פלטפורמת מיקרופלואידיג לעירור כונדרוציטים עם דחיסה דינמית

זה מופעל pneumatically התקן דחיסה microfluidic ניתן להשתמש כדי ללמוד mechanobiology בתרבויות הידרוג'ל 3D של chondrocytes צלחת צמיחה. המכשיר microfluidic הוא עלות זמן יעיל כי זה יכול בו זמנית לייצר סדרי גודל מרובים של דחיסה על כמויות קטנות של דגימות, הדמיות מיקרוסקופיות שונות ניתן להחיל עם המכשיר. השיטה שלנו יכולה להיות מיושמת גם על חקר mechanobiology של סוגי תאים אחרים.

כדי להגדיר את שכבת המיקרו-ערוצים, ערבב תחילה PDMS עם יחס משקל של 10 prepolymers לסוכן ריפוי אחד במשך חמש דקות. לאחר מכן מניחים את התבנית על כרית קצף ויוצקים את התערובת לתוך תבנית האב. דגה PDMS בתא ואקום במשך 30 דקות כריך PDMS degassed עם פיסת סרט שקיפות.

מהדקים את המכלול הכריך עם צלחת הזכוכית, רפידות הקצף וצלחות הפלקסיגלס. מרפאים את ה-PDMS ב-80 מעלות צלזיוס למשך שש שעות ומבודדים את שכבת ה-PDMS ואת סרט השקיפות מהמבנה הכריך. הפעל את המשטחים של PDMS וצלחת זכוכית נקייה עם מנקה הפלזמה במשך דקה אחת לפני מליטה PDMS על צלחת הזכוכית בתנור 80 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.

לאחר מכן הסר את סרט השקיפות. להכנת קרום PDMS הדק, מעיל ספין PDMS לא מאובטח על סרט שקיפות ב 1, 000 סיבובים לדקה במשך דקה אחת כדי לקבל שכבת PDMS עבה 60 מיקרומטר. לרפא חלקית את PDMS מצופה ספין ב 80 מעלות צלזיוס במשך 20 עד 30 דקות לפני השימוש מנקה פלזמה כדי להפעיל את שכבת PDMS microchannel על צלחת הזכוכית ואת שכבת PDMS דקה במשך דקה אחת.

לאחר מכן קשרו את שכבת הממברנה הדקה PDMS לשכבת המיקרו-שאנל PDMS והצבו את השכבות בתנור של 80 מעלות צלזיוס למשך הלילה. להכנת בלוק צינורות, מניחים צינורות מתכת אנכית על צלחת פטרי ויוצקים בעדינות PDMS לא מאובטח לתוך המנה עד כ 3/4 של הצינורות שקועים. לאחר degassing PDMS בתא ואקום במשך 30 דקות, לרפא את PDMS בתנור ב 60 מעלות צלזיוס במשך יותר משש שעות.

בסוף תהליך הריפוי, חותכים חתיכת בלוק PDMS המכיל צינור אחד וניקוב חור בשכבת PDMS הדקה עבור המפרצון. הפעל את בלוק PDMS ואת שכבת PDMS הדקה עם מנקה הפלזמה. לאחר דקה אחת, חבר את בלוק PDMS לחור הפנימי של שכבת PDMS הדקה והצב את כל יחידת התב"ע בתנור בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

להכנת עובש ג'ל אגרוז, יש לערבב 5% אגרוז ו-200 מילימולרים סידן כלורי במים דה-יוניים לחמם את תוסף ג'ל אגרוז עד לרתיחה. יוצקים את תווי ג'ל אגרוז מבושל לתוך תבנית אלומיניום כריך את התבנית עם צלחת הזכוכית. לאחר חמש דקות, להסיר את ג'ל אגרוז מוצק מן עובש אלומיניום.

צלחת 150 microliters של פתרון אלגינט-כונדרוציטים על צלחת זכוכית aminosilanized ולכסות את הפתרון עם עובש ג'ל אגרוז במשך שלוש דקות. בסוף הדגירה, להשתמש בסכין גילוח כדי להסיר את פתרון ג'ל אלגינט מוגזם ולהסיר את עובש ג'ל אגרוז מהצלחת. לאחר מכן מניחים את המבנים alginate-chondrocyte לתוך פתרון קישור צולב המכיל 50 כלוריד סידן מילימולר ו 140 מילימולר נתרן כלורי במים deionized במשך דקה אחת.

להרכבת ההתקן, אתר ארבעה מפזרי PDMS בעובי מילימטר אחד על ארבע הפינות של שכבת PDMS הדקה של יחידת התב"א. מכסים את תאי האוויר של שכבת PDMS הדקה עם 700 מיקרוליטרים של מדיום תרבות כונדרוציטים. בעזרת מיקרוסקופ סטריאו, מניחים את מבנה האלגינט-כונדרוציטים על שכבת ה-PDMS הדקה, דואגים ליישר את המבנים עם תאי האוויר ולהדק את ההתקן באמצעות מלחציים המודפסים בתלת-ממד.

לתיעול המכשיר, השתמשו בפיסת צינורות סיליקון כדי לחבר את השקע של משאבת אוויר עם ההקדמה של שסתום סולנואיד. השתמש חתיכה נוספת של צינורות כדי לחבר את השקע של שסתום סולנואיד עם ההתחברות של המכשיר התאספו. חבר את שסתום סולנואיד עם מחולל פונקציה ולהשתמש גל מרובע אחד הרץ שנוצר על ידי מחולל הפונקציה כדי לתפעל את שסתום סולנואיד.

לאחר מכן הפעל את משאבת האוויר כדי להפעיל את ההתקן באופן פנאומטי. התקן דחיסת כונדרוציט microfluidic מכיל חמישה על חמישה מערכים של מבנים גליליים אלגינט-chondrocyte ומבנהים אלה ניתן לדחוס עם חמישה סדרי גודל שונים של דחיסה. בדוגמה זו, עמודת הג'ל נדחסה על ידי 33.8% גובה על ידי בלון PDMS הגדול ביותר ואת המתח הדחוס וכתוצאה מכך של מבני ג'ל גדל בכ 5% לכל תוספת של 0.2 מילימטר ואת קוטר בלון PDMS.

עיוות דחוס של chondrocytes נקבע על ידי הדמיה התאים ב 613 על ידי 613 על ידי 40 עד 55 מיקרומטר נפח ליד מרכז בניית ג'ל. כאן מוצגת תמונה של כונדרוציטים שדחוסה ב- 16% על-ידי בלון PDMS הגדול ביותר. בגרף זה, ניתן לראות את התפלגות ערכי זן דחיסת התאים הנמדדים.

בניתוח זה, התאים נדחסו באופן כללי יותר על ידי בלוני PDMS גדולים יותר. יחד, נתונים אלה מראים כי כמויות של ג'ל אלגינט ודחיסת כונדרוציטים נשלטים על ידי קוטר בלוני PDMS תחת לחץ מתמיד של 14 קילו-פסקל. כדי להבטיח את יכולת החזרה של ביצועי ההתקן, יצירת קרום PDMS דק עם עובי וגמישות קבועים היא קריטית.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע בדיקות ביולוגיות שונות, כגון כשל חיסוני והכלאה באתרו. באמצעות טכניקה זו, שאלות רבות על mechanotransduction בצלחת הצמיחה או chondrocytes פרקים ניתן לענות.