מיקרומניפולציה של במחזור תאים סרטניים לניתוח מולקולרי במורד הזרם והערכה פוטנציאלית גרורתית

פרוטוקול זה רלוונטי במיוחד מכיוון שהוא מאפשר זיהוי ובחירה של תאים בודדים ממאגר של תאים מעורבים לניתוח במורד הזרם הבא ברזולוציית תא יחיד. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הפוטנציאל להפריד תאים סרטניים במחזור בודדים, או CTCs, מתאים בדם עבור מגוון של ניתוח הדורשים טוהר גבוה. התחל בהפעלת תוכנת המיקרומניפולטור והפעלת המיקרומניפולטור.

חבר את המיקרומניפולטור למחשב ולחץ על חבר ואתחל התקן כדי לאתחל את הזרוע הרובוטית בשלב המיקרוסקופ. נקה את המשטחים החיצוניים והפנימים של ארון ההגנה עם אתנול וסגור את ארון ההגנה לאחר כל מניפולציה של המכונה כדי להיות מסוגל לתמרן את המכשיר דרך המחשב. התקן נימי זכוכית 20 עד 30 מיקרומטר חדש על הזרוע הרובוטית ושטף שמן מערכת דרך המערכת כדי להסיר את כל הבועות בצנרת.

מלאו את מיכל הסטריליזציה אחד עם 70% אתנול, מיכל עיקור שני עם מים סטריליים נטולי גרעין, ואת מיכל החיץ עם PBS סטרילי של Dulbecco. מעקרים את נימי פעמיים עם 70% אתנול ומחליפים את מיכל הסטריליזציה אחד במיכל עיקור שני כדי להשתמש בפונקציית הסטריליזציה כדי לשטוף את נימי במים לפחות שלוש פעמים. בתוכנת micromanipulator, להתחיל ניסוי חדש ולבחור את סוג ניסוי קטיף מן אוטומטי ואת מצבי הבחירה הידנית.

הגדר את מגש הסיפון כדי לציין את המיקומים של מיכל הסטריליזציה, מיכל החיץ ומגש ההפקדה, והגדר את הטמפרטורה של מיכלי הנוזל במגש ההפקדה שנבחר לארבע מעלות צלזיוס. מקם לוחית התקשרות אולטרה-נמוכה המכילה את פתרון CTC המשוחרר מתחת למיקרוסקופ בתוך ארון המיקרו-ניהול. מוציאים את המכסה מהצלחת וסגרו את הארון.

צנטריפוגה צלחת 384 באר המכיל 20 microliters של תרבות CTC בינוני ל הבאר כדי להבטיח כי המדיום הוא sequestered בחלק התחתון של כל באר ולמקם את הצלחת לתוך המיקום היעד אחד של ארבעת מעלות צלזיוס נבחר מגש הפקדה. בחר ידנית את מטרת המיקרוסקופ לקטוף ואת זמן החשיפה של כל הערוצים הדרושים. בחר הצג נווט הבאר כדי להציג באופן חזותי ולבחור את סוג לוחית האיסוף.

לאחר מכן כייל עמדת איסוף באמצע הבאר המכילה את פתרון CTC ללא תאים במרכז שדה המבט. השתמש בחיישן כדי לגעת בעדינות בחלק התחתון של הצלחת עם נימי ולהגדיר את מיקום הטנדר ל 0.05 מילימטרים מעל החלק התחתון של הצלחת. בזהירות להוריד את הזרוע הרובוטית על ידי 10 מיקרומטר בכל פעם, כדי למנוע נזק נימי.

בחר את פרמטרי סוג התא והאיסוף. עבור איסוף תא בודד, בחר את המצב הידני. השתמשו בהיגוי כדי לנווט את נימי הזכוכית בתוך הבאר ולה מניחים את נימי על גבי תא אחד של עניין לפחות מילימטר אחד מגבול הבאר.

לאחר מכן הוסף חלקיקים באופן ידני ובחר בחר חלקיקים פעילים כדי להתחיל את הקטיף. כאשר כל התאים כבר הרים, צנטריפוגה הצלחת כדי להזרים את התאים בתחתית כל באר. כתמי ביו-אמינו עם נוגדן מולקולת הידבקות בתא אנטי-אפיתל מאפשרים הדמיה של תאים סרטניים בהשעיה עם הבחנה מדויקת מאירועים חיוביים CD45.

בידוד CTC מדויק מאופיין בשאיפה של המטרה הרצויה בלבד ללא התאים מזהמים שמסביב. כפי שנחשד, אשכולות CTC להפגין עלייה בהישרדות לעומת CTCs יחיד, מעורר מושבות תאים בתוך 56 ימים של תרבות במבחנה. יש לציין, אשכולות CTC גם להפגין שיעור התפשטות גבוה יותר ובכך להגיע למספרי תאים סופיים גבוהים יותר, המציין כי מגע ישיר עם תאים סרטניים אחרים יש השפעה על הכדאיות של תאים סרטניים וקצב התפשטות.

רצף RNA חד-תאי של CTCs מבודד ישירות לחולי סרטן השד חושף שכן סטוכסטי מבוזר T הטבעה של תאים בודדים נגזר CTCs יחיד, אשכולות CTC, או אשכולות תאי דם לבנים CTC. זכור להתקין את נימי הזכוכית כדי להסיר בועות אוויר בתוך המערכת הנוזלית של המיקרומניפולטור ולכייל את תנוחת האיסוף כדי להבטיח קטיף חד-תאי יעיל. ניתן לזרוע או לעבד את התאים הבודדים עבור רצף הדור הבא כדי לאפשר ניתוח לשעבר vivo ואפיון CTC ברזולוציה של תא יחיד כדי לחקור את התהליך גרורתי.