Name: הכנת שאיפה של העכבר רשתית-סעיפים עבור אימונוהיסטוכימיה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 25 s
Description: למדו הכנת חתכי רשתית קפואים מעכברים לאימונוהיסטוכימיה. הפרוטוקול כולל ניתוח עיניים, קיבוע בפורמלדהיד, השרייה בסוכרוז וחיתוך בקריוסטט. השיטה שומרת על מבנה התאים ומאפשרת ניתוח מדויק של שכבות הרשתית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי קרנות מ-NIH (RO1-GMO97327) והקרן לחקר האוניברסיטה (UPenn). אנו מודים במיוחד לסווטלנה סאוינה על עזרתה בפיתוח פרוטוקול אימונוהיסטוכימיה, גורדון רותל (אונ' פנסילבניה) וליבת ההדמיה של פן וטרינר לסיוע במיקרוסקופיה ולסלי קינג, Ph.D. לקריאה קריטית של כתב היד .

כל השיטות המתוארות כאן בוצעו בהתאמה קפדנית עם ההמלצות של המכונים הלאומיים למדריך בריאות לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה שסופקו על ידי המכון למשאבי בעלי חיים במעבדה ואושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים והוועדה השתמש של אוניברסיטת פנסילבניה.
כל הכלים והציוד עבור השיטות מוצגים באיור 1 ומפורטים בטבלת החומרים. 
1. העין העכבר enucleation, העין לנתיחה, והטבעה
<ol><li>המתת חסד של עכברים עם פחמן דו חמצני (CO2) ואחריו עריפת ראש (עכברים לפני הלידה P0-P11) או פריקה צוואר הרחם (למבוגרים > P11 עכברים). עבור עכברים P0-P14, העיניים מכוסות בעור. הקפידו להסיר את העור לפני הצעדים הבאים.</li>
	<li>סמן את החלק הזמני של העין (איור 2 א) על ידי שריפת הקרנית מעט באמצעות הזנב צורב. הימנע בוער חור בקרנית ידי נגיעה בקרנית בקלילות מאוד וללא יותר משבריר שנייה עם הצורב.</li>
	<li>מיד עוקרים את עיני העכבר באמצעות מעוקל דומונט5/45 מלקחיים. מודרת עבור 15 דקות ב 1.5 mL שפופרת קריוצינור עם 1 מ ל של 4% פאראפורמלדהיד (בתחתית) ב-פוספט מאגור מלוחים (PBS) על קרח.</li>
	<li>לאחר 15 דקות ב 4% כלגון, להעביר את העין הקבועה באמצעות מלקחיים מעוקל דומונט5/45 כדי שונה 35 מ"מ צלחת הניתוח (ראה טבלת חומרים ואיור 1c) מלא PBS ו מקום תחת מיקרוסקופ.</li>
	<li>לעשות חתך קטן על סימן הכוויה, בניצב אל וקצת מעל לימבוס (הגבול של הקרנית) באמצעות סכין מיקרו.</li>
	<li>הכנס את המספריים המעוקל לתוך החתך ולבצע חתך מעוקל של הקרנית בעקבות לימבוס (איור 2B).</li>
	<li>הסר את הקרנית ולחלץ את העדשה עם דק5 מלקחיים דומונט, (איור 2B) ולהרים אותו בעדינות הרחק מהחלק האחורי של העין. הגוף אינדקטור, ג'ל ברור הממלא את החלל בין העדשה ואת הרשתית, תצא עם העדשה (איור 2b) ואת הרשתית יהיה גלוי כמו משטח לבן המכסה את החלק הפנימי של העין האחורי של הספל. ודא כי אין נזק גלוי לעין הרשתית, כגון חורים או דמעות (איור 2C).</li>
	<li>שטוף את כוסות העיניים פעמיים ב 1 מ ל של PBS עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הקפאה של כוסות העין על ידי השתלטות עליהם בתמיסה של 15% סוכרוז ב-PBS לילה ב-4 ° צ' עד לכיורי העיניים</li>
	<li>להעביר את כוסות העין כדי 30% סוכרוז ב-PBS עבור 2-3 h עד כיורי העין שוקעת.</li>
	<li>להטביע את כוסות העין ב OCT ב 10 x 10 מילימטר cryomolds (איור 3a). באמצעות מיקרוסקופ מבתר, כוון את העין בקריואוולד לאורך הציר הגוגולי שלה (איור 2D, איור 3a) על ידי סיבוב העין עד סימן הכוויה הוא למעלה, עצב הראייה הוא בצד שמאל, חלק לחתוך את העובש פונה ימינה ( איור 2D). שמור על עצמך להימנע בועות ליד הרקמה. הערה: כדי לתמרן את גביע העין, להשתמש במקדח טיטניום עשוי חוט טיטניום המצורפת לקצה הפיפטה.</li>
	<li>כדי להצמיד הקפאת רקמת הרשתית, לטבול את cryomold לפחות 5 דקות בגביע מתכת המכיל איזופנטאן ולמקם את הגביע בחנקן נוזלי או קרח יבש/100% האתנול אמבטיה (עד 1/3 של גובה גביע המתכת). הערה: cryomold צריך להיות שקוע איזופנטאן לגדול ממחצית הגובה שלה, אבל לא צריך להיות לגמרי שקוע.</li>
	<li>להסיר את הבלוק הקפוא לעטוף אותו רדיד אלומיניום.</li>
	<li>חנות ב-80 ° c.</li>
	<li>סמן את הבלוק הקפוא באמצעות עט או טוש כדי להקליט את כיוון הבלוק (איור 3B).</li>
</ol>2. בנייה באמצעות קריוסטט
<ol><li>לאחר התאמת טמפרטורת הקריוסטט (בין-20 ל-25 ° c), אפשר את התבניות המכילות את כוסות העיניים המוטבעות כדי להתאים את טמפרטורת הקריוסטט ל-1 h.</li>
	<li>התקן את הבלוק עם כיוון dorso-ventral (איור 3c) ולחתוך 10 יקרומטר מקטעים סידוריים עבים. מניחים בזהירות את החלקים הרשתית על שקופיות המיקרוסקופ ממוספרים.</li>
	<li>אחסן שקופיות בתיבות שקופיות ב-20 ° צ' או-80 ° צ' עד להליכי IHC.</li>
</ol>3. כתמים פלואורסצנטית באמצעות מתלה השקופיות
הערה: מערכת לארון תקשורת שקופית (למשל, סקונצה) מחזיקה את שקופיות מיקרוסקופ הזכוכית עם צלחת כיסוי, יצירת פער הנימים ~ 100 μL בין השקופית לצלחת.
<ol><li>להפשיר את מקטעי ההקפאה בטמפרטורת החדר (RT) עבור 2 h כדי 4 h כדי לאפשר להם להתייבש ולצרף לשקופיות מיקרוסקופ. הערה: ניתן גם לייבש אותם ב 30-37 ° c עבור 30 דקות עד 1 h.</li>
	<li>מקם שקופיות בארון תקשורת של השקופיות ושטוף את מקטעי הרשתית פעמיים ב-100-200 μL PBS עבור 2 דקות.</li>
	<li>החדירות סעיפים ברשתית על ידי מודטת אותם ב 0.25% טריטון-X/0.05% נאן3ב PBS עבור 5 דקות ב-RT.</li>
	<li>הוסף 100 μL של חסימת פתרון לשקופיות.</li>
	<li>הוסף 100 μL של הנוגדן העיקרי מדולל בפתרון חסימת לשקופיות.</li>
	<li>מודריטה סעיפים רשתית לילה ב 4 ° c. הערה: במהלך זמן זה, כסה את מתלה השקופיות כדי למנוע התייבשות של המקטעים.</li>
	<li>לשטוף את מקטעי הרשתית 3 פעמים, כל אחד עבור 15 דקות, באמצעות 200 μL PBS. הערה: התוספת של 0.001-0.002% טריטון-X100 כדי PBS (PBS-T) לאפשר שטיפה מחמירה יותר, אבל יכול לשבש כמה קרומים ומבנים סלולריים.</li>
	<li>דגירה סעיפים הרשתית בנוגדנים המסומנים על ידי פלורסנט עבור 1 h ב RT. . מעתה והלאה, הגן מפני האור</li>
	<li>שטוף את מקטעי הרשתית 3 פעמים, כל אחד עבור 15 דקות.</li>
	<li>מודאת סעיפים ברשתית ב RT עבור 5 דקות עם סמן גרעיני כגון Hoechst 33342 או פתרון DAPI.</li>
	<li>לשטוף את סעיפים הרשתית 1 פעם עבור 15 דקות.</li>
	<li>הניחו שמיכות על גבי מגבת נייר על ספסל המעבדה.</li>
	<li>הוסף 2 טיפות של המדיה הרכבה אנטי נמוגה למרכז הכיסויים.</li>
	<li>הפוך את השקופית כדי שמקטע ההקפאה הרשתית פונה כלפי מטה.</li>
	<li>הבהר בזהירות את הכיסויים, בזווית של ~ 45 °, הקצה את השקופית אל המדיה הנכנסת. הערה: הימנעות מיצירת בועות בעת הורדת השקופית במקומה.</li>
	<li>החלת לחץ אפילו, באמצעות ספר או קטלוג כבדים (ראה להלן), לשילוב שקופית-שקופיות כדי למנוע הרכבה מדיה עודפת. הערה: כדי להבטיח עקביות בהכנה לדוגמה, השתמש תמיד באותו אובייקט, (כלומר, אותו ספר או קטלוג) כדי להחיל לחץ אפילו על הכיסויים במהלך הרכבת השקופיות.</li>
	<li>שמרו על שטוח והניחו את הלילה בחושך בחשיכה. אחסן מגלשות שטוחות ב -4 ° c ללא הגבלת זמן.</li>
	<li>תמונה באמצעות שדה רחב או המיקרוסקופיה פלואורסצנטית (איור 4).</li>
</ol>

<ol><li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labelled+antigens+and+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Labelled antigens and antibodies.</a> Annual Review of Microbiology. 8, 333-352 (1954).</li>
<li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+antibodies+as+histochemical+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Federation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Fluorescent antibodies as histochemical tools.</a> Federation Proceedings. 10 (2), 558-559 (1951).</li>
<li>Coons, A. H., Kaplan, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+antigen+in+tissue+cells%3B+improvements+in+a+method+for+the+detection+of+antigen+by+means+of+fluorescent+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody.</a> Journal of Experimental Medicine. 91 (1), 1-13 (1950).</li>
<li>Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artefacts+in+histopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+Maxillofacial+Pathology%22%5BJournal%5D)">Artefacts in histopathology.</a> Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 18 (Suppl 1), S111-S116 (2014).</li>
<li>Hartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frozen+sections+from+Bouin-fixed+material+in+histopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">Frozen sections from Bouin-fixed material in histopathology.</a> Stain Technology. 20, 113(1945).</li>
<li>Benerini Gatta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+alternative+fixatives+to+formalin+in+diagnostic+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Application of alternative fixatives to formalin in diagnostic pathology.</a> European Journal of Histochemistry. 56 (2), e12(2012).</li>
<li>Tokuyasu, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+cryoultramicrotomy+to+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Application of cryoultramicrotomy to immunocytochemistry.</a> Journal of Microscopy. 143 (Pt 2), 139-149 (1986).</li>
<li>Imai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+properties+of+rhodopsin+and+rod+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular properties of rhodopsin and rod function.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (9), 6677-6684 (2007).</li>
<li>Lee, J. W., Lim, M. Y., Park, Y. S., Park, S. J., Kim, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reexamination+of+Dopaminergic+Amacrine+Cells+in+the+Rabbit+Retina%3A+Confocal+Analysis+with+Double-+and+Triple-labeling+Immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Reexamination of Dopaminergic Amacrine Cells in the Rabbit Retina: Confocal Analysis with Double- and Triple-labeling Immunohistochemistry.</a> Experimental Neurobiology. 26 (6), 329-338 (2017).</li>
<li>Bringmann, A., Grosche, A., Pannicke, T., Reichenbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+and+Glutamate+Uptake+and+Metabolism+in+Retinal+Glial+%28Muller%29+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">GABA and Glutamate Uptake and Metabolism in Retinal Glial (Muller) Cells.</a> Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 4, 48(2013).</li>
<li>Nakhai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ptf1a+is+essential+for+the+differentiation+of+GABAergic+and+glycinergic+amacrine+cells+and+horizontal+cells+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Ptf1a is essential for the differentiation of GABAergic and glycinergic amacrine cells and horizontal cells in the mouse retina.</a> Development. 134 (6), 1151-1160 (2007).</li>
<li>Applebury, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+cone+photoreceptor%3A+a+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).</li>
</ol>

אין הגילויים.

לנתיחה הרשתית של העכבר הוא תהליך עדין בשל גודל קטן וצורה של עיניים העכבר ושבריאת הרקמות הרשתית. למרות ביצוע הניתוח באיכות גבוהה הוא עניין של תרגול, בעל פרוטוקול מפורט, מתן שיטות יעילות וטיפים הוא הכרח להשיג חלקים ברשתית ו-IHC. בנוסף לפרוטוקולים המתוארים כאן, קיימים מספר טיפים המאפשרים למקטעי רשתית באיכות גבוהה ועקבית המתאימים ל-IHC.
לפני תחילת הניתוח, חשוב להיות נוח, רגוע ולהגדיר את תאורת החדר לראייה אופטימלית במהלך ניתוח מיקרו העכבר עין. כדי לשמור על צורת העיניים של העכבר בזמן מבתר את העין, א...

אימונוהיסטוכימיה (ihc) היא טכניקה רבת-עוצמה לאיתור חלבונים ומבני סלולר ספציפיים ברקמות באתרו1,2,3. שיטות קיבעון בלתי הולמים והפחתה תת-אופטימלית של רקמות מורכבות יכול לשבש את מבנה הרקמה, ליצור כתמים ברקע גבוה או להפחית נוגדן-אפירופה אינטראקציות, וכתוצאה מכך מכתים חפצים והסוגר וטעה של נתוני IHC4. כמו הרשתית בעלי החוליות הוא איבר עצבי מורכב ומאורגן מאוד מורכב משכבות של פוטוטורקטורים מחוברים, הביננוירונים ותאים גנגליון, זה שברירי מאוד ניתן לשבש בקלות במהלך הניתוח והפריית. פרוטוקול מפורט, מתוקננת, ומאומת מפני הפחתת עין העכבר והתמצאות לכתמים מסייעים להפחית באופן משמעותי את הממצאים של IHC, ובכך להגדיל את האמינות של התוצאות ולאפשר נתונים השוואתיים יותר מדויקים ניתוח.
ישנם פרוטוקולים רבים עבור הכנת רקמות עבור IHC, עם זאת, לא כל מתאים לרקמות רשתית. תיקונים חזקים כמו 10% פורמלין או הפתרון של bouin לשמר את המבנה הרשתית במהלך הניתוח והאפשרות5. למרבה הצער, תיקונים חזקים מובילים לעיתים קרובות לאור הזריחה המשופרת והמסיכה כתוצאה משינוי כימי של אפיסקופים6. מצד שני, תיקונים מתון יותר, כמו 4% פאראמפורמלדהיד (בתחתית) יכולים להקל על כמה מהחפצים האלה, אבל דורשים לעבור ניתוח קפדני והקפדה כדי לשמר את המבנה הרשתית האופטימלי. הכדורגלן חודר במהירות לרקמות, אבל מצמצמים את החלבונים מאוד לאט, ומפחיתים את הסיכון של הסוואה. מאז הדגירה התחתית זמן קצר היא קיבעון קל יחסית, רקמות לעתים קרובות דורשים קיפאון מהיר כדי לשמר אנטיגנים. חשוב להימנע היווצרות גביש הקרח במהלך הקפאת רקמות כפי שהם לעוות ולפגוע היושרה של תאים ורקמות7.
כאן אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים וסטנדרטיים עבור ניתוח, קיבעון, הגנה על ההקפאה של כוסות העכבר האחורי העינית התשואה נתונים IHC עקבית ואמין.

<table><tbody><tr><td>6qt. נירוסטה (185 x 218 מ"מ)</td><td>גילסון&nbsp;</td><td>#MA-48</td><td>לחנקן נוזלי (איור 1E)</td></tr> <tr><td>רדיד אלומיניום&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צריבה &nbsp;</td><td>Bovie</td><td>#AA01</td><td>לסימון כיוון העין (איור 1A)</td></tr><tr><td>מלקחיים מעוקלים, פינצטה Dumont #5/45, כפוף 45 מעלות&nbsp;</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td> <td>#72703-D</td><td>להוצאה ותחזוקה של עין העכבר (איור 1A)</td></tr><tr><td>מספריים מעוקלים, מספריים קפיציים של Vannas - קצה חיתוך 2.5 מ"מ&nbsp;</td><td>כלים מדעיים&nbsp;</td><td>#15002-08</td><td>לחיתוך היקפי של הקרנית (איור 1B)</td></tr> <tr>צלחת <td></td><td></td><td>דיסקציה מצופה שעווה 35 מ"מ</td><td>לדיסקציה של העין (איור 1C)</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ חיתוך&nbsp;</td><td>לייקה, יוסטון, ארה"ב&nbsp;</td><td>MZ12.5 מיקרו סכיני מיקרו סטריאומיקרוסקופ</td><td></td>בעלי ביצועים</tr><tr><td>גבוהים - ידית פלסטיק&nbsp;</td><td>כלים מדעיים&nbsp;</td><td>#10315-12</td><td>לבצע חתך קטן בסימן הכוויה (איור 1A)</td></tr><tr><td>שעווה דנטלית ורודה&nbsp;</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית&nbsp;</td><td>#72660</td><td>לציפוי צלחת חיתוך</td></tr><tr><td>מתלה שקופיות וכיסוי</td><td>טד פלה</td><td>#36107</td><td>ל-IHC רשתית (איור 1G)</td></tr> <tr><td>נירוסטה (89 x 114 מ"מ)</td><td>גילסון&nbsp;</td><td>#MA-40</td><td>לאמבט איזופנטן (איור 1E)</td></tr> <tr><td>קופסת</td><td></td><td></td> קלקר <td>לצידנית מבודדת</td></tr><tr><td>מלקחיים דקים Dumont #5&nbsp; &nbsp;</td><td>כלים מדעיים&nbsp;</td><td>#11254-20</td><td>כדי להסיר את הקרנית ולחלץ את העדשה (איור 1B)</td></tr><tr><td>Tissue-Tek cryomold&nbsp; (10 מ"מ x 10 מ"מ x 5 מ"מ)</td><td>מדעי מיסקרוסקופיה אלקטרונית&nbsp;</td><td>#62534-10</td><td>עובש להטמעת OCT</td></tr><tr><td><חזק>בופרים וריאגנטים</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>הערות</חזק></td></tr><tr><td>תמיסת</td><td></td><td></td> חסימה <td>2% סרום סוס רגיל, 1.5% ג'לטין עור דג קר (ב-40-50% ב-H2O, חתול #G7765), 5% אלבומין בסרום בקר (חתול #AK1391-0100) במאגר פרמיביליזציה.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Gelvatol (אמצעי הרכבה נגד דהייה)</td><td></td><td></td><td>מתחת למכסה האדים, ממיסים 0.337 גרם DABCO (Sigma cat #D2522-25G) ב-10 מ"ל Fluoromount G (חתול פישר #OB100-01).&nbsp; התאימו ל-pH 8-8.5 עם 12N HCl (~ 5 טיפות).&nbsp; יש לאחסן בבקבוק טיפה ענבר בטמפרטורה של 4&00 מעלות; C&nbsp; (8).&nbsp;</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 1000x מלאי</td><td>Thermo Scientific</td><td>#62249</td><td>1 מ"ג/מ"ל ב-PBS (פי 1000). Aliquot ואחסן בחושך, ב-4&deg; C עד שנה או ב-20&deg; C לאחסון לטווח ארוך. הכן טרי&nbsp; ב-1 ug/mL (1x)&nbsp;</td></tr><tr><td>איזופנטן, 99%&nbsp;</td><td>GFS כימיקלים</td> <td>#2961</td><td></td></tr><tr><td>חנקן</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>נוזלי פרפורמלדהיד (PFA) במדעי</td><td>מיקרוסקופיה אלקטרונית PBS&nbsp;</td><td>#15710</td><td>מוכן טרי 4% PFA מ-16% מלאי PFA. אחסן את 16% ה-PFA הנותרים ב-4&deg; C בחושך.&nbsp;</td></tr><tr>תמיסת <td></td><td></td><td>פרמיביליזציה</td><td>PBS + 0.25% טריטון-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3.&nbsp; הכן טרי.</td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)</td><td>Bioworld&nbsp;</td><td>#41620015-20</td><td>0.02 גרם/ליטר KCl, 0.02 גרם/ליטר KH2PO4, 0.8 גרם/ליטר NaCl, 0.216 גרם/ליטר Na2HPO4, pH 7.4.&nbsp; מוכן ממלאי 10x&nbsp;</td></tr><tr><td>פתרונות סוכרוז</td><td>פישר סיינטיפיק&nbsp; &nbsp;</td><td>#S-5-500</td><td>יש להמיס את הכמות המתאימה של סוכרוז ב-37&00 מעלות; C PBS (לוקח ~15 דקות להתמוסס). ניתן לאחסן מספר ימים בטמפרטורה של 4&מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>תרכובת OCT של Tissue-Tek&nbsp;</td><td>Sakura</td><td>&nbsp;#4583</td><td></td></tr><tr><td>נוגדנים</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>anti-calbindin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8666</td><td>לתיוג תאים הורינזוטליים&nbsp;</td></tr><tr><td>anti-GAD65</td><td>Chemicon</td><td>AB5082</td><td>לתיוג תאי אמקרין GABAergic</td></tr><tr><td>נגד</td><td>GS BD Transduction</td><td>610517</td><td>לתייג M&uuml; תאי ller</td></tr><tr><td>אנטי רודופסין</td><td>Millipore</td><td>MAB5316</td><td>לתיוג מוטות</td></tr></tbody></table>

הכנת שאיפה של העכבר רשתית-סעיפים עבור אימונוהיסטוכימיה

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

הכנת סעיפים באיכות גבוהה עכבר העין עבור אימונוהיסטוכימיה (IHC) הוא קריטי להערכת מבנה ותפקוד רשתית ולקביעת מנגנונים המשמשים מחלות רשתית. שמירה על השלמות המבנית לאורך הכנת הרקמה חיונית להשגת נתונים ברשתית שניתן לתחזק, אך יכול להיות מאתגר בשל שבריאת והמורכבות של האדריכלות הרשתית. תיקונים חזקים כמו 10% פורמלין או הפתרון של bouin לשמר בצורה אופטימלית את המבנה הרשתית, הם לעתים קרובות לעכב את ניתוח ihc על ידי שיפור הרקע של זריחה ו/או הפוחתת נוגדן האינטראקציות, תהליך המכונה מיסוך אפירופה. תיקונים מתון יותר, מצד שני, כמו 4% פאראפורמלדהיד, מפחית את הרקע של זריחה ואפירופה-מיסוך, טכניקות הניתוח מוקפד חייב להיות מנוצל כדי לשמר את המבנה הרשתית. במאמר זה, אנו מציגים שיטה מקיפה כדי להכין את העכבר כוסות האחורי העינית עבור IHC כי הוא מספיק כדי לשמר את האינטראקציות הנוגדן ביותר מבלי לאבד שלמות מבנית ברשתית. אנו כוללים נציג IHC עם נוגדנים שונים סוג תא סמנים ברשתית כדי להמחיש שימור רקמות וכיוון בתנאים מיטביים ותת אופטימלית. המטרה שלנו היא לייעל את מחקרי IHC של הרשתית על ידי מתן פרוטוקול מלאה מתוך ניתוח הספל האחורי העינית ל-IHC.

כדי להמחיש כיצד פרוטוקולים אלה, להבטיח שימור הרשתית אופטימלית עבור ihc, אנו בדקו מקטעים ברשתית מ P28 WT עכברים (C57BL/6n) עם נוגדנים לרודוסין (הסמן תא קולט אור)8, גלוטמית חומצה decarboxylase 65 (Gad65, תא אמקרין marker)9, גלוטמין הבורסה (GS, מסמן תא מולר)10, ו calbindin (סמן תא אופקי)11 (איור 4). IHC מציינים כי הפרוטוקולים שלנו להניב בעקביות באיכות גבוהה ומשומרים ה...

דו ח זה מתאר שיטות מקיפות של הכנת העכבר הקפוא מקטעים רשתית עבור אימונוהיסטוכימיה (IHC). השיטות שתוארו כוללות ניתוח של הספל האחורי העינית, קיבעון הפרפורמלדהיד, הטבעה של טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) מדיה ורקמות כיוון, הסרת וכתמים חיסוני.

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

ניתוח רשתית העכבר הוא תהליך עדין באמת בשל הגודל והצורה של העיניים ואת השבריריות של סעיף הרשתית. הכרחי לתרגול, בעל פרוטוקול מפורט המספקים שיטה יעילה וטיפים הוא המפתח לנתח רשתית באיכות גבוהה ומקטע. אנו מספקים טיפים וייעוץ כדי לסייע לחוקרים להימנע ממלכודות נפוצות ולקבל כמה סעיפים רשתית באיכות גבוהה המתאימים לאימונוהיסטוכימיה.סמן את החלק הזמני של העין של עכבר המתת סנפיר באמצעות צרוב זנב על ידי נגיעה בקרנית בקלילות רבה ולא יותר משבריר שנייה כדי לשרוף מעט את הקרנית ולהימנע מלעשות חור. מיד לאחר מכן השתמשו בדומונט 545 מדפים מעוקלים כדי להחנות עיני עכבר. מניחים את העיניים ב cryotube 1.5 מיליליטר עם מיליליטר אחד של 4%PFA ו PBS ודגירה במשך 15 דקות על קרח.לאחר מכן, להעביר את העיניים קבוע באמצעות מדפים מעוקל Dumont 545 לצלחת ניתוח 35 מילימטר שונה מלא PBS וממוקמים תחת מיקרוסקופ ניתוח. השתמש microknife לעשות חתך קטן על סימן הכוויה בניצב אל וקצת מעל הגבול limbus של הקרנית. הכנס מספריים מעוגלים לתוך החתך ולבצע חתך היקפי של הקרנית בעקבות הלימבוס.לאחר מכן, באמצעות מדפים דקים של Dumont 5, להסיר את הקרנית, לחלץ את העדשה, ולהרים אותו בעדינות מן החלק האחורי של העין. הגוף הזינה ית לצאת עם העדשה ואת הרשתית יהיה גלוי כמו משטח לבן המכסה את החלק הפנימי של העין האחורית. לשטוף את כוסות העין המבודדות פעמיים במיליליטר אחד של PBS במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.כדי להגן על כוסות העיניים, יש לצייד אותן ב-15% סוכרוז ו-PBS למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס עד שהן שוקעות. לאחר מכן מעבירים את כוסות העיניים ל-30% סוכרוז ו-PBS למשך שעתיים עד שלוש שעות עד שהם שוקעים. מניחים את כוסות העין ב OCT ב 10 על ידי 10 מילימטר קריו-תבניות להטמיע.תחת מיקרוסקופ ניתוח, לכוון את העין בתבנית קריו לאורך ציר הגחון הגבי שלה על ידי סיבוב העין עד סימן הכוויה הוא על גבי. עצב הראייה הוא אחד שמאלה ואת חלק לחתוך את התבנית פונה ימינה. כדי לצלם להקפיא את רקמת הרשתית, לטבול את ההקפאה-עובש לפחות חמש דקות בסק מתכת המכיל isopentane ולאחר מכן למקם את הקוטקר בחנקן נוזלי עד שליש מגובה התוך של המקור.מוציאים את הבלוק הקפוא, עוטפים אותו בנייר אלומיניום, ומאחסנים במינוס 80 מעלות צלזיוס. השתמש בעט או שארפי כדי לסמן את הבלוק הקפוא כדי לתעד את הכיוון שלו. לאחר התאמת טמפרטורת ההקפאה בין מינוס 20 למינוס 25 מעלות צלזיוס, מניחים את התבניות המכילות את כוסות העיניים המוטבעות בפנים ומאפשרים להם לצייד לטמפרטורת ההקפאה למשך שעה.התקן את הבלוק ב cryostat עם כיוון הגחון הגבי ולהתחיל לחתוך 10 חלקים טוריים עבים מיקרומטר. מניחים בזהירות את קטעי הרשתית על שקופיות מיקרוסקופ מבואר ממוספר ולאחר מכן לאחסן בתיבות שקופיות במינוס 20 מעלות צלזיוס או מינוס 80 מעלות צלזיוס עד מוכן immunostaining. אימונוהיסטוכימיה עם נוגדנים לרודופסין, סמן פוטורצפטור, חומצה גלוטמית decarboxylase 65, וסמן תאים אמקרין, סינתזת גלוטמין וסמן תא מולר, ו calbindin, סמן תא אופקי בוצע על קטעי רשתית.התוצאות מצביעות על כך שפרוטוקול זה מניב סעיפי רשתית באיכות גבוהה ונשמר היטב שלא כמו בקטעי רשתית באיכות ירודה המתקבלים מפרוטוקול אחר. הקטעים הפנימיים והחיצויים העשירים ברודופסין נשארים אנכיים וללא כל הפרדה מאפיתל פיגמנט רשתית. Interneurons, כגון תאי אמקרין חיוביים Gad65, נשארים מרודים כראוי בתוך השכבה הגרעינית הפנימית ואת שכבת plexiform הפנימית.כמו כן, תאי מולר נשמרים היטב עם סומא מיושר כראוי בתהליכים ציטופלסמיים המשתרעים משכבת תא הגנגליון לשכבה הגרעינית החיצונית. יתר על כן, תאים אופקיים מוגדרים היטב ניתנים לגילוי בשכבה הגרעינית הפנימית ובגבול שכבת הפלקסיפורם החיצוני. חשוב לסמן את אזור טופר של העיניים ולשמור על הכיוון במהלך הטבעה.תמיד להכין paraformaldehyde מתחת למכסה המנוע עם ציוד מגן אישי המתאים.

preparation-of-mouse-retinal-cryo-sections-for-immunohistochemistry

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנו מתארים פרוטוקול עבור זלוף transcardiac של הסרת, עכברים חתך של המוח, כמו גם מכתים אימונו, הטבעה שרף, Ultrathin חתך של חלקים במוח. עם השלמת הליכים אלה, החומר immunostained מוכן בדיקה עם מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים.

הכנת רקמות מוח עכבר מיקרוסקופית Immunoelectron

הרשתית העכברית הילוד מספקת מודל מאופיין היטב פיסיולוגי של אנגיוגנזה, המאפשר חקירה של התפקידים של גנים או תרופות שונים המווסתים אנגיוגנזה...

מכתים Immunofluorescent הר שלם של רשתית עכבר ילודים לחקר אנגיוגנזה<em&gt; בvivo</em

הפרוטוקול המתואר כאן מיועד להערכה מבנית של תכשיר רשתית שלם. זה כולל תיאורים של דיסקציה של רקמות, הרכבה על תוספת ממברנה פוליטטרפלואורואתילן הידרופילית (PTFE), העמסת בולוס עם סמנים פלואורסצנטיים, והשוואה של קיבוע עם קרבודימיד ופרפורמלדהיד לניתוח אימונוהיסטוכימי של רכיבים תאיים וסינפטיים.

פרוטוקול אופטימלי עבור רשתית Wholemount הכנה להדמיה ואימונוהיסטוכימיה

נדגים שלוש טכניקות להכנת רקמות שונות להמחשת immunohistochemical של pericytes microvascular ברשתית עכברוש, קרי, הקפאה-סעיפים, שלם-טעינות בידוד היפוטוניק של רשת כלי הדם.

הקפאה-מקטעי רשתית, שלם-טעינות, וההכנות להערכת מבודד היפוטוניק להמחשת Immunohistochemical של Microvascular Pericytes

מטרת הדו ח היא לתאר את הפרוטוקול לגילוי immunohistochemical חזקה של סמני epigenetic, 5-methylcytosine (5mC) ו- 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) בפיתוח, postmitotic העכבר הרשתית.

Immunohistochemical זיהוי של 5-Methylcytosine, 5-Hydroxymethylcytosine בפיתוח ואת הרשתית העכבר Postmitotic

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי להתאים את שיטת הבהירות של רקמות המוח עבור רטינות הר שלם כדי לשפר את האיכות של כתמים אימונוהיסטוכימיים סטנדרטיים הדמיה ברזולוציה גבוהה של נוירונים ברשתית ואת המבנים התת תאיים שלהם.

חיסון של רטינות הר שלם עם שיטת ניקוי רקמת בהירות

מודלים של עכברים יכולים להיות כלים שימושיים לחקר הביולוגיה של אפיתל פיגמנטי ברשתית (RPE). נקבע כי עכברים יכולים לפתח מערך של פתולוגיות RPE. כאן, אנו מתארים פרוטוקול פנוטיפ כדי להבהיר ולכמת פתולוגיות RPE בעכברים באמצעות אור, אלקטרונים הולכה ומיקרוסקופ קונפוקלי.

פרוטוקול להערכה וכימות של פתולוגיות אפיתל פיגמנטי ברשתית במודלים עכבריים של ניוון מקולרי הקשור לגיל

פרוטוקול זה מתאר את השלבים המפורטים של הטמעה מראש של מיקרוסקופ אימונואלקטרונים, תוך התמקדות בחקר מעגלים סינפטיים ולוקליזציה של חלבונים ברשתית.

חקירת מעגלי רשתית ולוקליזציה מולקולרית על ידי הטבעה מראש של מיקרוסקופ אימונואלקטרונים

הפריציטים בכלי הדם ברשתית נבדקו על ידי צביעה אימונו-פלואורסצנטית עם β קולטן גורם גדילה שמקורו בטסיות דם לאחר הזרקה רטרו-אורביטלית של לקטין עגבניות פלואורסצנטי. הרשתית המסומנת טופלה עוד בשיטת ניקוי הרקמות והותקנה בשלמותה להמחשת התצוגות התלת מימדיות של פריציטים המקיפים את כלי הדם ברשתית תחת מיקרוסקופ קונפוקלי.

הדמיה תלת מימדית של פריציטים וסקולריים ברשתית בעכברים על ידי צביעה חיסונית 

מתואר פרוטוקול להכנת הקפאות רשתית של עכברים וביצוע צביעה חיסונית על קולטני אור. מאמר זה מאפשר לחוקרים לייצר באופן עקבי חלקים קפואים ברשתית של עכברים עם מורפולוגיה שמורה היטב ותוצאות צביעה חיסונית באיכות גבוהה.

הקפאה וצביעה חיסונית של רשתית העכבר

הרשתית מציגה ארגון מרחבי מורכב על פני המבנה הלמינרי שלה. טכניקות מודרניות של טרנסקריפטומיקה מרחבית וריצוף דורשות קטעי רקמה בעובי &lt; 20 מיקרומטר, מה שמגביל את תחולת מחקר הרשתית. שיטת הקפאה טרייה זו מייצרת קטעי פנים דקים של רשתית העכבר תוך שמירה על יחסים מרחביים מישוריים, ומאפשרת מיפוי מולקולרי מקיף על פני הלמינות.

פנים פנים הקפאה של רשתית עכבר לניתוח מרחבי מרחבי בממדים גבוהים

למדו הכנת חתכי רשתית קפואים מעכברים לאימונוהיסטוכימיה. הפרוטוקול כולל ניתוח עיניים, קיבוע בפורמלדהיד, השרייה בסוכרוז וחיתוך בקריוסטט. השיטה שומרת על מבנה התאים ומאפשרת ניתוח מדויק של שכבות הרשתית.

הכנת שאיפה של העכבר רשתית-סעיפים עבור אימונוהיסטוכימיה

גלה סרטונים נוספים