Name: הקלטה אופטית חד-שלמה של פוטון בפרוסות מוח באמצעות שימוש במתח-צבע רגיש (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: למד הקלטה אופטית יציבה של פעילות עצבית בפרוסות היפוקמפוס מעכבר באמצעות צבע רגיש למתח. השיטה מאפשרת תצפית אמינה לאורך 12 שעות על דינמיקה של מעגלים מוחיים ותגובות לגירויים חשמליים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

TT קיבל את JSPS KAKENHI גרנט (JP16H06532, JP16K21743, JP16H06524, JP16K0038, ו JP15K00413) מ MEXT ומענקים מהמשרד לבריאות, עבודה ורווחה (MHLW-kagaku-ippan-H27 [15570760] ו H30 [18062156]). אנחנו רוצים להודות לנומרולאין (www.editage.jp) לעריכת שפה באנגלית.

כל הניסויים בבעלי חיים נערכו על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים והשתמש באוניברסיטת טוקאשימה בוני. הפרוטוקול הבא להכנת פרוסה הוא כמעט הליך סטנדרטי27 , אבל השינויים היו הפרוטוקולים של כתמים והקלטה עם vsd.
1. הכנה לפני יום הניסוי
<ol><li>הכינו את המניה A (טבלה 1), מניות B (טבלה 2) ומניות C (שולחן3) פתרונות וחנות במקרר.</li>
	<li>להכין 1 L של נוזל מלאכותי שדרתי (ACSF) (שולחן 4, ראה שלב 3) ולשמור אותו במקרר.</li>
	<li>להכין 1 L של השתנה ACSF (שולחן 5) ולשמור אותו במקרר.</li>
	<li>מדבקות 500 μL של סרום של שור עוברי (FBS) ב -2 מבחנות mL וחנות במקפיא.</li>
	<li>מתמוסס 4% של אבקת אגר ב ACSF (ca. 120 mL) במיקרוגל ויוצקים אותו בצלחת פטרי 90 מ"מ חד פעמי. הצלחת אגר צריך להיות בקירור לפני שימוש נוסף.</li>
	<li>מניחים את הפריטים הבאים במקפיא ביום לפני הניסוי: מגש כירורגי, מכולה מבצעה ובלוק קירור אלומיניום (120 x 120 x 20 מ"מ3).</li>
	<li>ודא כי יש מספיק טבעות פלקסיגלס עם מסנני קרום עבור מערכת טיפול בפרוסה17,28 (ראה שלב 6.12).</li>
	<li>התמוססות 2% של אבקת אגר ב 50 mL של 3 M KCl במיקרוגל. לקחת סביב 85 μL של החמים אגר-KCl מדלל ב 200 μL טיפים באמצעות מיקרופיפטה עבור האלקטרודה ההארקה. לנתק את הקצה לתוך החמים עדיין אגר 3 M KCl ג'ל. חזור על השלב כדי למלא על 20-40 טיפים עם 2% אגר.</li>
</ol>2. הכנת VSD (di-4-ANEPPS) פתרון מניות
<ol><li>הכינו 1 מ ל של 10% polyethoxylated קיק שמן תמיסה עם מים אולטרה טהורים.</li>
	<li>הוסף 1 mL של אתנול לבקבוקון של די-4-ANEPPS (5 מ"ג בקבוקון), מערבולת ו sonicate עבור 10 דקות. הפתרון יהפוך לצבע אדום עמוק עם שאריות קטנים אפשריים של גבישי di-4-ANEPPS. הערה: האתנול המשמש בשלב זה צריך להיפתח טרי.</li>
	<li>העבר את הפתרון למיקרו-שפופרת של 2 מ ל עם טבעת או. ספין את הפתרון ולהוסיף 500 μL של 10% polyethoxylated קיק שמן פתרון. הערה: . הצבע הוא בלייפופילית מאוד DMSO ו poloxamer יכול לשמש גם כדי לפזר di-4-ANEPPS אבל במונחים של האות האופטי על שינוי פוטנציאל הממברנה, מצאנו כי השימוש של אתנול-polyethoxylated קיק שמן נותן סימן טוב יותר ליחס הרעש. זה יכול להיות קשור לשיעור העברה של הממס כדי קרום התא.</li>
	<li>וורטקס וsonicate עד שהצבען. הומס לחלוטין</li>
	<li>הימנע מחשיפה לאור ושמור אותו במקרר. . אל תאחסן במקפיא המניה יכולה להימשך. כמה חודשים הערה: ביום הניסוי, בצע את השלבים 3-9.</li>
</ol>3. הכנת היום של ACSF (1 L) (שולחן 4)
<ol><li>שוקלים את הקול, נחקו3וגלוקוז בבקבוקון.</li>
	<li>הוסף 950 mL של מים מזוקקים לבקבוקון ולהתחיל מבעבע עם 95% O2/5% CO2 גז.</li>
	<li>הוסף 2.5 mL של מלאי פתרון הבקבוקון ואת הדגירה עבור כ 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הוסף 2.5 mL של פתרון המניה C לבקבוקון.</li>
	<li>הוסיפו מים מזוקקים כדי להפוך את הפתרון ל-1 ל.</li>
</ol>4. הכנת העיתון היומי של ה-VSD
<ol><li>Sonicate a 500 μL בקבוקון של FBS ו-VSD פתרון מניות (שלב 2) ב ultra-sonicator עבור 5 דקות.</li>
	<li>הוסף 500 μL של ACSF טרי הכין לתוך בקבוקון של FBS.</li>
	<li>להוסיף 20 (במקרה של עכברים) או 40 (במקרה של חולדות) μL של פתרון מניות VSD לבקבוקון.</li>
	<li>Ultra-sonicate ומערבולת הבקבוקון עד הפתרון הופך כתום חיוור.</li>
</ol>5. הכנה לכירורגיה
<ol><li>לקחת 100 mL של ACSF מקורר בנפרד בתוך מיכל נירוסטה 300 mL, מיכל של 300 mL, מכולה פלסטיק, ולמקם אותם במקפיא. יוצקים 150 מ ל של מקורר שונה ACSF (שולחן 2) בגביע אחר ומניחים אותו במקפיא. המתן עד שהפתרונות מצוננים; יש למדוד את הזמן ולקבוע מראש.</li>
	<li>מקפלים לשבור להב תער (פחמן פלדה, כיתה תעשייתית 0.13 מ"מ עבה, להב משני הצדדים) לחצי עבור הפורס. הערה: החצי השני יכול לשמש לחיתוך עם מחזיק להב מתאים.</li>
	<li>להכין בלוק מן ACSF 4% הצלחת אגר עם ג ' כוונון (איור 1).</li>
	<li>הכינו תא דגירה לח (חדר ממשק סוג; a שונה 1.2 L אטום התיבה הצמודה עם אריזת סיליקון) לשמירת פרוסות המוח בחיים מבחינה פיזיולוגית (איור 2); להוסיף ACSF במיכל קטן פחמתי עם 95% O2/5% CO2 גז, ולמלא 90 מ"מ x 20 מ"מ צלחת פטרי עם acsf ב למעלה. הערה: צלחת פטרי קטנה יותר (60 מ"מ x 20 מ"מ) צריך להיות ממוקם במרכז הצלחת 90 mm כדי לתמוך נייר סינון על המנה.</li>
	<li>שים את התיבה על מכשיר חימום ולחכות 20 דקות כדי לחמם אותו עד 28 ° c.</li>
	<li>הוסיפו קרח כתוש לתוך המיכל של הפורס. מניחים את הכלים הבאים בתוך המע מ נירוסטה (קטן) על הקרח: אזמל, מחזיק להב, מלקחיים צלצול, בלוק אגר, ובשלב של פורס. לשמור קפוא ACSF ו-ACSF שונה על קרח בועה עם 95% O2/5% CO2 גז (aka. קרבוגן).</li>
	<li>הניחו את הכלים הבאים בתוך מע (גדול): מספריים (גדולים, קטנים), מלקחיים, מרית, כף ופלייר אלכסוני.</li>
</ol>6. כירורגיה (עכברים)
<ol><li>להשתמש בעכבר באמצעות. " העריכו את רמת ההרדמה על ידי בדיקת רפלקס הדוושה של החיה על צביטה בבוהן.</li>
	<li>ערוף את ראשו של העכבר ולטבול את הראש בקרח קר ACSF במגש כירורגי נירוסטה.</li>
	<li>לחלץ את המוח בתוך 1 דקות ולמקם אותו בגביע המכיל ACSF מקורר עבור 5 דקות.</li>
	<li>להוציא את המוח מתוך הגביע, באמצעות אזמל, לקצץ את המוח בלוק (איור 3A).</li>
	<li>מניחים את המוח בלוק על 4% אגר בלוק (שלב 5.3, איור 3B). שתי האונות ניתן לרכוב על בלוק אגר. לנגב את העודף ACSF מן הבלוק עם נייר סינון.</li>
	<li>החלת דבק דק (דבק סופר) לשולחן הפורס. מניחים את בלוק אגר על זה ולנגב את עודף דבק באמצעות נייר סינון.</li>
	<li>בעדינות להחיל כמות קטנה של הקרח קר ACSF (~ 5 mL) באמצעות פיפטה מראש בלוק המוח-אגר. זה יעזור לחזק את הדבק העודף ולמנוע את הדבק מכיסוי המוח ולהטריד את החיתוך.</li>
	<li>תקן את הטבלה מבצעה למגש מבצעה (איור 3C) ויוצקים את acsf שונה.</li>
	<li>הגדר את הפורס במהירות איטית, עם תדירות הלהב במקסימום.</li>
	<li>הגדר את עובי הפרוסה ל-350-400 יקרומטר והתחל לפרוס (איור 3c). הצב את הפרוסות בפינת מגש הפרוסה ברצף, כך שניתן יהיה להבדיל בקלות בעומק הפרוסות. בדרך כלל ניתן להשיג שלוש עד חמש פרוסות מחצי כיתה אחת.</li>
	<li>לחתוך את החלק גזע המוח באמצעות מחט 30 G (איור 3D). הערה: בשלב זה, במידת הצורך, יש לבצע מיקרו-כירורגיה על פרוסת המוח כגון חתך בין גבול CA3-CA1.</li>
	<li>באמצעות מברשת קטנה משופעת הצבע, מניחים את הפרוסה על מרכז מסנן הממברנה (0.45 יקרומטר נקבוביות, מצופי קרום, 13 מ"מ קוטר) שנערך עם טבעת פלקסיגלס17 (15 מ"מ קוטר חיצוני, 11 מ"מ קוטר פנימי, 1 מ"מ עובי, איור 3e). מניחים את הטבעת בתא ההתאוששות הלח (איור 2) ולאבטח את המכסה כדי לשמור על הלחץ הפנימי גבוה. הערה: הפרוסות יהיה לדבוק קרום בתוך 30 דקות ניתן לטפל עם הטבעות בשלבים הבאים בחדר ההקלטה. אין צורך להשתמש במשקולות או באמצעים אחרים כדי לשמור על הפרוסה במקומה.</li>
	<li>כוונן את הכיוון והמיקום של הפרוסה בטבעת כדי לוודא שהוא ממורכז היטב ויש לו כיוון עקבי (ראה שלב 9.3).</li>
	<li>השאירו את הדגימה ב -28 ° c עבור 30 דקות, ואז בטמפרטורת החדר לפחות 10 עד 30 דקות להתאוששות של פרוסות. הערה: הפרוסות יכולות כעת לשמור על מצב פיזיולוגי טוב לפחות עבור 15 h.</li>
</ol>7. צביעת ושטיפה של הפרוסות (עכברים)
<ol><li>בעדינות להחיל 100-110 μL של הפתרון הכתים (שלב 4) על כל פרוסה על הטבעת באמצעות מיקרופיפטה. שמונה עד תשע פרוסות יכול להיות מוכתם עם פתרון אחד מכתים הכין בשלב 4. השאירו את הפרוסות במשך 20 דקות לצביעת.</li>
	<li>הכינו 50-100 mL של ACSF במיכל ולשים את הטבעת עם הדגימה הפרוסה בו כדי לשטוף את הפתרון כתמים.</li>
	<li>אחסן את הפרוסה השטף לחדר דגירה אחר. המתן יותר מ-1 שעות להחלמה לפני הניסוי. הערה: חדר הדגירה ניתן להתנתק מהגז ועבר למקום ההקלטה במצב אטום הדוק. הפרוסה יכולה להישאר בחיים לפחות 20 דקות ללא אספקת גז. הדבר שימושי למקרה שתצטרך להעביר את הפרוסה למקום אחר להקלטה.</li>
</ol>8. הכנת המנגנון הנסיוני היומי
<ol><li>הפעל את המגבר, המחשב ומערכת המצלמה ובדוק שהתוכנה פועלת.</li>
	<li>מקום ACSF בצינור 50 mL ובועה עם קרבוסג'ן.</li>
	<li>השתמש במשאבה הפריסטטית כדי להפיץ את ה-ACSF. כוונן את קצב הזרימה ל-1 mL/min.</li>
	<li>התאימו את גובה מתקן היניקה כך שמפלס הנוזלים בתוך תא הניסוי יהיה תמיד קבוע. הערה: רמת הפתרון חשובה להשגת הקלטה יציבה, ולכן יש לבצע את ההתאמה באמצעות מיקרומניפולציה.</li>
	<li>התקן אלקטרודה הקרקע מורכבת של שבב צהוב מלא 3 M KCl אגר (2%) (שלב 1.8) לתוך מחזיק עם חוט Ag-AgCl עם כמות קטנה של 3 מטרים KCl פתרון.</li>
	<li>מילוי כמות קטנה של ACSF (כשני שליש של אמצעי האחסון) לתוך האלקטרודה זכוכית (1 מ"מ קוטר החיצוני, 0.78 מ"מ קוטר פנימי משכה עם פולר מיקרופיפטה) באמצעות קצה צהוב מחודדות מחודדת ומניחים אותו במחזיק האלקטרודה.</li>
	<li>לצרף את המחזיק את מוט מותקן מניפולטור. ודא שימוש במגבר שהתנגדות האלקטרודה היא כ-1 MΩ. הערה: הפתיחה ארוך-shank (4-8 יקרומטר פתיחה) סוג התיקון אלקטרודה צריך להיות טוב להקלטת שדה כמו אלקטרודה מגרה.</li>
</ol>9. פתיחת מושב הקלטה
<ol><li>לקחת הכנה פרוסה מן התא לח עם מלקחיים.</li>
	<li>מניחים במהירות את הפרוסה על תא ניסיוני מתחת למיקרוסקופ (איור 4).</li>
	<li>דחף את קצה הטבעת בחוזקה. לתוך הטבעת הסיליקון להיזהר לא לשבור את הקרום או את החלק התחתון של תא הניסוי. הערה: יש לקחת בחשבון את כיוון הפרוסה ביחס לכיוון של אלקטרודות הגירוי וההקלטה בשדה הראייה. הפרוסה הבריאה צריכה לדבוק במסנן הממברנה כך שאין צורך להשתמש במכשירים אחרים כדי לתקן את הפרוסות כגון משקולות ורשתות ניילון.</li>
	<li>מניחים את קצה האלקטרודה המעוררת והרישום הפוטנציאלי בשדה, האלקטרודה על הפרוסה מתחת למיקרוסקופ באור משודר.</li>
	<li>השתמש במערכת ההקלטה האלקטרופיסיולוגית כדי לבדוק את התגובה. אשר את ההקלטה הרגילה (לא מוכתמת) אלקטרופיזיולוגיה עם תצורה נתונה. הערה: האלקטרודות ההקלטה ניתן להשמיט אך שימושי כדי לבדוק את הפיזיולוגיה של הפרוסה.</li>
	<li>להתאים את עוצמת האור עירור כ 70-80% הקיבולת המקסימלית במצלמה המקבילה 13-15 mW/cm2 על הדגימה בעת הדגימה ב 10 kHz עם 5x היעד טבילה המטרה ו 1X תוכנית שפופרת העדשה של APO. האור גל עירור הוא 530 ננומטר, ואת מסנן פליטה חייב להיות > 590 nm. הערה: השתמש תריס כדי למזער את כמות אור עירור. חשיפה לאור רציף עלולה להחמיר את הפיזיולוגיה של הפרוסה. ההשפעה המזיקה האפשרית של האור תלויה בעוצמה ובמשך האור. השתמש בהקלטה אלקטרופיזיולוגית. כדי לשפוט את אפקט האור במקרה של חוזק של 13-15 mW/cm2, על חשיפה של 1 צריך להיות הגבול העליון של הסובלנות.</li>
	<li>להתאים את המוקד עם מערכת הרכישה באמצעות מקור אור פלורסנט כי המוקד עשוי להיות שונה בהתאם אורך הגל ולהתחיל את הרכישה.</li>
	<li>בדוק את הנתונים בתוכנה לרכישת תמונות. הערה: השתמשנו בחבילת מיקרותכנות מקורית של תוכנות ניתוח מספרי לניתוח מפורט.</li>
</ol>

<ol><li>Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overall+Assay+of+Neuronal+Signal+Propagation+Pattern+With+Long-Term+Potentiation+%28LTP%29+in+Hippocampal+Slices+From+the+CA1+Area+With+Fast+Voltage-Sensitive+Dye+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389(2018).</li>
<li>Tominaga, T., Kajiwara, R., Tominaga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VSD+Imaging+Method+of+Ex+Vivo+Brain+Preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+and+Neuroengineering%22%5BJournal%5D)">VSD Imaging Method of Ex Vivo Brain Preparation.</a> Journal of Neuroscience and Neuroengineering. 2 (3), 211-219 (2013).</li>
<li>Homma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wide-field+and+two-photon+imaging+of+brain+activity+with+voltage-+and+calcium-sensitive+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Wide-field and two-photon imaging of brain activity with voltage- and calcium-sensitive dyes.</a> Methods Mol Biol. 364 (1529), 2453-2467 (2009).</li>
<li>Grinvald, A., Hildesheim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VSDI%3A+a+new+era+in+functional+imaging+of+cortical+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics.</a> Nature Reviews Neuroscience. 5 (11), 874-885 (2004).</li>
<li>Tasaki, I., Watanabe, A., Sandlin, R., Carnay, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+fluorescence%2C+turbidity%2C+and+birefringence+associated+with+nerve+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Changes in fluorescence, turbidity, and birefringence associated with nerve excitation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 61 (3), 883-888 (1968).</li>
<li>Cohen, L., Keynes, R., Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+Scattering+and+Birefringence+Changes+during+Nerve+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light Scattering and Birefringence Changes during Nerve Activity.</a> Nature. 218 (5140), 438-441 (1968).</li>
<li>Hill, D., Keynes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opacity+changes+in+stimulated+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Opacity changes in stimulated nerve.</a> The Journal of Physiology. 108 (3), 278-281 (1949).</li>
<li>Waggoner, A., Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Large+Change+in+Axon+Fluorescence+that+Provides+a+Promising+Method+for+Measuring+Membrane+Potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+New+Biology%22%5BJournal%5D)">A Large Change in Axon Fluorescence that Provides a Promising Method for Measuring Membrane Potential.</a> Nature New Biology. 241 (109), 159(1973).</li>
<li>Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Recording+of+Impulses+in+Individual+Neurones+of+an+Invertebrate+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Optical Recording of Impulses in Individual Neurones of an Invertebrate Central Nervous System.</a> Nature. 246 (5434), (1973).</li>
<li>Cohen, L., lzberg, B., Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Methods+for+Monitoring+Neuron+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optical Methods for Monitoring Neuron Activity.</a> Annual Review of Neuroscience. 1 (1), 171-182 (1978).</li>
<li>Ross, W. N., Salzberg, B. M., Cohen, L. B., Davila, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+change+in+dye+absorption+during+the+action+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">A large change in dye absorption during the action potential.</a> Biophysical Journal. 14 (12), 983-986 (1974).</li>
<li>Loew, L. M., Cohen, L. B., Salzberg, B. M., Obaid, A. L., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charge-shift+probes+of+membrane+potential.+Characterization+of+aminostyrylpyridinium+dyes+on+the+squid+giant+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Charge-shift probes of membrane potential. Characterization of aminostyrylpyridinium dyes on the squid giant axon.</a> Biophysical Journal. 47 (1), 71-77 (1985).</li>
<li>Loew, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+naphthyl+analog+of+the+aminostyryl+pyridinium+class+of+potentiometric+membrane+dyes+shows+consistent+sensitivity+in+a+variety+of+tissue%2C+cell%2C+and+model+membrane+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">A naphthyl analog of the aminostyryl pyridinium class of potentiometric membrane dyes shows consistent sensitivity in a variety of tissue, cell, and model membrane preparations.</a> The Journal of Membrane Biology. 130 (1), 1-10 (1992).</li>
<li>Mullah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Voltage-Sensitive+Fluorescence+Dyes+for+Monitoring+Neuronal+Activity+in+the+Embryonic+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Voltage-Sensitive Fluorescence Dyes for Monitoring Neuronal Activity in the Embryonic Central Nervous System.</a> The Journal of Membrane Biology. 246 (9), 679-688 (2013).</li>
<li>Momose-Sato, Y., Sato, K., Arai, Y., Yazawa, I., Mochida, H., Kamino, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Voltage-Sensitive+Dyes+for+Long-Term+Recording+of+Neural+Activity+in+the+Hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Voltage-Sensitive Dyes for Long-Term Recording of Neural Activity in the Hippocampus.</a> Journal of Membrane Biology. 172 (2), 145-157 (1999).</li>
<li>Tominaga, T., Tominaga, Y., Yamada, H., Matsumoto, G., Ichikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+optical+signals+with+electrophysiological+signals+in+neural+activities+of+Di-4-ANEPPS+stained+rat+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantification of optical signals with electrophysiological signals in neural activities of Di-4-ANEPPS stained rat hippocampal slices.</a> Journal of Neuroscience Methods. 102 (1), 11-23 (2000).</li>
<li>Experimental apparatus for sliced specimen of biological tissue and specimen holder. US Patent. , US 6,448,063 B2 (2002).</li>
<li>Buskila, Y., Breen, P. P., Tapson, J., van Schaik, A., Barton, M., Morley, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extending+the+viability+of+acute+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Extending the viability of acute brain slices.</a> Scientific Reports. 4 (1), srep05309 (2015).</li>
<li>Tanemura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegeneration+with+Tau+Accumulation+in+a+Transgenic+Mouse+Expressing+V337M+Human+Tau%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurodegeneration with Tau Accumulation in a Transgenic Mouse Expressing V337M Human Tau.</a> Journal of Neuroscience. 22 (1), 133-141 (2002).</li>
<li>Tominaga, Y., Ichikawa, M., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+potential+response+profiles+of+CA1+pyramidal+cells+probed+with+voltage-sensitive+dye+optical+imaging+in+rat+hippocampal+slices+reveal+the+impact+of+GABAA-mediated+feed-forward+inhibition+in+signal+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Membrane potential response profiles of CA1 pyramidal cells probed with voltage-sensitive dye optical imaging in rat hippocampal slices reveal the impact of GABAA-mediated feed-forward inhibition in signal propagation.</a> Neuroscience Research. 64 (2), 152-161 (2009).</li>
<li>Suh, J., Rivest, A. J., Nakashiba, T., Tominaga, T., Tonegawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entorhinal+Cortex+Layer+III+Input+to+the+Hippocampus+Is+Crucial+for+Temporal+Association+Memory%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Entorhinal Cortex Layer III Input to the Hippocampus Is Crucial for Temporal Association Memory.</a> Science. 334 (6061), 1415-1420 (2011).</li>
<li>Juliandi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+Adult+Hippocampal+Neurogenesis+and+Cognitive+Impairments+following+Prenatal+Treatment+of+the+Antiepileptic+Drug+Valproic+Acid%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cell+reports%22%5BJournal%5D)">Reduced Adult Hippocampal Neurogenesis and Cognitive Impairments following Prenatal Treatment of the Antiepileptic Drug Valproic Acid.</a> Stem cell reports. 5 (6), 1-14 (2016).</li>
<li>Stepan, J., Dine, J., Eder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+optical+probing+of+the+hippocampal+trisynaptic+circuit+in+vitro%3A+network+dynamics%2C+filter+properties%2C+and+polysynaptic+induction+of+CA1+LTP%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Functional optical probing of the hippocampal trisynaptic circuit in vitro: network dynamics, filter properties, and polysynaptic induction of CA1 LTP.</a> Frontiers in Neuroscience. 9, 160(2015).</li>
<li>Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overall+Assay+of+Neuronal+Signal+Propagation+Pattern+With+Long-Term+Potentiation+%28LTP%29+in+Hippocampal+Slices+From+the+CA1+Area+With+Fast+Voltage-Sensitive+Dye+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389(2018).</li>
<li>Kajiwara, R., Tominaga, Y., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+Plasticity+Involved+in+the+Spread+of+Neural+Activity+Within+the+Rhinal+Cortices+as+Revealed+by+Voltage-Sensitive+Dye+Imaging+in+Mouse+Brain+Slices%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Network Plasticity Involved in the Spread of Neural Activity Within the Rhinal Cortices as Revealed by Voltage-Sensitive Dye Imaging in Mouse Brain Slices.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 20(2019).</li>
<li>Popovic, M., Gao, X., Zecevic, D. Voltage-sensitive dye recording from axons, dendrites and dendritic spines of individual neurons in brain slices. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPopovic%2C+M+%22Journal+of+visualized+experiments%22">Journal of visualized experiments</a>. , (2012).</li>
<li>Sakmann, B., Stuart, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSakmann%2C+B+%22Single-Channel+Recording%22">Single-Channel Recording</a>. , (1995).</li>
<li>Tominaga, T., Tominaga, Y., Ichikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+long-lasting+depolarization+on+burst+stimulation+in+area+CA1+of+rat+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of long-lasting depolarization on burst stimulation in area CA1 of rat hippocampal slices.</a> Journal of neurophysiology. 88 (3), 1523-1532 (2002).</li>
<li>Mennerick, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+Voltage-Sensitive+Dyes+Modulate+GABAAReceptor+Function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Diverse Voltage-Sensitive Dyes Modulate GABAAReceptor Function.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (8), 2871-2879 (2010).</li>
<li>Canitano, R., Pallagrosi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autism+Spectrum+Disorders+and+Schizophrenia+Spectrum+Disorders%3A+Excitation%2FInhibition+Imbalance+and+Developmental+Trajectories%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Autism Spectrum Disorders and Schizophrenia Spectrum Disorders: Excitation/Inhibition Imbalance and Developmental Trajectories.</a> Frontiers in Psychiatry. 8, 69(2017).</li>
<li>Anticevic, A., Murray, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rebalancing+Altered+Computations%3A+Considering+the+Role+of+Neural+Excitation+and+Inhibition+Balance+Across+the+Psychiatric+Spectrum%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Rebalancing Altered Computations: Considering the Role of Neural Excitation and Inhibition Balance Across the Psychiatric Spectrum.</a> Biological Psychiatry. 81 (10), 816-817 (2017).</li>
<li>Busche, M., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairments+of+neural+circuit+function+in+Alzheimer%E2%80%99s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Phil.+Trans.+R.+Soc.+B%22%5BJournal%5D)">Impairments of neural circuit function in Alzheimer’s disease.</a> Phil. Trans. R. Soc. B. 371 (1700), 20150429(2016).</li>
<li>Knöpfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+optical+indicators+for+the+analysis+of+neuronal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits.</a> Nature Reviews Neuroscience. 13 (10), 687(2012).</li>
<li>Knöpfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+toolbox+for+remote+control+of+neuronal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Expanding the toolbox for remote control of neuronal circuits.</a> Nature Methods. 5 (4), 293(2008).</li>
<li>Tominaga, T., Tominaga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+nonscanning+confocal+microscopy+module+for+functional+voltage-sensitive+dye+and+Ca2%2B+imaging+of+neuronal+circuit+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">A new nonscanning confocal microscopy module for functional voltage-sensitive dye and Ca2+ imaging of neuronal circuit activity.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (2), 553-561 (2013).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

הפיזיולוגיה של הפרוסה חיונית. לאיסוף האות הנכון השימוש במערכת מסנני טבעת-ממברנה בפרוטוקול זה מבטיח שהפרוסה תישאר בריאה ובלתי מעוותת במהלך הפרוצדורה2,16,17. מערכות אחרות ניתן להשתמש כדי לשמור על פיזיולוגיה הפרוסה במהלך ההקלטה, אבל הפרוסה לא צריך להיות מעוות בכל עת כמו הדמיה זקוקה לכל חלק של הפרוסה כדי להיות בריא. מערכת מסנן טבעת ממברנה הוא גם טוב יותר עבור כתמים, כמו זה עוזר לנו למזער את עוצמת הקול של הפתרון הכתים הנדרש. חשוב גם ...

הדמיה של המוח הרחב במיוחד פוטון בודד צבע רגיש (vsd) דימות של מוכתם בצובר מוחית ההכנות לנתח הפך כלי כמותי שימושי כדי להעריך את הדינמיקה של מעגלים עצביים1,2,3,4 . לאחר ניתוח של שינויים במאפיינים אופטיים בשל עירור ממברנה5,6,7, הדמיה vsd תוארה לראשונה בשנות ה-70 המוקדמות על ידי כהן ואחרים6,8, 9.; זוהי שיטה מתאימה לפקח על פונקציות המוח בזמן אמת כמו הצבע ישירות בדיקה שינויים פוטנציאליים הממברנה (כלומר, האות העיקרי של הנוירונים).
VSDs המוקדמים ביותר היו המאפיינים הרצוי כדי להבין את מערכת המוח, כגון מהיר בזמן קבוע לעקוב אחר קינטיקה מהירה של אירועים פוטנציאליים קרום עצבי, ו יניאריות עם השינוי בקרום פוטנציאל9, מיכל עשור , מיכל בן 11 , מיכל בן 12 , מיכל בן 13 , מיכל בן 14 , 15. דומה לניסויים אחרים בדימות, טכניקה זו דורשת מגוון רחב של מינהור מסוים, כגון המצלמות, האופטיקה, התוכנה והפיזיולוגיה של הפרוסה, כדי להשיג את התוצאות הרצויות. בשל מלכודות טכניות אלה, היתרונות הצפויים במהלך המאמצים הראשוניים לא בהכרח התמחו עבור רוב המעבדות שלא המתמחות בטכניקה זו.
הגורם הראשוני של הקושי הטכני היה רגישות נמוכה של VSD לקראת שינוי פוטנציאלי הממברנה כאשר מיושם כתמים בצובר של ההכנות פרוסה. גודל האות האופטי (כלומר, השינוי החלקי בקרינה הפלואורסצנטית) הוא בדרך כלל 10-4-10-3 של השלט (F0) אות בתנאים פיזיולוגיים. סולם הזמן של שינוי פוטנציאלי של קרום בעצב הוא כ אלפיות שניה עד כמה מאות אלפיות שניה. כדי למדוד את השינויים בפוטנציאל הממברנה של העצב, המצלמה בשימוש עבור ההקלטה צריך להיות מסוגל להשיג תמונות עם מהירות גבוהה (10 kHz כדי 100 Hz). רגישות נמוכה של vsd ואת המהירות הדרושה כדי לעקוב אחר האות העצבית דורש כמות גדולה של אור לאסוף במצלמה במהירות גבוהה, עם יחס אות לרעש גבוה (S/N)2,16.
האופטיקה של מערכת ההקלטה הם גם אלמנט קריטי כדי להבטיח איסוף של אור מספיק כדי לשפר את S/N. ההגדלה שהושגה על-ידי האופטיקה היא לעתים קרובות נמוכה באופן מוגזם, כגון 1X כדי 10X, כדי להמחיש מעגל עצבי מקומי פונקציונלי. לדוגמה, כדי להמחיש את הדינמיקה של מעגל ההיפוקמאל, הגדלה של כ -5 תהיה מתאימה. להגדלה כזו נמוכה יש יעילות נמוכה של זריחה; לכן, אופטיקה מתקדמת תהיה מועילה להקלטה כזו.
בנוסף, גם הפיזיולוגיה של הפרוסה חיונית. מאחר שניתוח ההדמיה מחייב שהפרוסות יהיו שלמות, יש צורך בטיפול בפרוסה הזהירה17. יתר על כן, מדדים שננקטו כדי לשמור על הכדאיות הפרוסה זמן רב יותר הם חשובים18.
המאמר הנוכחי מתאר את הפרוטוקול להכנת פרוסות, צביעת VSD ומדידות. המאמר מתאר גם את השיפורים של VSDs, מכשיר הדמיה ואופטיקה, ועוד ליטושים נוספים למערכת הניסיונית שאפשרה שיטה זו לשמש כמערכת פשוטה, רבת עוצמה וכמותית לצורך המחשה של שינוי המוח בפונקציות19,20,21,22,23,24,25. הטכניקה יכולה גם לשמש רבות לפוטנציאל לטווח ארוך באזור CA1 של היפוקמאל פרוסות1. יתר על כן, טכניקה זו שימושית גם הקלטה אופטית של פוטנציאל הממברנה תא עצבי אחד26.

<table><tbody><tr><td>מערכת רכישת תמונות במהירות גבוהה</td><td>Brainvision Co. Ltd.</td><td>MiCAM -</td><td>מערכת הדמיה</td>Ultima</tr><tr><td>מערכת לרכישת תמונות במהירות גבוהה</td><td>Brainvision co. Ltd.</td><td>מערכת הדמיה</td> <td>MiCAM 02</td></tr><tr><td>Macroscepe להדמיית שדה רחב</td><td>Brainvision Co. Ltd.</td><td>מקרוסקופ מקרוסקופ THT</td><td></td></tr><tr><td>מערכת תאורת LED גבוהה עם מייצב פוטו-דיודודה</td><td>Brainvision co. Ltd.</td><td>LEX-2G</td><td>תאורת LED</td></tr><tr><td>תוכנה לרכישת תמונות</td><td>Brainvision Co. Ltd.</td><td>תוכנת רכישת תמונות</td> <td>BV-ana</td></tr><tr><td>ממריץ חשמלי רב תכליתי</td><td>Brainvision Co. Ltd.</td><td>ESTM-8</td><td>מבודד גירוי + ממיר AD/DA</td></tr><tr><td>פורס</td><td>Leica</td><td>VT-1200S</td><td>פורס</td></tr> פורס <tr><td></td><td>Leica</td><td>VT-1000</td><td></td></tr><tr><td>להב פורס לסלייסר</td><td>נוצה בטיחות סכין גילוח ושות', בע"מ</td><td>#99027</td><td>סכין גילוח פלדת פחמן</td></tr><tr><td>מסנן ממברנה לתמיכה בפרוסות</td><td>Merk Millipore Ltd., MA, ארה"ב</td><td>Omnipore, JHWP01300, 0.45 ומיקרו; m נקבוביות,</td> <td>מסנן ממברנה/0.45 13</td></tr><tr><td>תוכנת ניתוח נומרי</td><td>Wavemetrics Inc., OR, ארה"ב</td><td>IgorPro</td><td>תוכנת ניתוח</td></tr><tr><td>מבודד גירוי</td><td>WPI Inc.</td><td>A395</td><td>מבודד גירוי</td></tr><tr><td>ממיר AD/DA ממיר</td><td>Instrutech</td><td>ITC-18</td><td>AD/DA</td></tr><tr><td>צבע רגיש למתח Di-4-ANEPPS</td><td>Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, ארה"ב</td><td>מספר קטלוגי: D-1199</td><td>VSD: Di-4-ANEPPS</td></tr><tr><td>Poloxamer</td><td>Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, ארה"ב</td><td>Pluronic F-127 P30000MP</td><td>פולוקסאמר/פלורוניק F-127 (תמיסה של 20% ב-DMSO)</td></tr><tr><td>שמן קיק פוליאתוקסילט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cremophor EL C5135</td><td>שמן קיק פוליאתוקסילט</td></tr></tbody></table>

הקלטה אופטית חד-שלמה של פוטון בפרוסות מוח באמצעות שימוש במתח-צבע רגיש

Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

שטח רחב בודד פוטון בודדת צבע רגיש (VSD) הדמיה של ההכנות פרוסת המוח הוא כלי שימושי כדי להעריך את הקישוריות תפקודית במעגלים עצביים. עקב שינוי השבר באות האור, היה קשה להשתמש בשיטה זו כתוך שיטה כמותית. מאמר זה מתאר מערכות מיוחדות לטיפול באופטיקה ופרוסות, המתארות טכניקה זו ליציבה ולאמינות. המאמר הנוכחי ממחיש את הטיפול פרוסה, כתמים, והקלטה של פרוסות VSD מוכתם היפוקמאל בפירוט. המערכת שומרת על התנאים הפיזיולוגיים זמן רב, עם כתמים טובים, ומונעת תנועות מכניות של הפרוסה במהלך ההקלטות. כמו-כן, היא מאפשרת צביעת פרוסות בכמות קטנה של הצבע. האופטיקה להשיג צמצם מספרי גבוה בהגדלה נמוכה, אשר מאפשר הקלטה של האות VSD בקצב מסגרת מקסימלית של 10 kHz, עם 100 פיקסל x 100 פיקסל מרחבי רזולוציה. בשל קצב הפריימים הגבוה והרזולוציה המרחבית, טכניקה זו מאפשרת יישום של המסננים שלאחר ההקלטה, המספקים יחס מספיק של אות לרעש כדי להעריך את השינויים במעגלים העצביים.

איור 5 מראה את האות האופטי המייצג על גירוי חשמלי של העירבון השייפר באזור CA1 של פרוסת היפוקמאל בעכבר. התמונות רצופות באיור 5A להראות את האות האופטי לפני כל מסנני המרחב הזמני הוחלו, בעוד איור 5a מראה את הנתונים אותו לאחר החלת 5 x 5 x 5 המסנן מעוקב (ליבה גאוסיאנית קונבולוציה, 5 x 5 מרחבי-ו 5 כדי מימד זמני) פעמיים. בשל קצב מסגרת גבוהה (0.1 ms/מסגרת) ורזולוציה גבוהה מרחבית (100 פיקסלים x 100 פיקסלים), הי...

אנו מציגים שיטת הקלטה אופטית ויציבה לפרוסות מוח באמצעות צבע רגיש למתח. המאמר מתאר מכתים צבע רגיש מתח והקלטה של אותות אופטיים באמצעות הכנה היפוקמאל הפרוסות המקובלת.

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...

שיטת ההקלטה האופטית עם צבע רגיש למתח נחשבת לטכנולוגיה אידיאלית כדי לדמיין כיצד המוח עובד. שיטה זו אפשרה לנו להקליט דינמיקה נוירופסיכולוגית באופן הדוק ואמין במשך 12 שעות, נתן לנו מבט על פעילות נפשית. אנו מנסים להרחיב את היישום כדי לזהות שינויים במעגל הנגרמים על ידי כימיקלים בכל שלב הפיתוח, כגון יישום חומצה יקר לאימהות.הטכניקה כבר מבוססת היטב. אנא נסו לשחזר מחקרים על ידי ביצוע השיטה המוצגת כאן. כדי להתחיל בהליך זה, לטבול את הראש ערוף בקרח קר ACSF במגש כירורגי נירוסטה.מוציאים את המוח תוך דקה וממקם אותו בתוך מקור המכיל ACSF מצונן במשך חמש דקות. לאחר מכן, מחלקים את החלק במוח בקו האמצע עם אזמל ומ מניחים את שתי ההמיספרות על בלוק של 4%. לאחר מכן, מקם את בלוק המוח עם שתי ההמיספרות על בלוק 4%agar.נגב את ה- ACSF העודף מהבלוק באמצעות נייר סינון. לאחר מכן, יש למרוח דבק-על על פלטפורמת הרטט. מניחים עליו את גוש הגר ומנגבים את ההיבקות המוגזמת בנייר סינון.בעדינות להחיל כמות קטנה של קרח קר ACSF מהחלק העליון של המוח אגר בלוק כדי לעזור לחזק דבק סופר עודף ולמנוע הדבק מלכסות את המוח ולהפריע חיתוך. לאחר מכן, תקן את הפלטפורמה למגש הרטט ושפוך את ה- ACSF שהשתנה. הגדר את הרטט למהירות איטית והגדר את תדר הלהב בהגדרה המרבית שלו.אז תתחילו לתסתך. מניחים את הפרוסות בפינת תא הפרוסה ברצף כך שניתן יהיה להבדיל בקלות בין סדר הפרוסות. בדרך כלל ניתן להשיג שלוש עד חמש פרוסות מחצי כדור אחד.לאחר מכן, לחתוך את חלק גזע המוח באמצעות מחט 30 מד. בעזרת מברשת צבע קטנה עם קצה, מניחים את הפרוסה על מסנן הממברנה המוחזק בטבעת פלקסיגלס. מניחים את הטבעת בתא התאוששות לח ולאבטח את הכיסוי כדי לשמור על הלחץ הפנימי גבוה.בעת מיקום הפרוסה על מסנן הממברנה, התאימו את הכיוון והמיקום של הפרוסה בתוך הטבעת כדי לוודא שהיא מרוכזת היטב ויש לה כיוון עקבי. השאירו את הדגימה ב 28 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות ולאחר מכן בטמפרטורת החדר לפחות 10 עד 30 דקות להחלמה. כדי להכתים את הפרוסות, יש למרוח בעדינות 100 מיקרוליטרים של תותר הכתמים על כל פרוסה ולהדרור ב-20 דקות לטמפרטורת החדר.לאחר מכן, הכן 50 עד 100 מיליליטר של ACSF במיכל. מניחים את הטבעת עם הדגימה בה כדי לשטוף את פתרון הכתמים. לאחר מכן, מעבירים את הפרוסות השטיפות לתא דגירה אחר.חכה יותר משעה להתאוששות לפני הניסוי. כדי להתחיל בהליך זה, הפעל את מערכת המגבר, המחשב והמצלמה ופתח את התוכנה. יוצקים ACSF בצינור 50 מיליליטר ומבעבעים אותו עם קרבוגן.השתמש במשאבה פריסטולית כדי להפיץ את ה- ACSF ולהתאים את קצב הזרימה לכמיליליטר לדקה. לאחר מכן, להתאים את הגובה של פיפטה יניקה, כך רמת הנוזל בתוך תא הניסוי הוא תמיד קבוע. שים את האלקטרודה הקרקעית בתא.לאחר מכן, למלא את אלקטרודה זכוכית עם כמות קטנה של ACSF ולמקום אותו מחזיק האלקטרודה. חבר את המחזיק למוט של המניפולטור. באמצעות מגבר, ודא כי עמידות האלקטרודה היא כמגה-ם אחד.בהקלטה, להעביר פרוסה מהתא לח לתא ניסיוני. לחץ בחוזקה על קצה הטבעת לתוך טבעת הסיליקון. היזהר לא לשבור את הממברנה או את החלק התחתון של תא הניסוי.מתחת למיקרוסקופ מניחים את קצה האלקטרודה המריצה ואת אלקטרודה ההקלטה הפוטנציאלית של השדה על הפרוסה. בדוק את התגובה המעוררת על ידי אספקת גירוי. ודא כי שדה התצוגה מכסה את המעגל העצבי הנכון במערכת ההקלטה האופטית.לאחר מכן, כוונן את עוצמת אור העירור לכ- 70 עד 80% מהקיבולת המרבית במצלמה. באמצעות מקור האור הפלואורסצנטי, התאם את המוקד למערכת הרכישה. לאחר מכן, התחל את ההקלטה ונתח את הנתונים בתוכנה לרכישת תמונות לאחר הרכישה.איור זה מראה את האות האופטי הייצוגי על גירוי חשמלי של ה- Schaffer collaterol באזור CA1 של פרוסת היפוקמפוס של עכבר. תמונות עוקבות אלה מציגות את האות האופטי לפני החלת מסננים spacial ו temporal בעוד תמונות אלה מציגים את אותם נתונים לאחר החלת חמש על חמש על חמש מסנן מעוקב פעמיים. בשל קצב הפריימים הגבוה והרזולוציה המרחבית הגבוהה, היישום של המסנן לא לשנות את האות, אבל סינן את הרעש אשר ניתן לראות גם במסלול הזמן נרשם פיקסלים במשפט אחד.הנה ההשוואה של התגובות האופייניות באזור CA1 של פרוסות ההיפוקמפוס בין עכבר וחולדה. התגובה ההיפר-קוטבית הקטנה נצפית בצד הדיסטלי של ה- CA1 לאחר 24 אלפיות שנייה בפרוסת ההיפוקמפוס של העכבר, אך תגובה היפר-קוטבית מסיבית יותר עקפה את התגובה הדפולארית בפרוסת ההיפוקמפוס של העכבר. לאחר הפרוסות מוכתמות, הם צריכים להימשך מעל 12 שעות ואתה יכול לבצע הקלטות אלקטרופיזיולוגיות אחרות עליהם.

wide-field-single-photon-optical-recording-brain-slices-using-voltage

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

פרוטוקול זה מדגים כיצד מתח רגיש צבעים לאפשר הקלטה אופטית של הפעילות החשמלית של רשתות עצביות שלמים כגון plexuses של מערכת חזירי הים העצבים enteric, עם רזולוציה מתכווננת אשר נע בין חד תאים למעגל רב ganglionic.

הקלטה אופטית של הפעילות החשמלית גינאה חזיר רשתות enteric באמצעות מתח רגיש צבעים

הבנת התפקוד של מערכת העצבים מרכזי החוליות דורשת הקלטות מנוירונים רבים בגלל תפקוד קליפת המוח מתעורר ברמה של אוכלוסיות של נוירונים. כאן אנו מתארים שיטה אופטית להקלטת פעילות עצבית suprathreshold עם רזולוצית תא בודד ויחיד ספייק, התלבטה סריקה בגישה אקראית. זה מסמל שיטה רשום סומטיות קרינת סיד מעד 100 נוירונים עם רזולוציה גבוהה זמנית. אלגוריתם מקסימאלי סבירות deconvolves הפעילות העצבית suprathreshold הבסיסית מאותות סיד הקרינה סומטיות. שיטה זו אמינה מזהה קוצים עם איתור יעיל גבוהים ושיעור נמוך של תוצאות...

הקלטה אופטית של פעילות עצבית suprathreshold עם רזולוצית תא בודד ויחיד ספייק

טכניקת הדמיה למעקב אחר שינויים אפשריים בממברנה עם רזולוצית המשנה מיקרומטר מרחבית ותת זמנית האלפית השנייה מתוארת. הטכניקה, המבוססת על ליזר עירור של צבעי מתח רגישים, מאפשרת מדידות של אותות באקסונים וטחונות האקסון, סניפי מסוף דנדריטיים, וקוצים הדנדריטים בודדים.

הקלטת דיי מתח רגישה מהאקסונים, הדנדריטים וקוצים הדנדריטים של נוירונים בודדים בפרוסות מוח

סרטון זה מדגים הליך לצפייה בשינויים בפעילות העצבית בפרוסת מוח המוכתמת בצבע רגיש למתח. הצבע משקף שינויים בפוטנציאל הממברנה של תא העצב על ידי שינוי עוצמת הפלואורסצנטיות שלו. באמצעות יישום גירויים חשמליים וטכניקות הדמיה מתקדמות, תהליך זה מאפשר מעקב חזותי אחר שינויים בזמן אמת בפוטנציאל הממברנה העצבית בהתבסס על פלואורסצנטיות VSD.

הקלטה אופטית של פעילות עצבית בפרוסות מוח מוכתמות בצבע רגיש למתח

סרטון זה מתאר שיטה לדימות ורישום בו זמנית של פעילות חשמלית מפרוסות מוח טרנסגניות המכילות חלבונים פלואורסצנטיים ספציפיים לנוירונים. ההליך כולל שמירה על פרוסת המוח בתא זילוח עם נוזל מוחי מלאכותי משודר, שימוש במקור אור כדי לעורר תאים המסומנים בפלואורסצנט, ורישום האותות החשמליים באמצעות בדיקה רב-ערוצית ומהדק טלאי.

ניטור אופטי ואלקטרופיזיולוגי סימולטני של תאי עצב בפרוסות מוח

סרטון זה מדגים את ההליך לחקר יעילות סינפטית בקליפת המוח האנטורינלית הצידית (LEC) על-ידי גירוי אופטוגנטי של אקסונים של קליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית (mPFC) ורישום התגובות של נוירונים פירמידליים ב-LEC. שיטה זו משלבת הקלטות מהדק טלאי עם הפעלה סינפטית על ידי גירוי אור כדי לחקור פלסטיות סינפטית.

גירוי אופטוגנטי ורישום אלקטרופיזיולוגי של אירועים סינפטיים בפרוסות מוח של חולדות

כאן, מוצג הליך להפעלה סלקטיבית של חלבון עצבי עם פולס קצר של אור על ידי קידוד גנטי של חומצת אמינו לא טבעית תגובתית-אור לחלבון עצבי מטרה המתבטא בתאי עצב בתרבית או in vivo.

שליטה אופטית של חלבון עצבי באמצעות חומצות אמינו לא טבעי מקודדים גנטיים בנוירונים

אנו מציגים שיטת שילוב תאים כל תיקון-קלאמפ הקלטות והדמיה שני הפוטונים להקליט את Ca2 + שנחשולי דנדריטים עצביים במוח חריפה פרוסות.

שני הפוטונים סידן הדמיה של דנדריטים עצביים במוח פרוסות

ניתן להשתמש בפרוסות מוח Ex vivo כדי לחקור את ההשפעות של חומרי הרדמה נדיפים על תגובות מעוררות לתשומות אפרינטיות. אופטוגנטיקה משמשת להפעלה עצמאית של אפרנטים תלמוקורטיים וקורטיקוקורטיקליים לניאוקורטקס שאינו ראשוני, ותגובות סינפטיות ורשתיות מווסתות עם איזופלורן.

הפעלה אופטוגנטית של מסלולים אפרנטיים בפרוסות מוח וויסות תגובות על ידי הרדמה נדיפה

פרוטוקול זה מציג שיטה להדמיית פעילות אוכלוסיה עצבית עם רזולוציה של תא יחיד במינים לא מהונדסים של חוליות באמצעות צבעים רגישים למתח ספיגה ומערך פוטודיודות. גישה זו מאפשרת זרימת עבודה מהירה, שבה ניתן לבצע הדמיה וניתוח במהלך יום אחד.

הדמיה אופטית מבוססת פוטודיודה להקלטת דינמיקה ברשת עם רזולוציית נוירון יחיד בבלתי חוליות לא מהונדסים

מאמר זה נועד לתאר פרוטוקול שיטתי כדי להשיג פרוסות מוח היפוקמפוס אופקי בעכברים. מטרת מתודולוגיה זו היא לשמר את השלמות של מסלולי סיבים בהיפוקמפוס, כגון הנתיב המחורר ודרכי הסיבים הטחובים להערכת תהליכים נוירולוגיים הקשורים לgyrus.

פרוסות היפוקמפוס אופקיות של מוח העכבר

למד הקלטה אופטית יציבה של פעילות עצבית בפרוסות היפוקמפוס מעכבר באמצעות צבע רגיש למתח. השיטה מאפשרת תצפית אמינה לאורך 12 שעות על דינמיקה של מעגלים מוחיים ותגובות לגירויים חשמליים.

הקלטה אופטית חד-שלמה של פוטון בפרוסות מוח באמצעות שימוש במתח-צבע רגיש

גלה סרטונים נוספים