תא היקפי של דם מונאפרור (PBMC) חרט הומניזציה מודל Xenograft עבור מחקר הטרנסג-אונקולוגיה (I-O)

הפרוטוקול שלנו יכול לשמש כקו מנחה כללי להקמת מודלים לעכבר משוחזרים עם PBMC אנושי וגידולים למחקר אימונו-אונקולוגי. הליכים אלה מספקים גישה חסכונית מאוד לשחזור חלקי חסינות אנושית בעכברים נושאי גידול אנושי באמצעות תת עורית ערבוב של PBMC אנושי עם xenografts סרטן. הדגמת ההליכים איתי תהיה שינקסין קוי, יאן-ג'אנג, הואיצ'ן באי ושיאולונג יאנג, שנשלחו אלינו מהמחלקה לפרמקולוגיה.

עבור דלדול התא מיאלואידי intra peritoneally לספק 100 מ"ג לקילוגרם של ציקלופוספאמיד ולספק דרך הפה 125 מ"ג לקילוגרם של דיסולפירם לשישה עד שמונה שבועות NOD / SCID עכברים נקבה פעם ביום במשך יומיים. 24 שעות לאחר המנה השנייה של ציקלופוספאמיד ו disulfiram, resuspend חמש פעמים 10 מתוך שישה PBMC אנושי מבודד טרי ו 2.5 פעמים 10 של שישה תאים תא הגידול האנושי ו 200 microliters של PBS בתוספת 50% metrogel לכל בעל חיים ולהזריק את כל נפח תת עורית לתוך האגף הימני של כל חיה ניסיונית. למדוד ולתזמן את נפח הגידול העיקרי פעמיים בשבוע במשך ארבעה עד שישה שבועות.

כאשר הגידולים מגיעים לנפח ממוצע של 200 עד 500 מילימטרים, השתמש במספריים אופטומיים כדי לקצור גידול שלם מכל חיה. PBMC תורמים קווי תאים סרטניים החולה נגזר xenografts שתוצאתו גידול מתון עם PD-1 גבוה יחסית, PD-L1 וביטוי CD8 יש להשתמש לניתוח הבא. לניתוח אימונוהיסטוכימי של רקמות הגידול שנקטפו, לתקן את הדגימות ואת הפורמלין 24 עד 72 שעות לפני התייבשות הטבעה של הרקמות בפרפין.

השג שלושה מקטעי מיקרומטר של הרקמות המוטבעות על שקופיות מצופות פוליזין ורוקן את הדגימות עם שלוש טבילות קסילן של שבע דקות. לאחר הטיפול השלישי, לחות את החלקים עם שלוש דקות טבילות אלכוהול מדורגות. לאחר מכן לשטוף את השקופית במים deionized שלוש פעמים ולהסיר כל נוזל עודף מן המגלשות.

כדי לבצע אחזור אנטיגן, למקם את השקופיות במיכל ולכסות את השקופיות עם מאגר sodiocitrate 10 מילימולרים. מחממים את המגלשות, מיכל, במיקרוגל במשך שלוש דקות לפני הצבת המגלשות באמבט מים 95 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר הקירור לטמפרטורת החדר, יש לשטוף את המגלשות שלוש פעמים במים שעברו דה-יון ולשאף כל נוזל עודף מהמגלשות.

דגירה עם 0.3% מי חמצן במשך 10 דקות כדי לחסום פעילות פרוקסידזה אנדוגני ואחריו חסימה עם 3%BSA ו PBS במשך שעה אחת. בסוף הדגירה מי חמצן, לתייג את המגלשות עם הנוגדנים העיקריים המתאימים בארבע מעלות צלזיוס לילה. למחרת בבוקר, לטפל במגלשות עם peroxidase חזרת תרכובת נוגדן משני במשך שעה בטמפרטורת החדר לפני החלת המצע dropwise על המגלשות עד רמה מתאימה של כתמים חומים נצפתה על ידי מיקרוסקופיה אור.

לאחר מכן, להכתים את הדגימות עם hematoxylin. לאחר דקה אחת, עצרו את התגובה במים מזוקקים ואחריה טביעה של חמש שניות ב-0.5% אלכוהול חומצה הידרוכלורית וחמש שניות במים אמוניה 0.5%. ואז לייבש את הדגימות עם שלוש עולה שלוש דקות אתנול ושלוש, חמש דקות טבילת קצילן.

כדי להעריך את פעילות antitumor של תרופה מועמד עניין, ליזום את הטיפול ביום חיסון התא על פי פרוטוקול הניסוי המתוכנן לפקח על נפח הגידול העיקרי פעמיים בשבוע במשך ארבעה עד שישה שבועות. לניתוח דינמי של PharmaCODE של תאי החיסון שחדרו לגידול, יש לטחון את רקמות הגידול לחתיכות קטנות ולעכל את השברים עם סוג קולגנס 1 ו-DNase I ו-RPMI-1640 מדיום ועוד 5%FBS למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. בסוף העיכול, לסנן את הרקמה המתעכלת דרך מסננת תא 40 מיקרומטר כדי להשיג השעיה תא יחיד ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה.

תן שימוש חוזר את גלולה באחת פעמים 10 של התאים השביעי למיליליטר של ריכוז מאגר פקס קר קרח ולהעביר נפח שווה של תאים למספר המתאים של בארות בצלחת תחתונה עגולה 96 היטב. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה מחדש את כדורי ב 20 מיקרוגרם למיליליטר של IGG אנושי במשך 30 דקות כדי לחסום כל כריכה לא ספציפית. ואז להכתים את התאים עם הנוגדנים העיקריים המתאימים במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס לפני הניתוח שלהם על ידי ציטומטריה זרימה על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.

כפי שהוכח, 100 מיליגרם לקילוגרם ציקלופוספאמיד ו 125 מיליגרם לקילוגרם disulfiram myeloablation תוצאות דלדול משמעותי של נויטרופילים מונוציטים ארבעה ימים לאחר הטיפול. לאחר PBMC אנושי והשתלת גידול, נוכחות של חדירות תאים חיסוניים אנושיים ניתן לאמת בתוך microenvironment הגידול על ידי אימונוהיסטוכימיה. הקרנה in vivo של פאנל של תורמים PBMC יכול להתבצע כדי לאשר את נוכחותו של חדירת תא חיסוני גבוה יחסית לתוך microenvironment הגידול בקצב גידול מקובל.

קווי תאים סרטניים אנושיים בחולה נגזר xenografts מסוגי סרטן שונים ניתן גם להעריך כדי להעריך את קצב הגידול ואת חדירת תאים חיסוניים. בניסוי מייצג זה, טיפול PBMC ועכברים אנושיים מושתלים עם נוגדן אנטי PD1 אנושי הביא פעילויות אנטיטומור משמעותיות. דיסולפירם מקטין urotoxicity של ציקלופוספאמיד, השילוב עשוי להפעיל השפעות נויטרופניה לאורך זמן בעכברים.

משטר המינון המדויק של ציקלופוספאמיד ו disulfiram ייתכן שיהיה צורך קבוע מראש. זנים חדשים יותר של עכברים immunodeficient יותר עבור התחדשות חסינות אנושית קלה יותר וירידה באפקט GvHD קסנוגני הוקמו והם ממתינים לחקירות נוספות עם הפרוטוקול המתועד שלנו. המודל שלנו שימושי להערכת T-cell העוסקים טיפולים חיסוניים סרטן, במיוחד כאשר עובדים על צירי זמן קצרים או לבחירת סוכנים לפני המעבר למודל חסינות multilineage מורכב יותר.