Name: שימוש בקרוב-אינפרא אדום פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה סריקה למדוד חלבון הביטוי במוח מכרסם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: למד שיטת סריקת אינפרא-אדום קרוב פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה לכימות חלבונים באזורי מוח ספציפיים בעכברוש. הפרוטוקול מאפשר ניתוח מסלולי מולקולריים וסמני קוגניציה בנוירוביולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחקר בדו ח זה מומן על ידי מענק היעד של הכושים (1P20GM103653) הוענק DK.

הפרוטוקול הבא אושר על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של אוניברסיטת דלאוור. גברים בחולדות מג בני 55-75 ימים שימשו לפרוטוקול זה.
1. מיצוי המוח והכנת רקמות
<ol><li>בחדר ההרדמה עד שחולדה כבר. לא מציגה תגובה לצביטה ברגל</li>
	<li>להקריב חולדות באמצעות עריפת ראש מהירה באמצעות גיליוטינה.</li>
	<li>חותכים את העור מאחורי הגולגולת לקדמי וברור מראש הגולגולת.</li>
	<li>השתמש rongeurs להסיר בזהירות את החלק האחורי של הגולגולת, ולאחר מכן באמצעות מספריים מחתך קטן לחתוך את קו האמצע של הגולגולת, דוחף כלפי מעלה על החלק העליון של הגולגולת בכל עת כדי למנוע פגיעה רקמת המוח.</li>
	<li>השתמש rongeurs לקלף מימין ומשמאל חצי גולגולת כדי לחשוף את המוח.</li>
	<li>השתמשו במרית קטנה לסקופ תחת המוח והעצבים, העלה בזהירות את המוח והקפא את המוח באיזופנטאן צוננים על קרח יבש (לפחות 20 ° c). אחרי זה, לאחסן את המוח במקפיא של 80 ° c עד לחיתוך.</li>
	<li>פורסים את המוח באזורי עניין ב-30-50 יקרומטר בקריוסטט שנשמר בין-9 ° c ו-12 ° c. הרכב באופן ישיר פרוסות על שקופיות זכוכית ולאחסן במקפיא של 80 ° c עד הזמן של שיטת כימיה חיסונית. הערה: בפרוטוקול זה המוח אזורים של עניין היו ההיפוקמפוס ואת האמיגדלה.</li>
</ol>2. התגובה האימונוהיסטוכימיה היחידה
הערה: עבור תגובה אימונוהיסטוכימיה כפולה, הפרוטוקול הוא זהה התגובה החיסונית היחידה למעט התגובה הזו יש שני נוגדנים העיקרי של מארחים שונים (למשל, ארנב ועכבר) ושני נוגדנים משניים עבור המתאים המקדימות צריכה להיות מפונדקאי יחיד (למשל, אנטישפן עז וantimouse עיזים). גם הנוגדנים המשניים צריכים להיות משני ספקטרום שונה הזמינים בסורקים ברזולוציה גבוהה. לדוגמה, נוגדן משני אחד עם השיא ספקטרום פליטה ב 680 ננומטר ומשני נוגדן 800CW (הספקטרום פליטה שיא ב 780 ננומטר).
<ol><li>הסרת שקופיות זכוכית מן המקפיא ולאפשר שאיפה לטמפרטורת החדר עבור 30 דקות.</li>
	<li>מתחת למכסה המנוע, לתקן רקמת המוח ב 4% פאראמפורמלדהיד ב 0.1 מ פוספט מתכלה באגירה (PBS) עבור 1 על 2 על הטמפרטורה בחדר.</li>
	<li>לשטוף את השקופיות ב 0.1 מלוחים באגירה של M טריס (TBS) שלוש פעמים עבור 10 דקות כל אחד. ממברנות תאים מחלחלים על-ידי דגירה של שקופיות בתכשיר ניקוי קל (לדוגמה, 0.01% דטרגנטים) עבור 30-60 דקות.</li>
	<li>לשטוף שקופיות ב-TBS שלוש פעמים עבור 15 דקות כל אחד.</li>
	<li>לדלל את הנוגדן העיקרי עבור חלבון הריבית ב-PBS בריכוז הנכון. לדוגמה, כדי לזהות את הגן המיידי c-Fos מוקדם, להכין ארנב הראשי נגד c-Fos נוגדן בריכוז של 1:500.</li>
	<li>הנוגדן הראשוני הפתרון העיקרי ישירות על רקמת המוח (כ 200 μL לכל 3 אינץ ' x 1 שקופית אינטש).</li>
	<li>השתמש כיסוי כדי לדגירה את רקמת המוח על שקופיות זכוכית דילול הנוגדן העיקרי עבור או 1 על 2-h בטמפרטורת החדר או לילה (~ 17 h) ב 4 ° c.</li>
	<li>הסר שמיכות ולשטוף שקופיות ב-TBS כי יש כמות קטנה של חומרי ניקוי שנוספו לו (למשל, 0.01% סבון, "TBS-T") ארבע פעמים עבור 15 דקות כל אחד.</li>
	<li>השתמש כיסוי כדי דגירה סעיפים המוח בנוגדן משני בטמפרטורת החדר עבור 2 h. הערה: הנוגדן המשני צריך להיות לדילול הנכון בדילול המכיל TBS, אבקת כביסה, ו 1.5% של סרום מארח. לדוגמה, נוגדן משני עז בדילול של 1:2000 יכיל 1.5% סרום עז ו 0.05% כביסה.</li>
	<li>לשטוף שקופיות ב-TBS-T ארבע פעמים עבור 20 דקות כל אחד, ולאחר מכן ב-TBS ארבע פעמים עבור 20 דקות כל אחד.</li>
	<li>שקופיות יבשות בטמפרטורת החדר. בחשיכה, בן לילה כאשר השקופיות יבשות, הן מוכנות לדימות.</li>
</ol>3. הדמיה
<ol><li>מניחים שקופיות על ממשק הסריקה הכמעט-אינפרא-אדום כאשר הרקמה פונה כלפי מטה. התמונה מחליקה זכוכית אחת או שקופיות מרובות בכל פעם באמצעות כלי בחירה.</li>
	<li>שקופיות תמונה באמצעות הגדרת האיכות הגבוהה ביותר עם היסט של 0 ננומטר ורזולוציה של 21 μm. הסריקה בדרך כלל לוקח 13-19 h בהתאם לציוד הסריקה המשמש.</li>
	<li>יבא תמונות לתוך תוכנת ניתוח התמונה (לדוגמה, ImageStudio) כדי להציג ולסמן עבור ניתוח חלבון חצי כמותי.</li>
</ol>4. ניתוח ביטוי חלבון
<ol><li>פתח את תוכנת ניתוח התמונה ובחר באזור העבודה שאליו התמונה נסרקה.</li>
	<li>פתחו את התמונה הסרוקה בתוכנת ניתוח התמונה כדי להציג את הסריקה, וכוונן אילו אורכי גל יוצגו, כמו גם את הניגודיות, הבהירות וההגדלה המוצגים מבלי לשנות את התמונה הגולמית או את הפליטה הכוללת.</li>
	<li>זהה את אזורי המפתח עבור כימות ובחר את הכרטיסיה ניתוח לאורך החלק העליון של הדף ולאחר מכן בחר בצייר מלבן (או צייר אליפסה/צייר ביד חופשית) כדי לצייר מלבן מעל האזור שיוכמת. </li>
	<li>כדי להציג את גודל המלבן, בחר צורות לאורך החלק השמאלי התחתון של המסך ולאחר מכן בחר בעמודות לאורך החלק התחתון הימני. הוספת עמודות גובה ורוחב כדי לזהות את גודל הצורה. הערה: חשוב לשלוט בגודל הצורה בהשוואת הקוונפיקציה. מומלץ להשתמש בצורות זהות ממוקמות בתוך מיקום הקוונפיקציה הרצוי, כדי לקבל דגימה מדויקת של פליטות עבור אזור זה.</li>
	<li>לאחר מכן, ציין את שם הצורה וחזור על כך. לאחר שכל האזורים נדגמו, ניתן לצבור ולנתח את הנתונים הזמינים מהכרטיסיה עמודות .</li>
</ol>

<ol><li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKandel%2C+ER+%22Principles+of+Neural+Science%22">Principles of Neural Science</a>. , McGraw Hill. New York. (2013).</li>
<li>Byrne, J. H., Roberts, J. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aByrne%2C+JH+%22From+Molecules+to+Networks%3A+An+Introduction+to+Cellular+and+Molecular+Neuroscience%22">From Molecules to Networks: An Introduction to Cellular and Molecular Neuroscience</a>. , Academic Press/Elsevier. (2009).</li>
<li>Salami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+D2%2F3+binding+potential+modulates+neural+signatures+of+working+memory+in+a+load-dependent+fashion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dopamine D2/3 binding potential modulates neural signatures of working memory in a load-dependent fashion.</a> Journal of Neuroscience. , (2018).</li>
<li>Merali, Z., Khan, S., Michaud, D. S., Shippy, S. A., Anisman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+amygdaloid+corticotropin-releasing+hormone+%28CRH%29+mediate+anxiety-like+behaviors%3F+Dissociation+of+anxiogenic+effects+and+CRH+release%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Does amygdaloid corticotropin-releasing hormone (CRH) mediate anxiety-like behaviors? Dissociation of anxiogenic effects and CRH release.</a> European Journal of Neuroscience. 20 (1), 229-239 (2004).</li>
<li>English, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dataset+of+mouse+hippocampus+profiled+by+LC-MS%2FMS+for+label-free+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Data+in+Brief%22%5BJournal%5D)">Dataset of mouse hippocampus profiled by LC-MS/MS for label-free quantitation.</a> Data in Brief. 7, 341-343 (2016).</li>
<li>David, M. A., Tayebi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+protein+aggregates+in+brain+and+cerebrospinal+fluid+derived+from+multiple+sclerosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Detection of protein aggregates in brain and cerebrospinal fluid derived from multiple sclerosis patients.</a> Frontiers in Neurology. 5, 251(2014).</li>
<li>Oliver, C., Jamur, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemical+methods+and+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemical methods and protocols.</a> Methods in Molecular Biology. , (2010).</li>
<li>Spitzer, N., Sammons, G. S., Price, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autofluorescent+cells+in+rat+brain+can+be+convincing+impostors+in+green+fluorescent+reporter+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Autofluorescent cells in rat brain can be convincing impostors in green fluorescent reporter studies.</a> Journal of Neuroscience Methods. 197 (1), 48-55 (2011).</li>
<li>Knox, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+c-Jun+to+identify+fear+extinction+learning-specific+patterns+of+neural+activity+that+are+affected+by+single+prolonged+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Researach%22%5BJournal%5D)">Using c-Jun to identify fear extinction learning-specific patterns of neural activity that are affected by single prolonged stress.</a> Behavioural Brain Researach. 341, 189-197 (2018).</li>
<li>Knox, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuits+via+which+single+prolonged+stress+exposure+leads+to+fear+extinction+retention+deficits%5BTitle%5D)+AND+%22Learning+%26+Memory%22%5BJournal%5D)">Neural circuits via which single prolonged stress exposure leads to fear extinction retention deficits.</a> Learning & Memory. 23 (12), 689-698 (2016).</li>
<li>Malinow, R., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPA+receptor+trafficking+and+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity.</a> Annual Review of Neuroscience. 25, 103-126 (2002).</li>
<li>Nabavi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+a+memory+with+LTD+and+LTP%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Engineering a memory with LTD and LTP.</a> Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).</li>
<li>Kimmelmann-Shultz, B., Mohammadmirzaei, N., Della Valle, R., Knox, D. Using high resolution near infrared imaging to measure fear-learning induced changes in AMPA/NMDA ratios throughout the fear circuit. The Annual Delaware Neuroscience Research and Poster Symposium, Newark, DE, , (2018).</li>
<li>Eagle, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+prolonged+stress+enhances+hippocampal+glucocorticoid+receptor+and+phosphorylated+protein+kinase+B+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Single prolonged stress enhances hippocampal glucocorticoid receptor and phosphorylated protein kinase B levels.</a> Neuroscience Research. 75 (2), 130-137 (2013).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

התוצאות שהוצגו במאמר זה מראים כי קרוב-אינפרא-אדום אימונוציטוטוכימיה בשילוב עם סריקה ברזולוציה גבוהה ניתן להשתמש כדי לקבל אמצעים חצי כמותיים של ביטוי חלבון ברקמת המוח. זה יכול לשמש גם כדי לתייג שני חלבונים בו זמנית באותו אזור המוח. בעבר השתמשנו בשימוש קרוב-אינפרא אדום אימונוהיסטוכימיה כדי למדוד ביטוי גנטי מיידי מוקדם באזורים המוח מרובים9,10. גנים מוקדמים מיידיים יכולים לשמש כאמצעי לפעילות עצבית. כמו כן, אנו נתונים אלה מדדים חצי כמותיים של ביטוי חלבון לניתוחים סטטי...

המחקר של מדעי המוח חששות חקירה של איך תאים במוח מתווך פונקציות ספציפיות1. אלה יכולים להיות סלולריים בטבע כגון איך התאים גליה מעניקה חסינות במערכת העצבים המרכזית או יכול לכלול ניסויים שמטרתם להסביר כיצד הפעילות של נוירונים בהיפוקמפוס החלק המוביל לניווט מרחבי. במובן רחב, הפונקציה התאית נקבעת על ידי החלבונים המתבטאת בתא ואת הפעילות של חלבונים אלה2. כתוצאה מכך, מדידת הביטוי ו/או הפעילות של חלבונים בתאי המוח הם קריטיים לחקר מדעי המוח.
מספר טכניקות זמינות כדי למדוד ביטוי חלבון במוח. אלה כוללים בשיטות vivo כגון טופוגרפיה פליטת פוזיטרונים עבור צפיפויות הקולטן3 ו מיקרו-דיאליזה עבור פפטידים קטנים4. בדרך כלל, שיטות vivo ex משמשות כדי לבחון את תפקוד החלבון ואת הביטוי. אלה כוללים טכניקות ספקטרומטר המסה5, כתם מערבי ושיטת חיסוני מקושרת באמצעות אנזימים (אליסה)6, ואימונוציטוטוכימיה7. אימונוציטוכימיה נמצאת בשימוש נרחב בתחום המדעי המוח. טכניקה זו כוללת את השימוש בנוגדן העיקרי כדי לזהות חלבון (או אנטיגן) של עניין (g., c-Fos) ו נוגדן משני מצותת כדי לזהות את החלבון-העיקרי נוגדן קומפלקס (איור 1). כדי לאפשר זיהוי של החלבון-העיקרי נוגדן מורכב נוגדן, נוגדנים משניים יש סוכנים אוקסיגון כגון חזרת peroxidase (HRP) מעלה באוב להם. הדבר מאפשר היווצרות מאיצים בתאים שניתן לאתרם באמצעות מיקרוסקופ אור7. נוגדנים משניים יכולים להיות גם כימיקלים זרוח עלה באוב אותם (כלומר, fluorophores). כאשר מגורה אלה כימיקלים פולטים אור, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לזהות חלבון-ראשי נוגדן משני מכלולי נוגדנים7. לבסוף, לפעמים נוגדנים ראשוניים יש הפחתת סוכנים וכימיקלים פלואורסצנטית המצורפת אליהם ישירות לאשר את הצורך נוגדנים משניים7 (איור 1).
מעניין, הרבה שיטות אימונוציטוטוקכימיה לאפשר ויזואליזציה של חלבונים בתאי המוח, אבל לא את היכולת לכמת את כמות החלבון בתא מסוים או באזור המוח. שימוש במיקרוסקופיה קלה לאיתור מאיצים מתגובות הפחתת מאפשר ויזואליזציה של נוירונים ו גליה, אבל שיטה זו אינה יכולה לשמש לכמת ביטוי חלבון בתאים או באזור המוח מסוים. בתאוריה, מיקרוסקופ ניאון ניתן להשתמש בשביל זה, כי האור הנפלט הנוגדן משני פלורסנט הוא מדד של החלבון-העיקרי נוגדנים משני נוגדנים מורכבים. עם זאת, פלואורסצנטית אוטומטי ברקמת המוח יכול להקשות על השימוש מיקרוסקופ פלואורסצנטית כדי לכמת את הביטוי חלבון רקמת המוח8. כתוצאה מכך, אור הנפלט מתמונות פלורסנט של רקמת המוח משמש לעתים רחוקות כדי לכמת את הביטוי חלבון במוח.
רבים מהנושאים הללו ניתן לטפל באמצעות באמצעות אינפרא-אדום האימונוציטוכימיה בשילוב עם סריקה ברזולוציה גבוהה9,10. במאמר זה, אנו מתארים כיצד משולבים כימיה חיסונית עם fluorophores בספקטרום הפליטה הקרוב-אינפרא אדום ניתן לשלב עם סריקה ברזולוציה גבוהה (g., 10 – 21 μm) כדי לקבל תמונות חדות המאפשרות כימות החלבון בנפרד אזורי המוח.

<table><tbody><tr><td>מיצוי</td><td></td><td></td><td></td>מוח</tr><tr><td>הרדמה תא אינדוקציה</td><td>קנט סיינטיפיק</td><td>VetFlo-0530SM</td><td></td></tr><tr><td>קליין גיליוטינה</td><td>מכשיר הרווארד</td><td>73-1920</td><td></td></tr><tr><td>פרידמן רונגור</td><td>פיין מדע כלים</td><td>16000-14</td><td>המשמשים להסרת החלק האחורי של הגולגולת</td></tr><tr><td>מספריים חיתוך עדינים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>08-951-5</td><td>משמש לחיתוך כלפי מעלה לאורך קו האמצע של הגולגולת</td></tr><tr><td>מיקרו מרית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>21-401-5</td><td>משמש להוצאת</td></tr><tr><td>מוח זכוכית מיקרוסקופ שקופיות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-549-6</td><td></td></tr><tr><td>תגובה</td><td></td><td></td><td></td> אימונוהיסטוכימית</tr><tr><td>&nbsp; Triton X-100</td><td></td><td></td><td>משמש כחומר ניקוי עדין לחדירת תאים לאחר קיבוע ב-Paraformaldehyde, משמש גם כחומר ניקוי עדין בשילוב עם סרום מארח ונוגדנים משניים&nbsp;</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td></td><td></td><td>משמש ככמות קטנה של חומר ניקוי שנוספה ל-TBS&nbsp; כדי להשיג TBS-T לאחר החלקת שקופיות עם הנוגדן העיקרי</td></tr><tr><td>סורק Licor Odyssey Licor</td><td>Biotechnology Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סטודיו אימג'</td><td>ליקור ביוטכנולוגיה בע"מ</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

שימוש בקרוב-אינפרא אדום פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה סריקה למדוד חלבון הביטוי במוח מכרסם

Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain

מדעי המוח הוא חקר כיצד תאים במוח בתווך פונקציות שונות. מדידת חלבון הביטוי בנוירונים ו glia היא קריטית לחקר מדעי המוח כפונקציה תאית נקבעת על ידי הרכב ופעילות של חלבונים סלולריים. במאמר זה, אנו מתארים כיצד ניתן לשלב את היכולות האימונולוציטוכימיה עם סריקה ברזולוציה גבוהה-אינפרא-אדום כדי לספק מידה חצי כמותית של ביטוי חלבון באזורי מוח נפרדים. ניתן להשתמש בטכניקה זו לביטוי חלבון יחיד או כפול באותו אזור המוח. מדידת חלבונים בצורה זו יכולה לשמש כדי לקבל שינוי יחסי בביטוי חלבון עם מניפולציה ניסיוני, חתימה מולקולרית של למידה וזיכרון, פעילות במסלולים מולקולריים, ופעילות עצבית באזורי מוח מרובים. ניתן לקבוע באמצעות החלבונים והניתוחים הסטטיסטיים הנכונים, קישוריות פונקציונלית בין אזורי מוח. בהתחשב בקלות של יישום כימיה חיסונית במעבדה, שימוש באמצעות אימונולוציטוכימיה עם סריקה ברזולוציה גבוהה-אינפרא-אדום יכול להרחיב את יכולת הנוירומדען לבחון תהליכים נוירויולוגיים ברמת מערכות.

לפני שימוש בסריקה ברזולוציה גבוהה עבור אימונוהיסטוכימיה, יש לוודא כי הפרוטוקול פועל. זה יכול להתבצע באמצעות בדיקת אימות שבו סעיפים המוח מאותו בעל חיים מודבטים עם נוגדנים הראשי והמשני, הנוגדן המשני בלבד, או לא העיקרי או נוגדן משני. תוצאות עבור שיטת אימות מסוג זה מוצגות באיור 2. בתגובה זו אנו מזהים את הגן המיידי c-Jun מוקדם בהיפוקמפוס והאמיגדלה. ביטוי C-Jun נצפה רק כאשר נוגדנים ראשוניים ומשניים הוחלו על רקמת המוח.
<p class="jove_content" fo:keep-together.wi...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול העושה שימוש בצבעים ליד אינפרא-אדום בשילוב עם האימונוהיסטוכימיה וסריקה ברזולוציה גבוהה כדי לאשר את החלבונים באזורי המוח.

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study ...

פרוטוקול זה הוא משמעותי משום שהוא מאפשר כימות של שני חלבונים באותו אזור במוח. זה מאפשר לניסוי להסתכל על פעילות במסלולי איתות מולקולריים באזורי המוח על ידי בדיקת מחבת ופוספופרוטאינים. זה יכול לשמש גם כדי לסמן חלבונים כי הם סמנים של תופעות קוגניטיביות שונות.אנו משתמשים בטכניקה פשוטה יחסית, כגון אימונוהיסטוכימיה, כדי לענות על שאלות הדורשות בדרך כלל טכניקות מעורבות יותר. כולל בחינת הפעילות של מסלולי איתות מולקולריים, בחינת יחס אמפא/NMDA. באמצעות קריוסטט המתוחזק בין מינוס 9 מעלות צלזיוס למינוס 12 מעלות צלזיוס, פרוסת מוח חולדה מבודד וקפוא בעבר באזורים מעניינים ב 30-50 מיקרומטר.יש להרכיב פרוסות ישירות על מגלשות זכוכית ולאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לאימונוציטוכימיה. מוציאים את מגלשות הזכוכית מהמקפיא ומאפשרים להן לצייד לטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. עובדים מתחת למכסה המנוע של האדים, מניחים את המגלשות בפרפורמלדהיד של 4% ב-PBS טוחן למשך שעה עד שעתיים בטמפרטורת החדר לצורך קיבוע רקמות.לאחר מכן לשטוף את השקופיות ב 0.1 TBS טוחן שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד. כדי לחלחל קרום התא, להדק את השקופיות בחומר ניקוי קל במשך 30-60 דקות. ולשטוף שוב ב TBS שלוש פעמים במשך 15 דקות כל אחד.לדלל את הנוגדן העיקרי עבור חלבון עניין PBS בריכוז הנכון כמתואר בכתב היד. פתרון הנוגדן העיקרי של פיגט ישירות לרקמת המוח. מניחים תלושי כיסוי על המגלשות ומדגרים את רקמת המוח בדילול נוגדנים ראשוני למשך שעה עד שעתיים בטמפרטורת החדר.לאחר הדגירה, להסיר את החלקות המכסה ולשטוף את השקופיות ב- TBS כי יש כמות קטנה של חומר ניקוי הוסיף אליו, ארבע פעמים במשך 15 דקות כל אחד. מדללים נוגדן משני בדילול המכיל TBS, חומר ניקוי ו-1.5% מהנסיוב המארח. מוסיפים נוגדן משני לשקופיות, מכסים בהחלקות כיסוי ודגירה בטמפרטורת החדר במשך שעתיים.לאחר הדגירה, לשטוף את השקופיות ב- TBS-T ארבע פעמים במשך 20 דקות כל ולאחר מכן ב- TBS ארבע פעמים במשך 20 דקות כל אחד. יבש את המגלשות בטמפרטורת החדר בחושך, לילה. מקם שקופיות על ממשק סריקה כמעט אינפרא-אדום כאשר הרקמה פונה כלפי מטה.תמונה של שקופיות מרובות בכל פעם באמצעות כלי הבחירה. תדמיין את השקופיות בהגדרה באיכות הגבוהה ביותר ברזולוציה של 21 מיקרומטר. בקיזוז של אפס ננומטרים, יבא תמונות לתוכנת ניתוח תמונה כדי להציג ולסמן לניתוח חלבונים חצי-קונטיטיבי.לאחר פתיחת תוכנת ניתוח התמונה, בחר את אזור העבודה שאליו נסרקה התמונה. לאחר מכן פתחו את התמונה הסרוקה בתוכנת ניתוח התמונות כדי להציג את הסריקה ולהתאים אורכי גל, ניגודיות, בהירות והגדלה המוצגים מבלי לשנות את התמונה הגולמית או את הפליטה הכוללת לכימות. לאחר זיהוי אזורי המפתח לכמות, בחר בכרטיסיה ניתוח לאורך החלק העליון של הדף ולאחר מכן בחר מלבן ציור כדי לצייר מלבן מעל האזור שיכומת.כדי להציג את גודל המלבן, בחר צורות לאורך החלק הימני התחתון של המסך. לאחר מכן בחר עמודות לאורך הימנית התחתונה. לאחר מכן הוסף עמודות גובה ורוחב כדי לזהות את גודל הצורה.לבסוף, תן שם לצורה וחזור על הפעולה. לאחר דגימת כל האזורים, המשך בשילוב וניתוח של הנתונים הזמינים בכרטיסיה עמודות. כדי לוודא שהפרוטוקול הזה עובד, חלקי המוח היו דגירה עם נוגדנים ראשוניים ומשניים, נוגדן משני בלבד, או לא נוגדן ראשוני ולא משני.ביטוי הגן המוקדם המיידי c-jun זוהה בהיפוקמפוס הגבי ובאמיגדלה רק כאשר שני נוגדנים ראשוניים ומשניים הוחלו על רקמת המוח. יחידת משנה GluR1 של קולטן אמפא ותת-היחידה NR2A של קולטן NMDA הושפעו בזיהוי חלבון הצואה בגרעיני האמיגדלה. זה איפשר לבחון את היחס של קולטני AMPA NMDA בתת גרעינים של האמיגדלה שהיא חתימה נוירוביולוגית של למידה וזיכרון.אמצעים מרושעים ומנורמלים של ביטוי חלבון התקבלו מסריקות ברזולוציה גבוהה בהיפוקמפוס הגחון. באמצעות תוכנת ניתוח התמונה, מלבן ממוקם באזור העניין ועוצמת האור הממוצעת מהצורה שימשה כמדד לביטוי פלואורופור, שהוא מדד לביטוי חלבון. כדי להשיג את העקומה המנורמלת, צורה הונחה על פני אזור המבטא אות גבוה ואות נמוך באזור מתחת לעקומה שימש כמדד לביטוי חלבון.המאבק הגדול ביותר בהליך זה הוא מציאת נוגדן ולוודא שהוא עובד. היישום הוא פשוט. העצה שלי תהיה קודם לנסות הליך אימונוהיסטוכימי רגיל, ואז לנסות את הטכניקה הזו.תמיד מבצע בדיקת אימות תחילה. הדבר החשוב ביותר לזכור הוא לבדוק את דילול הנוגדנים שלך ולוודא שהוא מיושם כראוי. ללא שלבים אלה, ההליך ייכשל.

using-near-infrared-fluorescence-high-resolution-scanning-to-measure

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

כאן אנו מתארים שיטה מהירה ופשוטה תאים תמונה שכותרתו fluorescently למחצה עבה פרוסות המוח. על ידי תיקון, חיתוך, ואת אופטית ניקוי רקמת המוח אנו מתארים כיצד הדמיה epifluorescent או confocal רגיל יכול לשמש כדי לחזות תאים בודדים ורשתות נוירונים בתוך רקמת העצבים ללא פגע.

גישה מהירה הדמיה ברזולוציה גבוהה הקרינה חצי עבה פרוסות המוח

סרטון זה מדגים את הצביעה האימונופלואורסצנטית של פרוסת מוח עכבר כדי לכמת את ההתפלגות של חלבון קדם-סינפטי מסוים. התהליך כולל חסימת אתרים לא ספציפיים, החלת נוגדנים ראשוניים לחלבון המטרה וסמן ייחוס, ולאחר מכן תיוג נוגדנים משני והכתמת נגד גרעינית. סמן הייחוס מבטיח כימות מדויק על ידי מתן קו בסיס עקבי, והתפלגות החלבון הפרה-סינפטי מנותחת על פני אזורי מוח באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.

כימות התפלגות חלבון פרסינפטי במוח עכבר באמצעות אימונופלואורסנציה

מקור: Jolly, S., et.al. שילוב של פלואורסצנציה כפולה  בהכלאה באתר עם תיוג חיסוני לזיהוי ביטוי של שלושה גנים במקטעי מוח של עכברים. J. Vis. Exp. (2016). סרטון זה מדגים את השימוש בפלואורסצנציה כפולה בהכלאה באתרה כדי לדמיין את הביטוי של שתי מטרות RNA במקטעי מוח של עכברים. הפרוטוקול כולל זיהוי רציף של RNA באמצעות בדיקות המסומנות בפלואורסצאין איזותיוציאנט ודיגוקסיגנין, ואחריו הגברת אות אנזימטית להגברת הרגישות. הקרינה המתקבלת מאפשרת ניתוח לוקליזציה משותפת של רנ"א המטרה בתוך הרקמה.

 ביצוע הכלאה של פלואורסצנציה כפולה באתרה לאיתור ביטוי גנים במקטעי מוח של עכבר

מקור: Kimmelmann-Shultz, B., et. al. שימוש בקרינה קרובה לאינפרא-אדום וסריקה ברזולוציה גבוהה למדידת ביטוי חלבון במוח המכרסמים. J. Vis. Exp. (2019) סרטון זה מדגים פלואורסצנציה קרובה לאינפרא-אדום ושיטת סריקה ברזולוציה גבוהה למדידת ביטוי חלבון במוח המכרסם.

מדידת ביטוי חלבונים במוח מכרסמים באמצעות פלואורסצנציה קרובה לאינפרא אדום וסריקה ברזולוציה גבוהה 

מקור: Lacin, E., et al. בניית מדווחים מהונדסים פלואורסצנטיים מבוססי תאים (CNiFERs) לזיהוי אופטי של נוירוטרנסמיטורים in vivo. J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מדגים טכניקה להדמיית שחרור נוירוטרנסמיטר in vivo באמצעות מדווחים מהונדסים פלואורסצנטיים מבוססי תאים (CNiFERs), תאי דיווח מיוחדים שהוזרקו מראש לקליפת העכבר. העכבר ממוקם תחת מיקרוסקופ של שני פוטונים, ומאפשר הדמיה של איתות סידן המושרה על ידי נוירוטרנסמיטר באמצעות פליטת פלואורסצנטיות. השיטה ממנפת קשירת נוירוטרנסמיטורים לקולטנים מצומדים לחלבון G...

שחרור נוירוטרנסמיטר הדמיה באמצעות נוירוטרנסמיטר מבוסס תאים מדווחים מהונדסים פלואורסצנטיים

מטרת פרוטוקול זה היא להשתמש בטכניקת מיון תאים מופעלים פלואורסצנטיים (FACS) כדי למיין סוגים ספציפיים של תאים עצביים לניתוח עוקב של ביטוי גנים ספציפיים לסוג התא, סמנים אפיגנטיים ו/או ביטוי חלבון.

ביטוי גנים מסוג התא ספציפי באמצעות סלולארי קרינה המופעל מיון לבדיקת רקמות במוח החולדה

סרטון זה מציג את הליך הגולגולת המאפשר הדמיה כרונית של נוירונים בקליפת המוח הרטרו-טחולית של העכבר באמצעות מיקרוסקופ פוטונים שני פוטונים in vivo בקו טרנסגני Thy1-GFP. גישה זו משולבת עם הזרקת נגיף הקשור לאדנו המבטא mCherry לתוך ההיפוקמפוס הגבי. טכניקות אלו מאפשרות ניטור ארוך טווח של פלסטיות מבנית תלוית ניסיון ב-RSC.

שני פוטונים סימולטני<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של תשומות Synaptic ויעדי Postsynaptic בקליפת עכבר Retrosplenial

פרוטוקול זה מתאר את השלבים הדרושים כדי להשיג תוצאות לוקליזציה חלבון subcellular על דג זברה הרשתית על ידי התאמת מיקרוסקופ אור סופר רזולוציה וסריקת תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים.

רזולוציה סופר correlative ואלקטרון לפתרון חלבון לוקליזציה ברשתית דג זברה

כאן, אנו מתארים גישה כמותית לקביעת ההתפלגות של חלבון סינפטית יחסית חלבון סמן באמצעות צביעת immunofluorescence ', ' מיקרוסקופיה קונפוקלית, וניתוח מבוססת מחשב.

לכימות ההתפלגות הטרוגנית של חלבון סינפטיים במוח העכבר בעזרת Immunofluorescence

פרוטוקול זה נועד ביעילות לכמת אוביקוויב-פרוטאסדום מערכת (UPS) פעילות בתאים סלולריים שונים של המוח מכרסם. משתמשים יכולים לבחון את התפקוד UPS בתוך שברים גרעיניים, cytoplasmic וסינפטית באותו בעל חיים, הפחתת כמות הזמן ומספר בעלי החיים הדרושים כדי לבצע ניתוחים אלה מורכבים.

בדיקת כימות משנית אוביקוויאין-פעילות פרוטאסדום במוח מכרסם

אנו מדווחים על בדיקה פשוטה, יעילה בזמן וספקטרוסקופיה מבוססת תפוקה גבוהה לכימות סיבי אקטין בדגימות ביולוגיות אקס ויוו מרקמות המוח של מכרסמים ונבדקים אנושיים.

בדיקה מבוססת ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית חסכונית בזמן להערכת מצב פולמור Actin במכרסמים ורקמות מוח אנושיות

למד שיטת סריקת אינפרא-אדום קרוב פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה לכימות חלבונים באזורי מוח ספציפיים בעכברוש. הפרוטוקול מאפשר ניתוח מסלולי מולקולריים וסמני קוגניציה בנוירוביולוגיה.

שימוש בקרוב-אינפרא אדום פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה סריקה למדוד חלבון הביטוי במוח מכרסם

גלה סרטונים נוספים