שימוש במיקרוסקופיה של כוח אטומי למדידת תכונות מכניות ולחץ טורגור של תאים צמחיים ורקמות צמחים

תכונות מכניות של תאי צמחים חיוניות שיש לקחת בחשבון כאשר מנסים להבין מנגנונים שבבסיס הפיתוח. מיקרוסקופ כוח אטומי יכול לשמש כדי למדוד תכונות אלה, ולעקוב אחר הדרך בה הם משנים, בין איברים, רקמות, כל השלבים ההתפתחותיים. היתרונות העיקריים של טכניקה זו, היא כי זה לא פולשני, זה מהיר יחסית וזה לא דורש טיפול אז זה יכול להיות מיושם ישירות על דגימות חיות.

עבור מישהו חדש בהליך זה, סעיף cis של המדגם הוא קריטי באמת, כדי לוודא כי באמת יש לך קיבעון מכני תקין של המדגם. הדגמה חזותית של הליך זה, היא קריטית כדי להבין טוב יותר את המורכבות של קיבעון מדגם, בקרת איכות של פוסטרים הגדרת מדידה. הדגימה של ההליך תהיה סימון בוביו, מהנדסת ויוכן לונג, פוסט דוקטורט במעבדה שלי.

כדי להתחיל, מניחים חתיכת סרט הדבקה דו צדדי במרכז צלחת פטרי בקוטר חמישה סנטימטרים. הוסף דגימה של ג'נסיום שבודדה מניצן פרחים לקלטת. מוסיפים במהירות מים לצלחת עד שהדגימה מכוסה לחלוטין כדי למנוע התייבשות.

לאחר מכן, מניחים את המדגם על שלב AFM ומזיזים את הראש כך שהוא מעל המדגם. לאחר כייל את cantilever, בתוכנה, להבטיח כי המערכת היא במצב QI, וגישה המדגם עם כוח נקודה מוגדרת של חמישה עשר ננו ניוטון. לאחר מכן, הגדר אורך Z של ארבעה מיקרון והגדר את אזור הסריקה ל-שמונים על שמונים מיקרון בריבוע עם מספר הפיקסלים שנקבע לארבעים על ארבעים.

לאחר מכן עבור אל לוח הגדרות ההדמיה המתקדם והגדר את המצב למהירות קבועה. בנוסף, להגדיר להאריך להאריך להאריך את מהירויות המסלול למאתיים מיקרון לשנייה, ואת קצב המדגם לעשרים וחמישה קילו הרץ. לאחר הגדרת הפרמטרים, העבר את הטיפ לאזור העניין בדגימה.

ודא שהאזור שיש לסרוק נקי מפסולת, אתר אזור שטוח ככל האפשר, ועסוק, ולאחר מכן התחל את הסריקה ולהשתמש בסריקת הכוח הנמוך המהירה כדי לבדוק אם המדגם זז. לאחר אזור עניין כפי שנמצא, בחר אזור ארבעים על ארבעים עד שישים על שישים מיקרון בריבוע, והגדל את מספר הפיקסל לשני פיקסלים למיקרון. לאחר מכן, להגדיל את הנקודה שנקבעה לחמש מאות ננו ניוטון, כדי לקבל חריץ של מאה עד מאתיים ננו מטרים.

הקטן את אורך ה- Z לשני מיקרון, והרחב את מהירויות דרכי הכניסה למאה מיקרון לשנייה, ולאחר מכן הגדל את קצב הדגימה לחמישים קילוהרץ והתחל לסרוק את הדגימה. בסיום, שמור את הפלט הן כתמונה והן כקובץ נתונים. פתח את תוכנת עיבוד הנתונים וטען את קובץ הנתונים.

לחץ על השימוש במפה זו ללחצן עיבוד אצווה כדי להשתמש באותם פרמטרים על כל עקומות המפה, ולאחר מכן עבור לטעון תהליך מוגדר מראש ובחר הרץ להתאים. לאחר מכן, עבור לפעולת קו בסיס הניתנת להחלפה והגדר חיסור להיסט פלוס הטיה, ו- X min בין ארבעים ל-שישים אחוזים. בכרטיסיה מיקום תיאור אנכי, בחר במצב חלק הדוק, אם אתה מעדיף לעבוד על נתונים גולמיים.

כדי לבחור את דגם מתאים, עבור אל לשונית התאמה גמישות, ובחר אחת האפשרויות בהתבסס על חוזק ההיתוך הצפוי. אם אין הידבקות או הידבקות חלשה, לאחר מכן להשתמש בעקומת הגישה ומעדיפים להשתמש במודל הרץ isnader. במקרה של הידבקות חזקה יותר, השתמש במודל של Dergen Milia Dortoprov או DMD ולעבוד על עקומה מפגרת.

כעת הגדר את הפרמטרים הגיאומטריים של הקצה בהתבסס על צורת קצה נומינלי. הקצה המשמש בניסוי זה הוא קצה כדורי, עם רדיוס של 400 ננומטר. לאחר מכן, הגדר את יחס פואסון ל- 0.5 ובחר עקומות הזזה.

הוסף שגרת התאמה גמישות שנייה, על ידי לחיצה על הסמל ליד החלון הראשי, וחזור על אותן הגדרות פרמטר. לבסוף, ציין את הכניסה הרצויה ב- X min ולאחר מכן שמור והחל על הכל כדי לחזור על השלבים הקודמים בכל עקומות המפה. שמור את התוצאות כדי להשיג תמונה בקובץ tsv נקודה.

כדי למדוד עם שינויים בפתרון מהיר, הר מדגם בצלחת פטרי, מחזיק חתיכה קטנה של מסטיק דבק. לאטום במהירות את הפער בין המסטיק לבסיס המדגם עם דבק תואם ביולוגית. המתן עד שהדבק יתמצק ולאחר מכן הטביע את המדגם במדיום תרבות איפקס נוזלי, המכיל 0.1 אחוז תערובת שימור צמחים.

לאחר כיול המערכת, פתח את תוכנת הרכישה ועבור תחילה לחלון פרמטר הסימון. שם קבע את קבוע האביב ל קבוע האביב המיוצר של cantilever או קבוע האביב הנחוש. לאחר מכן, הגדר את רדיוס הקצה ל-400 ננומטר, את יחס הפואסון לדוגמה ל-0.5, את קו הדגימה למאה ועשרים ושמונה כדי להבטיח רכישה מהירה, את קצב הסריקה ל-0.2 הרץ ואת גודל הסריקה למיקרון אחד.

לאחר מכן עבור לחלון הרמפה והגדר את גודל הרמפה לחמישה מיקרון, את סף הטריגונומטריה למקסימום, ואת מספר הדגימות לארבעת אלפים שש מאות ושמונה. עם כל הפרמטרים להגדיר, בזהירות לגשת לדוגמה באופן ידני. כאשר החללית קרובה יחסית למשטח המדגם, לחץ על התקרבות.

במגע, הגדל בהדרגה את גודל הסריקה ושנה את קצב הסריקה, עד לקבלת איזון רצוי מבלי לפגוע בדגימה או בקצה. הקם מחדש את הסריקה אם אזור המדידה אינו רצוי. כאשר מרוצה, לחץ על הכפתור, הצבע ולירות, כדי ליזום את הנקודה ולירות חלון.

ציין ספריית שמירה ושם קובץ. לאחר מכן לחץ על רמפה בסריקה הבאה כדי ליזום הקלטה. לאחר השלמת הסריקה, ממשק התוכנה יפנה מחדש לחלון הרמפה.

לחץ על התמונה הסרוקה כדי לציין את המיקומים כדי להסיט פנימה. בחר לפחות שלושה מראות כניסה לכל תא ליד מרכז פירות היער שלו, הגדר אותו כך שיחזור על הכניסה שלוש פעמים בכל צד ולאחר מכן לחץ על שיפוע ולכידה. בתוכנת הניתוח, לפתוח את קובץ MCA נקודה, זה מראה את המיקום של כל עקומת כוח על התמונה הסרוקה.

ואז לפתוח עקומת כוח אחת כדי לנתח. לחץ על לחצן תיקון קו הבסיס וגרור את קווי המקף הכחולים בעקומות הכוח, עד להרחבת נקודת ההתחלה של קו הבסיס המשמש כמקור ולהרחבת עצירת קו הבסיס המשמש כמקור, או ב- 0 אחוזים ו- 80 אחוזים בהתאמה. לאחר מכן לחץ על ביצוע.

לאחר מכן לחצו על לחצן מסנן המכונית של התיבה ולחצו על הלחצן 'בצע' כדי להחליק את עקומת הכוח. לאחר מכן לחץ על לחצן הכניסה. בחלון הקלט, הגדר את העקומה הפעילה כך שתרחיב, את השיטה החמישית לדגם ליניארי, את גבול התאמה הכוח המרבי ל- 99 אחוזים, את גבול התאם של הכוח הטחון ל- 75 אחוזים ואת מודל מתאים לנוקשות.

נתח את עקומות הכוח באצווה. כדי לבצע זאת, לחץ על לחצן היסטוריית הפעלה, ציין ספריית דוח והוסף עקומות כוח אחרות הדורשות טיפול זהה. לאחר שתסיים, לחץ על הפעל.

כאשר הערך עבור K מצויד באצווה, לחץ על היסטוריה ולעבור לחמש כניסות כדי לחזור לחלון הכניסה. ברגע שיש, לשנות את כוח מקסימלי להתאים גבול לעשרה אחוזים וכוח דקה להתאים גבול לאחוז אחד. ואז להגדיר את המודל בכושר להרציאן.

לאחר מכן, פתח את הקובץ המתאים כדי להציג את הערוצים הסרוקים השונים. בחלון ערוץ גבוה, לחץ על כפתור המקטע. זה יאפשר את המדידה של עקמומיות משטח מדגם הנדרש עבור ניכוי לחץ טורגור.

לאחר מכן צייר קו לאורך הציר הארוך של תא אחד, הזז את גבולות קו המקף אל קצות התא והתזמן את ערך הרדיוס. לבסוף בצע בפרוטוקול הטקסט, כדי לחשב את מודולוס של הצעיר הממוצע, קבוע האביב, E, K, ואת הלחץ טורגור עבור כל תא. התמונה משמאל היא מפה של המודולוס של הצעירים, המתקבלת על ידי ניתוח כל הכניסה עד לנקודת הגדרת הכוח המוגדרת על ידי המשתמש בעוד התמונה מימין, מראה את התוצאה של ניתוח מאה ננו מטרים הראשונים של הכניסה.

כאן, שתי המפות נראות דומות מאוד עם זאת, הווריאציה של עומק הכניסה יכולה להוביל במקרים מסוימים כדי להדגיש טוב יותר את ההטרוגניות לדוגמה, אשר יכול להיות מועיל לזיהוי המיקום או לספק מידע על ההתנהגות של מבנים פנימיים. עבור כל נקודה במפות אלה, קיימת עקומת כוח המשמשת כבסיס. העקומה המוצגת כאן, יש שתי השפעות שכדאי להזכיר.

קודם כל, אם חלק הגישה של עקומת הכוח מסתיים בחמש מאות ננו ניוטון. תנועת הקצה כלפי מטה ממשיכה. כלומר, הכוח הסופי שהוחל על-ידי הקצה גבוה מהצפוי.

הדבר השני שיש לשים לב אליו, הוא הגל בעקומות הנסיגה המודגשות על ידי האליפסה. נפנוף כזה יכול להיות אינדיקטור של מדגם נע או רוטט תחת הפעולה של הקצה ואת המעבר לשיטת קיבוע שונה עשוי להידרש. באמצעות ההליך המתועד במאמר זה, ניתן לאחזר את כל הפרמטרים העיקריים עבור ניכוי לחץ טורגור למעט עובי קיר התא מסריקות AFM וכניסות.

עקומת הכוח של חריץ עמוק בעמדת הצלב האדום מתארת את המודולוס של קיר התא הצעיר ואת הנוקשות לכאורה של המדגם במשטרים שונים של העקומה. קיבעון לדוגמה הוא קריטי. במהלך תהליך המדידה, לשים לב סימנים של חוסר יציבות מדגם.

בחרו בקפידה אזור עם משטח שטוח כדי להבטיח כניסה ניצבת. בעקבות הליך זה, ניתן לפקח על תכונות מכניות לאורך זמן ותנאים שונים. אפשר גם כיסוי מדידות מכניות עם תמונות confocal למחקרים קוטלטיביים.

טכניקה זו סוללת את הדרך לחיבור ביומכניקה עם התפתחות הפיזיולוגיה ותהליכים ביולוגיים אחרים.