרדמה כראוי, לייצב את maxilla ו mandible במצב פתוח באמצעות להקות אלסטיות.אביזר הצוואר עם גליל כותנה כדי לשמור על maxilla במצב אופקי לכסות את הגוף והזנב כדי למתן את אובדן החום. מקם את המיקרוסקופ הכירורגי בהגדלה הרצויה ותאורה על חלל הפה. השתמש מלקחיים רסיס להתקין תפר משי סטרילי 50 או קטן יותר קלוע סביב M1 ו M2 טוחנות maxillary בתוך סולקוס חניכיים.מקם את הזנב הדיסטלי של התפר בצד הפאלאטלי של הנדנון והכנס את המקטע הפרוקסימלי בין מגע של M2 ו- M3. לאחר מכן, לעטוף אותו סביב פני השטח buccal של M2 ולהכניס אותו בין המגע של M1 ו M2. ודא כי שני הקצוות של התפר נמשכים בחוזקה כדי להסיע אותו אל גופרית חניכיים. לעטוף את קטע תפר proximal סביב M1 מתחת לגובה קווי המתאר שלה ולהכניס אותו בין המגע של M1 ו M2. משוך את הזנב הפרוקסימלי של התפר בחוזקה כדי להסיר את כל הרפוי. לקשור את הקצוות של התפר עם קשר של מנתח לקצץ את הזנבות כמו סוג ככל האפשר.מניחים את הקשר במעיל החניך בין M1 ו- M2 בצד הפאלטלי של ההתמזגות המקסיאלית. זה קריטי כי הקשר המשמש לאבטחת הקשירה הוא מאובטח ובמיקום שבו זה לא ירגיז את החיה או להפריע mastication. לאחר התקנת הקשירה, מוציאים את העכבר מהמתקן הכירורגי ומ מניחים אותו בכלוב נקי מתחת למנורת חום, ומוודאים לנטר אותו עד להחזרה מלאה.מעקרים את המכשירים הכירורגיים בחיטוי חמוזי הזכוכית החמה בין כל נושא של בעלי חיים. בנפרד בית כל עכבר עם העשרה סביבתית מתאימה ולאפשר גישה לליביטום מודעה למים מסוננים ו chow סטנדרטי מחית בסביבה מבוקרת טמפרטורה ולחות במשך שבעה עד 11 ימים. כאשר מוכן לאסוף דגימות, להשתמש פיפטה לשטוף את חלל הפה עם 100 microliters של PBS ארבע מעלות מעוקרים ללא סידן ומגנזיום במשך 10 שניות.חזור על שטיפה פעמיים נוספות, הצבת כל לשטוף לתוך אותו 15 מיליליטר חרוט סטרילי מבחנה עבור כל בעל חיים. הפעל את התוכן של כל צינור 15 מיליליטר דרך מסנן רשת ניילון 40 מיקרומטר לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר, ולהעביר את הסינון לתוך מבחנה חדשה 15 מיליליטר. הוסף 33.3 מיקרוליטרים של 16% paraformaldehyde כדי להקל על קיבעון מדגם.מערבולת הדגימות מיד להדגירה אותם על קרח במשך 15 דקות. Paraformaldehyde הוא reagent המסוכן ביותר המועסקים בפרוטוקול ויש לטפל עם ציוד המגן האישי המומלץ מומלץ על ידי היצרן. לאחר הדגירה, למלא את הצינור ל 15 מיליליטר עם PBS ואז צנטריפוגה זה ב 1000xg וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.שאפו את העל-טבעי, השהו מחדש את גלולת הכדור במיליליטר אחד של חיץ FACS בארבע מעלות צלזיוס וספירת התאים על מד חמוציטר או מונה תאים אוטומטי. חזור על הצנטריפוגה ושאוף את העל-טבעי. לאחר מכן, להשעות מחדש את גלולת התא בנפח המתאים של מאגר FACS עבור ריכוז סופי של 500, 000 כדי 1 מיליון תאים לכל 50 microliters של מאגר FACS ולהעביר את התאים לצינור FACS.הוסף מיקרוליטר אחד של סרום עכברים ושני מיקרוליטרים של נוגדן IGG נגד עכברים ל-50 מיקרוליטרים של הדגימה. Vortex המדגם באופן מיידי לחסום אותו על קרח במשך 20 דקות. לאחר מכן, מוסיפים את הנוגדנים המתאימים לכל דגימה.וורטקס ודגירה על קרח במשך 30 דקות בחושך. לאחר הדגירה, לשטוף את הדגימות עם מיליליטר אחד של חיץ FACS, מערבולת לזמן קצר, צנטריפוגה במשך חמש דקות ב 1000xg וארבע מעלות צלזיוס. השלך את העל-טבעי וחסום בעדינות את פתיחת צינור FACS.חזור על הכביסה פעמיים ולאחר מכן השהה מחדש את הדגימות ב- 250 מיקרוליטרים של מאגר FACS לאחסון. מכסים את הצינורות בסרט פרפין, עוטפים אותם בנייר אלומיניום, ומאחסנים אותם בארבע מעלות צלזיוס עד שהם מוכנים לניתוח. ציטומטריית זרימה שימשה לניתוח נויטרופילים שנמצאו משטיפה אוראלית מעכבר נאיבי, כמו גם שטיפה אוראלית וקישורה התאוששה מעכבר עם דלקת מחזור הנגרמת על ידי קשירה.כדי להעריך את אובדן עצם מכת המים, רמות העצם מכתב נמדדו מן סמל העצם מכתב אל צומת cementoenamel עבור עכברים בריאים קשירה. לאחר מכן, חושבו הבדלי המדידה. אמנם לא נבדק כאן, היסטופתולוגית, אימונוהיסטוכימית, והערכה מורפומטרית של מחזור ועצם מכתשית יכול להתבצע גם בהתאם לשאלת המחקר.מודל זה נמצא כעת בשימוש במעבדה שלי כדי לחקור את ההשפעות של המערכת החיסונית המולדת אוראלי על בריאות מערכתית ומחלות.

robust-ligature-induced-model-murine-periodontitis-for-evaluation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מודלים של בעלי החיים הוכיחו להיות כלי רב ערך בהגדרת מנגנונים ספציפיים מארח ופתוגן שתורמים להתפתחות של דלקת כרונית. כאן אנו מתארים מודל עכבר של זיהום אוראלי עם הפתוגן האנושי Porphyromonas gingivalis ומתודולוגיות פרט כדי להעריך את ההתקדמות של דלקת באתרים מקומיים ומערכתיים.

מודל של עכברים של דלקת כרונית הנגרם על ידי פתוגן באתרים מקומיים ומערכתיים

במחקר זה, מודל חולדה של השראת דלקת חניכיים מוצג באמצעות שילוב של ליגטורה חוזרת וזריקות חוזרות ונשנות של ליפופוליסכריד שמקורו בפורפירומונס חניכיים, במשך 14 יום סביב הטוחנות המקסילריות הראשונות. טכניקות הקשירה וההזרקה LPS היו יעילות בגרימת דלקת פרידונטיקה, וכתוצאה מכך אובדן עצם מכתשית ודלקת.

השראת דלקת חניכיים באמצעות שילוב של ליגטורה והזרקת ליפופוליסכריד במודל חולדה

זהו דו"ח על מודל ניסיוני של peri-implantitis המושרה על ידי ליגטורה בעכברים. אנו מתארים את כל השלבים הכירורגיים, החל מניהול לפני ואחרי הניתוח של בעלי החיים, עקירות, מיקום שתלים ודלקת פרי-אימפלנטיטיס הנגרמת על ידי ליגטורות.

מודל ניסיוני של פרי-אימפלנטיטיס הנגרמת על ידי ליגטורה בעכברים

מחקר זה מתאר שיטת קשירת ניילון 6-0 שונה להשראת דלקת חניכיים בעכברים, הניתנת לשחזור מאוד ומהווה אלטרנטיבה לחוקרים לחקור מחלות חניכיים מהתפתחותה ועד לתוצאותיה הפתולוגיות.

מודל עכברי של דלקת חניכיים מתקדמת הנגרמת על ידי קשירת ניילון בטוחנות העליונות השנייה

בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את התהליך של הפעלת-CD40 והרחבה של תאים B Murine מ splenocytes של C57BL / 6 עכברים, אשר יכול לשמש תא מודל אנטיגן מציג (APC) ללמוד אינדוקציה של חסינות.

דגם Murine של הפעלת-CD40 בתאי B

Biofilms נוצר על משטחי השן הם מורכבים מאוד חשוף מתמיד אתגרים סביבתיים מולד אקסוגניים, אשר לווסת את הארכיטקטורה שלהם, פיזיולוגיה transcriptome. פיתחנו ארגז הכלים לבחון את הרכב, ארגון מבניים ביטוי גנים של biofilms דרך הפה, אשר ניתן להתאים בתחומים אחרים של מחקר biofilm.

כלי אנליטי תיבת להערכת ביוכימיים, מבנית Transcriptome מקיף של Biofilms אוראלי בתיווך Mutans streptococci

פרוטוקול זה מתאר בדיקת qRT-PCR בעלת תפוקה גבוהה לניתוח חתימות ביטוי IFN מסוג I ו-III. הבדיקה מפלה הבדלים בזוגות בסיסים בודדים בין התעתיקים הדומים מאוד של גנים אלה. באמצעות הרכבת אצווה ופיפטינג רובוטי, הבדיקות עקביות וניתנות לשחזור.

תפוקה גבוהה בזמן אמת כמותי RT-PCR Assay לקביעת פרופילי ביטוי של סוגי I ו- III תת סוגי אינטרפרון

הפרוטוקול מתאר נלוקסון דג זברה למבוגרים עם ביולוגי; לאחר מכן לנתח, הכנת המעי עבור cytometry, מיקרוסקופיה קונפוקלית ו- qPCR. שיטה זו מאפשרת ניהול של תרכובות ביו לעקוב אחר ספיגת מעיים ואת הגירוי המערכת החיסונית המקומית עורר. זה רלוונטי לבדיקה את הדינמיקה מעיים של אמצעי מניעה שבעל-פה.

צנרור שבעל-פה של דג זברה למבוגרים: מודל להערכת ספיגת מעיים של תרכובות ביו

כאן אנו מספקים נתונים היסטוריים פרוטוקולים עבור המינהל אנטיביוטיקה דרך הפה עכברים, איסוף דגימות צואה, הפקת דנ א, כימות של צואה חיידקים על ידי qPCR.

פולימראז כמותי המבוסס על תגובת שרשרת ניתוחים של מאתר Microbiota מעיים לאחר טיפול אנטיביוטי דרך הפה

כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור מודל הניהול אוראלי בעזרת הזחלים mellonella גלריה (galleria) , כיצד לאפיין המושרה תגובות מערכת החיסון המולדת. באמצעות פרוטוקול זה, חוקרים ללא ניסיון מעשי תהיה אפשרות להשתמש mellonella ג שיטת פיטום.

גלרייה mellonella מודל הניהול אוראלי את תגובות מערכת החיסון מולדים Study Commensal-Induced

למדו מודל קשירה מושרה לחניכיים Murine להערכת נויטרופילים אוראליים בדלקת חניכיים. שיטה זו מגדילה את נפח הרקמות הדלקתיות ומפחיתה שימוש בבעלי חיים.

מודל חזק המושרה לקשירה של חניכיים Murine להערכת הנויטרופילים אוראלי

גלה סרטונים נוספים