יישום של ביואולייר אינטרפרומטריה (בלי) ללימוד אינטראקציות חלבונים-חלבונים בתמלול

אינטראקציות של גורמי שעתוק (TFs) עם RNA פולימראז הם בדרך כלל לומדים באמצעות הנפתח assays. אנו מיישמים טכנולוגיה של ביואולייר אינטרפרומטריה (בלי) כדי לאפיין את האינטראקציה של GrgA עם לא RNA פולימראז. בהשוואה למטה מוסר, בלי מזהה בזמן אמת שיוך ודיסוציאציה, מציע רגישות גבוהה יותר, והוא כמותי מאוד.

אינטראקציה חלבון-חלבון שעתוק נחקרה באופן מסורתי באמצעות דיאליזה Por. עם זאת, דיאליזה פור הם כמותיים לחלוטין. אנו משתמשים אינטרפרומטריה קוטל ביולוגי, או BLI, כדי להתגבר על בעיה זו.

בהשוואה לפור דן, BLI מזהה שיוך ודיסוציאציה בזמן אמת בין שותפי מליטה. היא גם מייצרת פרמטרים קינטיים כמותיים, המעידים על מנגנוני אינטראקציה. טכנולוגיית BLI אולי נשמעת מאיימת, אבל זה לא קשה ללמוד להשתמש בטכנולוגיה זו, אחד צריך לקבל את הגישה למכשיר BLI ואת התוכנה הקשורה.

סרטון וידאו זה יאפשר לך להסתגל בקלות לטכנולוגיה של BLI. כ -10 דקות לפני תחילת בדיקה, פיפטה 200 microliters של מאגר BLI לתוך צינור PCR. הסר biosensor ניקל NTA מן האריזה המקורית על ידי החזקת החלק הרחב של biosensor באמצעות יד כפפה.

מניחים את biosensor מעל צינור PCR כך שרק קצה הזכוכית של biosensor שקוע במאגר BLI. שמור על קצה biosensor שקוע לפחות 10 דקות כדי להבטיח הידרציה מלאה. תדליק את מכונת הבליץ.

ודא שהמחשב מחובר למחשב באמצעות יציאת פלט נתוני USB בחלק האחורי של המחשב. במחשב, פתח את התוכנה המשויכת ולחץ על Advanced Kinetics בצד שמאל של המסך. בתוכנה, הקלד את כל המידע המתאים אודות הניסוי תחת כל כותרת בהתאמה.

לחץ על סוג Biosensor ובחר ניקל NTA מהתפריט הנפתח. ניתן לשנות את משך כל שלב כברירת מחדל לפי הצורך. לקבלת תוצאות מיטביות, השתמש במינימום של 30 שניות עבור התוכנית הבסיסית והתופעה הבסיסית ההתחלתיות ו- 120 שניות עבור שיוך ודיסוציאציה.

הסר את biosensor ניקל hydrated NTA מצינור PCR ולהדביק אותו להר biosensor על המכונה על ידי החלק הרחב של biosensor על ההר. מניחים צינור מיקרוצנטריפוגה שחור 0.5 מיליליטר לתוך מחזיק הצינור של המכונה ואת פיפטה 400 microliters של חיץ BLI לתוכו. סגור את המכסה של המכונה כך קצה biosensor הופך שקוע במאגר בצינור microcentrifuge.

לחץ על הבא בתוכנה כדי להתחיל בהקלטת התוכנית הבסיסית הראשונית. לאחר סיום ההקלטה של השלב הבסיסי הראשוני, פתח את העטיפה של המחשב. הזז את המחוון ימינה, כך שמחזיק הירידה ממוקם מול החץ השחור.

פיפטה ארבעה מיקרוליטרים של ליגנד מתויג שלו על מחזיק הירידה ולסגור את העטיפה של המכונה, אשר יתחיל באופן אוטומטי להקליט את שלב הטעינה. לאחר סיום שלב הטעינה, פתח את כיסוי המחשב. הזז את המחוון שמאלה, כך מחזיק הצינור ממוקם שוב מול החץ השחור.

סגור את המכסה של המכונה וודא כי קצה biosensor הוא שקוע לתוך מאגר BLI של הצינור במחזיק הצינור. המחשב והתוכנה יתחילו באופן אוטומטי להקליט את השלב הבסיסי. לאחר סיום ההקלטה בשלב הבסיס, פתח את העטיפה של המחשב.

הסר את מחזיק הירידה ונקה אותו על ידי צינור החוצה כל חלבון ושטיפת אותו עם מים deionized כפול במשך חמש פעמים בסך הכל. השתמש לנגב רקמה כדי לנקות את פני השטח של מחזיק טיפה לאחר לשטוף האחרון. החלף את מחזיק השחרר בחזרה למכונה.

הזז את המחוון במחשב ימינה, כך שמחזיק הירידה ממוקם שוב מול החץ השחור. פיפטה ארבעה microliters של analyte דיאליזה על מחזיק טיפה ולסגור את הכיסוי של המכונה, אשר יתחיל באופן אוטומטי להקליט את שלב העמותה. לאחר ששם השיוך יסיים את ההקלטה, פתח את העטיפה של המחשב.

הזז את המחוון על המכונה ימינה, כך מחזיק הצינור ממוקם שוב מול החץ השחור ולסגור את המכסה של המכונה, אשר יתחיל באופן אוטומטי להקליט את שלב הדיסוציאציה. לאחר שלב הדיסוציאציה סיים להקליט, לפתוח את הכיסוי של המכונה ולהסיר את מחזיק טיפה מחזיק צינור. שטפו היטב את שניהם במים כפולים כדי לשטוף כל חלבון.

הסר את הביו-סנסור והשליך אותו בבטחה. חזור על שלבים אלה עבור אותו זוג אאנליט ליגנד באמצעות ריכוזי אנליט שונים. לאחר סיום כל הריצות, שמור את הנתונים בתוכנה על-ידי לחיצה על קובץ ושמור ניסוי בשם בצד הימני של המסך.

תחת הכותרת הפעל נתונים, בחר תיקון שלבים והתאימה אחד לאחד ולחץ על נתח כדי ליצור נתונים קינטיים. כדי לחלץ את הנתונים הכמותיים לגליון עבודה וליצור גרפים, לחץ על יצא ל- CSV ושמור את הנתונים המוקלטים כקובץ CSV. פתח את קובץ ה- CSV באמצעות תוכנת גיליון אלקטרוני.

GrgA באורך מלא עשוי 288 חומצות אמינו. כפי שמוצג כאן, 28 חומצות אמינו באזור האמצעי קושר סיגמא 28 ישירות. כאן האזור האמצעי שתויג עם מסוף קצה התג שלו שימש כליגנד, אשר היה משותק לראשונה לקצה של ניקל NTA biosensor.

הקלטות של ניסויים עם שלושה ריכוזי אנליט שונים כל אחד מתחיל 30 שניות לפני קשירה ligand ומסתיים שתי דקות לאחר תחילת הכביסה האחרונה מוצגים. תצוגה חזותית משופרת של שיוך ודיסוציאציה של ליגנד אאנלייט מוצגת לאחר הסרת ערכים בשני השלבים הראשונים ואיפוס התוכנית הבסיסית. לאחר שטיפת לא מאוגד מסוף GrgA מתויג שלו 138 כדי 165 את biosensor, קשר בזמן אמת עם analyte נרשם בעקבות התוספת של סיגמא 28.

לבסוף, הדיסוציאציה בזמן אמת נרשמה לאחר הכביסה. לפני בדיקת BLI, גליצרול מוסר מ ligands ו analytes. אנו ממליצים כי BLI תבוצע זמן קצר לאחר הדיאליזה כפי שנדון בטקסט.

לאחר אפיון אינטראקציות חלבון-חלבון בתעתיק עם BLI, ניתן לחקור כיצד האינטראקציה משפיעה על התחלת שעתוק, התארכות או סיום.