Name: מיקרומניפולציה של במחזור תאים סרטניים לניתוח מולקולרי במורד הזרם והערכה פוטנציאלית גרורתית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 17 s
Description: למד שיטת מיקרומניפולציה רובוטית לבידוד תאי גידול מחוללים בודדים מדגימות דם. טכניקה זו מאפשרת ניתוח מולקולרי מדויק והערכת פוטנציאל גרורתי לחקר מטסטזיס בסרטן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לכל המטופלים שתרמו דם עבור המחקר שלנו, כמו גם כל קלינאים מעורבים ואחיות לימוד. אנו מודים לינס אברדט, בירק, ו ד ר קאטארינה Uhlig מ-ALS פתרונות מעבדה אוטומטיות GmbH לתמיכה רציפה. אנו מודים לכל חברי מעבדת Aceto למשוב ולדיונים. מחקר במעבדה Aceto נתמך על ידי מועצת המחקר האירופי, האיחוד האירופי, המדע הלאומי למדעים הלאומית, הסרטן השוויצרי ליג, באזל סרטן הליגה, שני הקנטונים של בזל דרך ETH ציריך, ואוניברסיטת בזל.

<ol><li>Talmadge, J. E., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AACR+centennial+series%3A+the+biology+of+cancer+metastasis%3A+historical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">AACR centennial series: the biology of cancer metastasis: historical perspective.</a> Cancer Research. 70 (14), 5649-5669 (2010).</li>
<li>Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+Biological+Principles+of+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Emerging Biological Principles of Metastasis.</a> Cell. 168 (4), 670-691 (2017).</li>
<li>Aceto, N., Toner, M., Maheswaran, S., Haber, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((En+Route+to+Metastasis%3A+Circulating+Tumor+Cell+Clusters+and+Epithelial-to-Mesenchymal+Transition%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">En Route to Metastasis: Circulating Tumor Cell Clusters and Epithelial-to-Mesenchymal Transition.</a> Trends in Cancer. 1 (1), 44-52 (2015).</li>
<li>Hong, Y., Fang, F., Zhang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cell+clusters%3A+What+we+know+and+what+we+expect+%28Review%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cell clusters: What we know and what we expect (Review).</a> International Journal of Oncology. 49 (6), 2206-2216 (2016).</li>
<li>Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis%3A+from+dissemination+to+organ-specific+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Cancer%22%5BJournal%5D)">Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization.</a> Nature Review Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).</li>
<li>Valastyan, S., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+metastasis%3A+molecular+insights+and+evolving+paradigms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms.</a> Cell. 147 (2), 275-292 (2011).</li>
<li>Pantel, K., Speicher, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The biology of circulating tumor cells.</a> Oncogene. 35 (10), 1216-1224 (2016).</li>
<li>Hou, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+significance+and+molecular+characteristics+of+circulating+tumor+cells+and+circulating+tumor+microemboli+in+patients+with+small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Clinical significance and molecular characteristics of circulating tumor cells and circulating tumor microemboli in patients with small-cell lung cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 30 (5), 525-532 (2012).</li>
<li>Long, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+expression+of+TRF2%2C+SOX10%2C+and+CD10+in+circulating+tumor+microemboli+detected+in+metastatic+melanoma+patients.+A+potential+impact+for+the+assessment+of+disease+aggressiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Medicine%22%5BJournal%5D)">High expression of TRF2, SOX10, and CD10 in circulating tumor microemboli detected in metastatic melanoma patients. A potential impact for the assessment of disease aggressiveness.</a> Cancer Medicine. 5 (6), 1022-1030 (2016).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinally+collected+CTCs+and+CTC-clusters+and+clinical+outcomes+of+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Longitudinally collected CTCs and CTC-clusters and clinical outcomes of metastatic breast cancer.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 161 (1), 83-94 (2017).</li>
<li>Mu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+assessment+of+the+prognostic+value+of+circulating+tumor+cells+and+their+clusters+in+patients+with+advanced-stage+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Prospective assessment of the prognostic value of circulating tumor cells and their clusters in patients with advanced-stage breast cancer.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 154 (3), 563-571 (2015).</li>
<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+microemboli+%28CTM%29+and+vimentin%2B+circulating+tumor+cells+%28CTCs%29+detected+by+a+size-based+platform+predict+worse+prognosis+in+advanced+colorectal+cancer+patients+during+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+International%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor microemboli (CTM) and vimentin+ circulating tumor cells (CTCs) detected by a size-based platform predict worse prognosis in advanced colorectal cancer patients during chemotherapy.</a> Cancer Cell International. 17, 6(2017).</li>
<li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Circulating+Tumor+Cells+and+Circulating+Tumor+Microemboli+in+Gastric+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Oncology%22%5BJournal%5D)">Detection of Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor Microemboli in Gastric Cancer.</a> Translational Oncology. 10 (3), 431-441 (2017).</li>
<li>Chang, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Significance+of+Circulating+Tumor+Microemboli+as+a+Prognostic+Marker+in+Patients+with+Pancreatic+Ductal+Adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Clinical Significance of Circulating Tumor Microemboli as a Prognostic Marker in Patients with Pancreatic Ductal Adenocarcinoma.</a> Clinical Chemistry. 62 (3), 505-513 (2016).</li>
<li>Aceto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cell+clusters+are+oligoclonal+precursors+of+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cell clusters are oligoclonal precursors of breast cancer metastasis.</a> Cell. 158 (5), 1110-1122 (2014).</li>
<li>Cheung, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyclonal+breast+cancer+metastases+arise+from+collective+dissemination+of+keratin+14-expressing+tumor+cell+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Polyclonal breast cancer metastases arise from collective dissemination of keratin 14-expressing tumor cell clusters.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (7), E854-E863 (2016).</li>
<li>Giuliano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspective+on+Circulating+Tumor+Cell+Clusters%3A+Why+It+Takes+a+Village+to+Metastasize%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Perspective on Circulating Tumor Cell Clusters: Why It Takes a Village to Metastasize.</a> Cancer Research. 78 (4), 845-852 (2018).</li>
<li>Gkountela, S., Aceto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-like+features+of+cancer+cells+on+their+way+to+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Direct%22%5BJournal%5D)">Stem-like features of cancer cells on their way to metastasis.</a> Biology Direct. 11, 33(2016).</li>
<li>Gkountela, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+Tumor+Cell+Clustering+Shapes+DNA+Methylation+to+Enable+Metastasis+Seeding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Circulating Tumor Cell Clustering Shapes DNA Methylation to Enable Metastasis Seeding.</a> Cell. 176 (1-2), 98-112 (2019).</li>
<li>Szczerba, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+escort+circulating+tumour+cells+to+enable+cell+cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neutrophils escort circulating tumour cells to enable cell cycle progression.</a> Nature. , (2019).</li>
<li>Beije, N., Jager, A., Sleijfer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cell+enumeration+by+the+CellSearch+system%3A+the+clinician%27s+guide+to+breast+cancer+treatment%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Treatment+Reviews%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cell enumeration by the CellSearch system: the clinician's guide to breast cancer treatment?</a> Cancer Treatment Reviews. 41 (2), 144-150 (2015).</li>
<li>Sarioglu, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+device+for+label-free%2C+physical+capture+of+circulating+tumor+cell+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic device for label-free, physical capture of circulating tumor cell clusters.</a> Nature Methods. 12 (7), 685-691 (2015).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+Evaluation+of+a+Novel+Size+Based+Circulating+Tumor+Cell+Isolation+System%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimization and Evaluation of a Novel Size Based Circulating Tumor Cell Isolation System.</a> PLoS One. 10 (9), e0138032(2015).</li>
<li>Stott, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+circulating+tumor+cells+using+a+microvortex-generating+herringbone-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (43), 18392-18397 (2010).</li>
<li>Ozkumur, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inertial+focusing+for+tumor+antigen-dependent+and+-independent+sorting+of+rare+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Inertial focusing for tumor antigen-dependent and -independent sorting of rare circulating tumor cells.</a> Science Translational Medicine. 5 (179), 179ra147(2013).</li>
<li>Went, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequent+EpCam+protein+expression+in+human+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Pathology%22%5BJournal%5D)">Frequent EpCam protein expression in human carcinomas.</a> Human Pathology. 35 (1), 122-128 (2004).</li>
<li>Soysal, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpCAM+expression+varies+significantly+and+is+differentially+associated+with+prognosis+in+the+luminal+B+HER2%28%2B%29%2C+basal-like%2C+and+HER2+intrinsic+subtypes+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">EpCAM expression varies significantly and is differentially associated with prognosis in the luminal B HER2(+), basal-like, and HER2 intrinsic subtypes of breast cancer.</a> British Journal of Cancer. 108 (7), 1480-1487 (2013).</li>
<li>Yu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+breast+tumor+cells+exhibit+dynamic+changes+in+epithelial+and+mesenchymal+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Circulating breast tumor cells exhibit dynamic changes in epithelial and mesenchymal composition.</a> Science. 339 (6119), 580-584 (2013).</li>
<li>Mani, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epithelial-mesenchymal+transition+generates+cells+with+properties+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells.</a> Cell. 133 (4), 704-715 (2008).</li>
<li>Zheng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+microfilter+device+for+selective+capture%2C+electrolysis+and+genomic+analysis+of+human+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Membrane microfilter device for selective capture, electrolysis and genomic analysis of human circulating tumor cells.</a> Journal of Chromatography A. 1162 (2), 154-161 (2007).</li>
<li>Yu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+therapy.+Ex+vivo+culture+of+circulating+breast+tumor+cells+for+individualized+testing+of+drug+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer therapy. Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility.</a> Science. 345 (6193), 216-220 (2014).</li>
</ol>

N.A. ו-עב מפורטים כממציאים ביישומי פטנטים המתייחסים למחזור תאי הגידול ולטיפול בסרטן. N.A. הוא יועץ בתשלום עבור חברות התרופות וביטוח עם עניין ביופסיה נוזלית.

האפיון המולקולרי של CTCs מחזיק בהבטחה לשפר את הבנתנו את התהליך הגרורתי ולהדריך את התפתחות הטיפולים החדשים נגד גרורות. כאן אנו מספקים תיאור מפורט של הפרוטוקולים הללו המאפשרים CTC מיקרומניפולציה וניתוח במורד הזרם, כולל שניהם תא יחיד המבוסס על מבוססי תאים, ניתוח ביטוי גנים בהשתלה vivo עבור פוטנציאל גרורתי הערכה20.
בין השלבים הקריטיים ביותר של הפרוטוקול שלנו, מיקרומניפולציה של מוצרים CTC-מועשר מטרתו לקבל רזולוציה של תא יחיד משעיות תא הטרוגנית יחסית, כלומר, המאפשר ל...

ביטוי קליני של גרורות באיברים רחוקים מייצג את השלב הסופי של התקדמות הסרטן וחשבונות עבור יותר מ 90% של מקרי מוות הקשורים לסרטן1. המעבר מתוך מחלה מקומית למחלה גרורתית הוא תהליך רב שלב, לעתים קרובות מתווכת על ידי במחזור תאים סרטניים (ctcs)2,3,4. תאים אלה הם לשפוך מן הגידול העיקרי לתוך זרימת הדם מועברים לאיברים מרוחקים, שם הם יכולים extravasate ולהקים נגעים גרורתית5,6. למרות גידולים מוצקים יכולים לשחרר מספר גבוה יחסית של CTCs, רוב CTCs נועדו למות, בשל כוחות להטות גבוה במחזור, anoikis-בתיווך מוות תאים, התקפה חיסונית או יכולות מוגבלות כדי להסתגל מיקרוסביבה זרה7. לכן, זה מרכזי להקים כלים המאפשרים את הניתוח של התכונות המולקולריות של אלה CTCs כי הם מצוידים ביכולת זריעת גרורות. מחקרים האחרונים פרה וקליניים מראים כי הנוכחות והכמות של ctcs יחיד ואשכולות CTC קשורה לתוצאה גרועה יותר בחולים עם סוגים שונים של גידולים מוצקים8,9,10 , מיכל בן 11 , מיכל בן 12 , מיכל בן 13 , מיכל בן 14 . אשכולות CTC הם קבוצות של שניים או יותר ctcs מחוברים זה לזה במהלך המחזור ויעילים יותר ביצירת גרורות לעומת ctcs אחד3,15,16. תאים בתוך אשכול שומרים על הדבקה חזקה תא תא באמצעות הצמתים desmosomes וחסיד, אשר עשוי לסייע להתגבר על אנואיקיס17,18. לאחרונה, הבחנו כי התקבצות של CTCs מקושרת לhypאומולציה של אתרי הכריכה של שולי-והפצת שעתוק הקשורים, המובילה ליכולת מוגברת ליזום בהצלחה את גרורות19. CTC הדיסוציאציה גורמת לשיפוצים של אתרי האיגוד המרכזיים, וכתוצאה מכך, הדיכוי של הפוטנציאל הגרורתי שלהם19. בנוסף אשכולות של תאים סרטניים, CTCs יכול גם לשייך לתא הדם הלבן (לעתים קרובות נויטרופילים) כדי לשמור על רמות התפשטות גבוהות במחזור ולהגדיל יכולת גרורתית שלהם20. עם זאת, הביולוגיה של CTCs מובנת רק בחלק ומספר שאלות נשארות פתוחות, כולל התכונות המולקולריות והפגיעויות של תאים בודדים ומקובצים באשכולות.
בשנים האחרונות הוקמו מספר אסטרטגיות שינצלו את דפוסי הביטוי של משטח התא, כמו גם תכונות פיזיות של ctcs לבידוד שלהם21,22,23,24, 25. אנטיגן-שיטות בידוד תלוי להסתמך בעיקר על הביטוי של משטח התא אפיתל מולקולה הדבקה של תא (epcam)26. השימוש התכוף ביותר (בזמן הנוכחי) הפלטפורמה היחידה של ה-FDA עבור ספירה CTC, היא מערכת CellSearch, אשר מבוססת על הליך שני שלבים כדי לבודד CTCs21. בשלב הראשון, רכיבי פלזמה מוסרים על ידי צנטריפוגה, בעוד CTCs נלכדים עם מגנטי מגנטיים מצמידים אנטי EpCAM נוגדנים. בשלב השני, הפתרון CTC-מועשר מוכתם עבור נוקלאובטים (dapi-חיוביים) תאים המבטא ציטוקרטין (CK)8,18,19, בעוד תאי דם לבנים (wbcs) מזוהים באמצעות ה סמן CD45. לבסוף, תאים שנתפסו ממוקמים על פלטפורמת הקרנה משולבת CTCs מזוהים באמצעות הביטוי של EpCAM, אקס, ו DAPI תוך שלילי עבור CD45. למרות שהדבר נחשב לסטנדרט הזהב לספירת CTC, ניתוח מולקולרי במורד הזרם מאתגר עם טכנולוגיה זו בשל האילוצים הטבועים באחזור CTC. בנוסף, בהינתן הליך הבידוד שלה, CellSearch עשוי להעדיף את העשרת CTCs עם רמות EpCAM גבוהות יותר לעומת CTCs עם ביטוי התחתון EpCAM, בשל למשל סרטן טרוגניות27 או downregulation של סמנים אפיתל 28,29. כדי להתגבר על מגבלות אלה, טכנולוגיות בלתי תלויות אנטיגן להעשרה של CTCs הופיעו. לדוגמה, CTC-ichip משלבת הפרדה הידרודינמית של תאים נוקלאוטיים, כולל ctcs ו-wbcs מרכיבי הדם הנותרים, ולאחריו דלדול אימונוגנטית של נוגדן מתויג wbcs, המאפשר טיהור של ctcs מתויגים וקיימא ב פתרון25. בנוסף, העובדה כי רוב ctcs הם קצת יותר גדול מאשר כדוריות הדם האדומות (rbcs) או wbcs הובילו לפיתוח של טכנולוגיות העשרה מבוססות CTC גודל23,30 (למשל, מערכת parsortix (זווית)) אשר עושה שימוש ב מבוססי מיקרופלואידיג טכנולוגיה, הכוללת ערוץ היצרות על פני קלטת ההפרדה, תאים מובילים לפער מסוף של 10, 8, 6.5 או 4.5 יקרומטר (גדלים שונים זמינים בהתאם לקוטר צפוי של תאים סרטניים היעד). רוב תאי הדם עוברים דרך הפער הצר, בעוד CTCs לכודים בשל גודלם (אבל גם בשל deformability התחתון שלהם) והם, לכן, נשמרים בקלטת. החזרת כיוון הזרימה מאפשרת שחרורו של CTCs שנתפסו, אשר נמצאים במצב בר קיימא ומתאים לניתוח במורד הזרם. באופן עצמאי של הפרוטוקול הנבחר עבור בידוד CTC, עם זאת, הליכים שלאחר העשרה טיפוסי עדיין להניב CTCs כי הם מעורבים עם מספר קטן יחסית של RBCs ו-WBCs, ביצוע ניתוח של CTCs טהור או בצובר מאתגרת. כדי לטפל בבעיה זו, הקמנו זרימת עבודה המאפשרת תפעול CTC ללא הטיה פוטנציאלית שהוצגה על-ידי מזהמים של תאי דם. תוספת של כתמים חיסוניים מראש, עם שילובים משתנה נוגדן, מבדיל CTCs מתאי הדם ואף מאפשר לזהות תת קבוצות CTC עם פרופילים ביטוי משטח-סמן ברורים. זה הליך להתאמה אישית מאוד יכול להיות בשילוב נוסף עם יישומים ספציפיים במורד הזרם.
כאן, אנו מתארים זרימת עבודה המתחילה ממוצר CTC-מועשר (שהושג עם כל טכנולוגיית CTC העשרה של בחירה) ומשלבת מספר גישות כדי לקבל תובנה לביולוגיה של CTC ברזולוציה של תא בודד. בקיצור, זרימת העבודה שלנו מאפשרת זיהוי של CTCs יחיד, אשכולות CTC ו CTC-WBC אשכולות על ידי החיסונית לחיות, ואחריו מיקרומניפולציה תא יחיד וניתוח במורד באמצעות פרוטוקולי vivo culturing לשעבר, תא בודד רצף, ו ב vivo גרורות.

<table><tbody><tr><td>טכנולוגיית איתות תאים</td> <td>EpCAM-AF488 אנטי אנושית</td><td>שיבוט CST5198</td><td>: VU1D9</td></tr><tr><td>1X DPBS</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>14190169 ללא סידן, ללא מגניסיום</td></tr><tr><td>6 בארות צלחת חיבור נמוכה במיוחד</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD45-BV605</td><td>Biolegend</td><td>304041</td><td>שיבוט: HI30</td></tr><tr><td>אנטי אנושי EGFR-FITC&nbsp;</td><td>שיבוט GeneTex</td><td>GTX11400</td><td>: ICR10</td></tr><tr><td>אנטי אנושי HER2-AF488&nbsp;</td><td>שיבוט Biolegend</td><td>324410</td><td>: 24D2</td></tr><tr><td>נגד עכבר CD45-BV605</td><td>שיבוט 103139 Biolegend</td><td></td>: <td>30-F11</td></tr><tr><td>BD Vacutainer K2EDTA</td><td>BD</td><td>366643</td><td>לאיסוף דם אנושי</td></tr><tr>יחידת<td>ליבה של Cell Celector</td><td>ALS</td><td>CC1001</td>&<td>nbsp;</td></tr><tr><td>תוכנת CellD</td><td>ALS</td><td></td><td>גרסה 3.0</td></tr><tr><td>Cultrex PathClear גורם גדילה מופחת BME, סוג 2</td><td>מו"פ D Systems</td><td>3533-005-02</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו שפופרת 1.3 מ"ל K3EDTA</td><td>Sarstedt</td><td>41.3395.005</td><td>לאיסוף דם עכבר</td></tr><tr><td>צינורות PCR</td><td>קורנינג</td><td>PCR-02-L-C</td><td></td></tr><tr><td>RLT פלוס</td><td>Quiagen</td><td>1053393</td><td></td></tr><tr><td>SUPERase&nbsp; במעכב RNase</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM2696</td><td>&nbsp; 1 U/&מיקרו; L&nbsp;</td></tr></tbody></table>

מיקרומניפולציה של במחזור תאים סרטניים לניתוח מולקולרי במורד הזרם והערכה פוטנציאלית גרורתית

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

דם גרורות המועברות חשבונות עבור מקרי מוות הקשורים לסרטן, כרוך במחזור תאים סרטניים (CTCs) כי הם מצליחים בהקמת גידולים חדשים באתרים מרוחקים. CTCs נמצאים במחזור הדם של חולים כמו תאים בודדים (CTCs יחיד) או כאגרגטים רב-תאיים (אשכולות CTC ו CTC-לבן האשכולות תא דם), עם האחרון המציג יכולת גרורתית גבוה יותר. מעבר לספירה, ניתוח פנומיטיות ומולקולרי הוא חשוב במיוחד כדי לנתח את ביולוגיה של CTC ולזהות פגיעויות שניתן לשאת. כאן, אנו מספקים תיאור מפורט של זרימת עבודה הכוללת CTC כתמים ומיקרומניפולציה, התרבות הvivo ex כדי להעריך את יכולות ההתרבות וההישרדות של תאים בודדים, ו ב vivo גרורות-היווצרות assays. בנוסף, אנו מספקים פרוטוקול להשגת הדיסוציאציה של אשכולות CTC לתאים בודדים וחקירה של טרוגניות באשכול. עם גישות אלה, למשל, אנחנו בדיוק לכמת הישרדות ופוטנציאל מתרבים של CTCs יחיד תאים בודדים בתוך אשכולות CTC, מוביל אותנו התבוננות כי תאים בתוך אשכולות להציג הישרדות טוב יותר התפשטות לשעבר תרבויות vivo לעומת CTCs יחיד. בסך הכל, זרימת העבודה שלנו מציעה פלטפורמה כדי לנתח את המאפיינים של CTCs ברמת התא בודד, במטרה לקראת זיהוי של מסלולים הרלוונטיים גרורות והבנה טובה יותר של CTC ביולוגיה.

זרימת העבודה המוצגת מאפשרת הכנת CTCs בודדים, בין CTCs יחיד או מופרדים מאשכולות CTC. CTCs מהחולים או הגידול הנושאת עכברים מועשרים מדם שלם עם שיטות CTC-העשרה זמין ולאחר מכן מוכתם עם נוגדנים נגד סמנים הקשורים לסרטן (למשל, EpCAM, ירוק) ו-WBC ספציפיים סמנים (למשל, CD45, אדום) (איור 1A ). המוצר CTC מוכתם לאחר מכן מועבר לתחנת המיקרומניפולציה היו תאים בודדים נאספו, הופקד בצינורות PCR או צלחות multiwell יטב ומוכן ניתוח במורד הזרם, כולל רצף בודד תא, תרבות מבח...

כאן, אנו מציגים זרימת עבודה משולבת כדי לזהות תכונות פנוטיפקס ומולקולריות המאפיינות תאים סרטניים במחזור (CTCs). אנו משלבים כתמים חיים ומיקרומניפולציה רובוטית של CTCs יחיד ומקובצים עם שיטות מבוססות תא יחיד עבור ניתוח המטה והערכה של גרורות-זריעת היכולת.

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

פרוטוקול זה רלוונטי במיוחד מכיוון שהוא מאפשר זיהוי ובחירה של תאים בודדים ממאגר של תאים מעורבים לניתוח במורד הזרם הבא ברזולוציית תא יחיד. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הפוטנציאל להפריד תאים סרטניים במחזור בודדים, או CTCs, מתאים בדם עבור מגוון של ניתוח הדורשים טוהר גבוה. התחל בהפעלת תוכנת המיקרומניפולטור והפעלת המיקרומניפולטור.חבר את המיקרומניפולטור למחשב ולחץ על חבר ואתחל התקן כדי לאתחל את הזרוע הרובוטית בשלב המיקרוסקופ. נקה את המשטחים החיצוניים והפנימים של ארון ההגנה עם אתנול וסגור את ארון ההגנה לאחר כל מניפולציה של המכונה כדי להיות מסוגל לתמרן את המכשיר דרך המחשב. התקן נימי זכוכית 20 עד 30 מיקרומטר חדש על הזרוע הרובוטית ושטף שמן מערכת דרך המערכת כדי להסיר את כל הבועות בצנרת.מלאו את מיכל הסטריליזציה אחד עם 70% אתנול, מיכל עיקור שני עם מים סטריליים נטולי גרעין, ואת מיכל החיץ עם PBS סטרילי של Dulbecco. מעקרים את נימי פעמיים עם 70% אתנול ומחליפים את מיכל הסטריליזציה אחד במיכל עיקור שני כדי להשתמש בפונקציית הסטריליזציה כדי לשטוף את נימי במים לפחות שלוש פעמים. בתוכנת micromanipulator, להתחיל ניסוי חדש ולבחור את סוג ניסוי קטיף מן אוטומטי ואת מצבי הבחירה הידנית.הגדר את מגש הסיפון כדי לציין את המיקומים של מיכל הסטריליזציה, מיכל החיץ ומגש ההפקדה, והגדר את הטמפרטורה של מיכלי הנוזל במגש ההפקדה שנבחר לארבע מעלות צלזיוס. מקם לוחית התקשרות אולטרה-נמוכה המכילה את פתרון CTC המשוחרר מתחת למיקרוסקופ בתוך ארון המיקרו-ניהול. מוציאים את המכסה מהצלחת וסגרו את הארון.צנטריפוגה צלחת 384 באר המכיל 20 microliters של תרבות CTC בינוני ל הבאר כדי להבטיח כי המדיום הוא sequestered בחלק התחתון של כל באר ולמקם את הצלחת לתוך המיקום היעד אחד של ארבעת מעלות צלזיוס נבחר מגש הפקדה. בחר ידנית את מטרת המיקרוסקופ לקטוף ואת זמן החשיפה של כל הערוצים הדרושים. בחר הצג נווט הבאר כדי להציג באופן חזותי ולבחור את סוג לוחית האיסוף.לאחר מכן כייל עמדת איסוף באמצע הבאר המכילה את פתרון CTC ללא תאים במרכז שדה המבט. השתמש בחיישן כדי לגעת בעדינות בחלק התחתון של הצלחת עם נימי ולהגדיר את מיקום הטנדר ל 0.05 מילימטרים מעל החלק התחתון של הצלחת. בזהירות להוריד את הזרוע הרובוטית על ידי 10 מיקרומטר בכל פעם, כדי למנוע נזק נימי.בחר את פרמטרי סוג התא והאיסוף. עבור איסוף תא בודד, בחר את המצב הידני. השתמשו בהיגוי כדי לנווט את נימי הזכוכית בתוך הבאר ולה מניחים את נימי על גבי תא אחד של עניין לפחות מילימטר אחד מגבול הבאר.לאחר מכן הוסף חלקיקים באופן ידני ובחר בחר חלקיקים פעילים כדי להתחיל את הקטיף. כאשר כל התאים כבר הרים, צנטריפוגה הצלחת כדי להזרים את התאים בתחתית כל באר. כתמי ביו-אמינו עם נוגדן מולקולת הידבקות בתא אנטי-אפיתל מאפשרים הדמיה של תאים סרטניים בהשעיה עם הבחנה מדויקת מאירועים חיוביים CD45.בידוד CTC מדויק מאופיין בשאיפה של המטרה הרצויה בלבד ללא התאים מזהמים שמסביב. כפי שנחשד, אשכולות CTC להפגין עלייה בהישרדות לעומת CTCs יחיד, מעורר מושבות תאים בתוך 56 ימים של תרבות במבחנה. יש לציין, אשכולות CTC גם להפגין שיעור התפשטות גבוה יותר ובכך להגיע למספרי תאים סופיים גבוהים יותר, המציין כי מגע ישיר עם תאים סרטניים אחרים יש השפעה על הכדאיות של תאים סרטניים וקצב התפשטות.רצף RNA חד-תאי של CTCs מבודד ישירות לחולי סרטן השד חושף שכן סטוכסטי מבוזר T הטבעה של תאים בודדים נגזר CTCs יחיד, אשכולות CTC, או אשכולות תאי דם לבנים CTC. זכור להתקין את נימי הזכוכית כדי להסיר בועות אוויר בתוך המערכת הנוזלית של המיקרומניפולטור ולכייל את תנוחת האיסוף כדי להבטיח קטיף חד-תאי יעיל. ניתן לזרוע או לעבד את התאים הבודדים עבור רצף הדור הבא כדי לאפשר ניתוח לשעבר vivo ואפיון CTC ברזולוציה של תא יחיד כדי לחקור את התהליך גרורתי.

micromanipulation-circulating-tumor-cells-for-downstream-molecular

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

בתאי הגידול במחזור מבודדים מהדם של חולי סרטן ללא גרימת נזק לתאים. בידוד של תאים סרטניים נעשה באמצעות משטח bimolecular של selectin-E בנוסף נוגדנים כנגד סמנים אפיתל. ציפוי Nanotube במיוחד מקדם תאים סרטניים וכתוצאה מכך הידבקות purities ללכוד גבוהה.

בידוד מהיר של נספח אווירי בתאי הגידול במחזור של דגימות דם החולה

תאי גידול במחזור הדם (CTCs) הוכחו כממלאים תפקיד חשוב בגרורות גידול. כאן, מתוארת שיטה לבידוד והתפשטות של CTCs מהדם המלא של מודל גידול עכבר סינגני של גרורות קרצינומה של הכבד (HCC).

בידוד וריבוי תאים סרטניים במחזור מסרטן מודל עכבר

כתב יד זה מתאר שיטה לכמת הצטברות תאים גידול בריאות במודל חיה של גרורות הגידול.

ריאות הגידול תא גיוס Assay

פרוטוקול זה מתאר פונקציונליזציה של פני השטח הניתנת להתאמה אישית של מערכת הדסטיוביוטין, הסטרפטווידין וה-APTES על מנת לבודד סוגי תאים ספציפיים מעניינים. בנוסף, כתב יד זה מכסה את היישומים, האופטימיזציה והאימות של תהליך זה.

שיטה של ​​בידוד תא ממוקד באמצעות Functionalization משטח הזכוכית

פרוטוקול לנצל פולי (N -iso-propylacrylamide) (PIPAAm) מצופה Microfilter עבור יעיל ללכוד ולשחרר thermoresponsive של תאים סרטניים קיימא במחזור (CTC) מוצג. שיטה זו מאפשרת ללכוד של CTC מ 'דם בחולים ושחרורו של CTC קיימא עבור במורד הזרם מחוץ שבב תרבות, מנתח ואפיון.

לכידת שחרור בתאי גידול במחזור קיימא מן הדם

אנו מתארים את הקמתם של גידולים המעי הגס אורטוטופיים באמצעות הזרקה של תאים סרטניים או אורגנואידים לתוך cecum של עכברים הבידוד הבאים של תאים סרטניים במחזור (CTCs) מן המודל הזה.

בידוד של תאים סרטניים במחזור מודל עכבר אורתופטי של סרטן המעי הגס

פרוטוקול זה נועד לשחזר ולהתכונן התאים היעד נדיר מתערובת עם תאי המטרה ללא רקע אפיון גנטי מולקולרי ברמת תא בודד. איכות ה-DNA שווה לתאים בודדים שאינם מטופלים ומאפשר יישום תא בודד (הקרנת שני מבוסס, ממוקד ניתוח).

הגברה עושר מראש ולא כל הגנום תא היעד עבור אפיון במורד הזרם תא בודד

זוהי שיטה יעילה לסנן מדכאים או נהגים של גרורות סרטן. תאים, המועברים בספריית ביטויים, מוזרקים לתוך כלי הקרום chorioallantoic עוף כדי ליצור מושבות גרורתיות. מושבות שיש להם ירידה או פולשניות מוגברת הם excised, מורחב, reinjected כדי לאשר פנוטיפ שלהם, ולבסוף, מנותח באמצעות רצף תפוקה גבוהה.

גילוי של רגולטורים גרורתיים באמצעות מודל ממברנה צ'יק תוך-ויאטואי מהיר וכמותי

Culturing CTCs מאפשר אפיון תפקודי עמוק יותר של סרטן, באמצעות הבעת ביטוי סמן ספציפי, והערכת עמידות לתרופות ואת היכולת ליישב את הכבד בין אפשרויות אחרות. בסך הכל, תרבות CTC יכולה להיות כלי קליני מבטיח לרפואה מותאמת אישית כדי לשפר את תוצאות המטופל.

קווי תאים סרטניים במחזור: כלי חדשני למחקר יסודי ותרגום

כאן, אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד, עם טיפים ליצירת קסנוגרפטים והנחיות לניתוח התנהגות הגידול, חיסוניות של כל ההר, וכימות הדמיה confocal.

דור של זברה דג זחל קסנוגרפטים וניתוח התנהגות הגידול

תאי גידול במחזור (CTC) הם קריטיים לחקר התקדמות הסרטן והגרורות. מאמר זה מציג פרוטוקול משולב בעל תפוקה גבוהה להעשרת CTC וריצוף CTC יחיד, המשפר את יעילות הלכידה וטוהר ה-CTC תוך הפחתת עלויות הזיהום והריצוף, ובכך מקדם מחקר אונקולוגי מדויק ויישומים קליניים.

טכנולוגיית מיון תאי גידול במחזור וריצוף תאים בודדים מבוססת מיקרופלואידיקה

למד שיטת מיקרומניפולציה רובוטית לבידוד תאי גידול מחוללים בודדים מדגימות דם. טכניקה זו מאפשרת ניתוח מולקולרי מדויק והערכת פוטנציאל גרורתי לחקר מטסטזיס בסרטן.

מיקרומניפולציה של במחזור תאים סרטניים לניתוח מולקולרי במורד הזרם והערכה פוטנציאלית גרורתית

גלה סרטונים נוספים