פלואורסצנטית כמותי באתרו היברידיזציה (דג) ו Immunofluorescence (IF) של מוצרים גנטיים ספציפיים בתאים שנדבקו KSHV

הפרוטוקול מסייע בהשגת תובנה כמותית על הרגולציה הזמנית של מוצרי גנים ויראליים, בהקשר של תאים מארחים, במיוחד ביחס לווירוסי הרפס. טכניקה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מחקר הקשורות הן מארח RNAs ויראלי וחלבונים. יתר על כן, טכניקה זו תואמת לתהפוכי ביוכימיה בו זמנית.

כדי לדבוק בתאים לשמונה מגלשות תאים, יש למרוח 200 מיקרוליטרים של מתלי תאים אינהרנטיים על כל תא של שקופית סטרילית בת שמונה תאים ולאפשר צמיחת זרעים למשך 12-24 שעות, ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני. בסוף הדגירה, שאפו את התאים העל-טבעיים והבלתי מחוברים, ומיד תקן את התאים עם פורמלדהיד מקורר מראש של 4% ב- PBS על קרח, למשך 30 דקות. בסוף קיבעון, לשטוף את התאים עם שלוש, חמש דקות שוטף ב 200 microliters של 4 מעלות צלזיוס PBS לכל לשטוף.

לאחר הכביסה האחרונה, חלחלו לתאים הקבועים עם 200 מיקרוליטרים של 0.5% טריטון-X מקורר מראש ב- PBS לבא" לאורך 10 דקות על קרח. בסוף permeabilization, להסיר בזהירות את התאים מבלי לפצח את השקופית, ולשטוף את התאים עם PBS מקורר מראש. חוסמים את התאים השטיפים עם 4%BSA מקורר מראש ב-PBS למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ואחריו דגירה עם נוגדן ראשוני פוליקלונאלי מתאים לעניין ב-0.1%BSA ב-PBS למשך שעה, בארבע מעלות צלזיוס.

בסוף הדגירה, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS טרי להדגור את התאים עם נוגדן משני מתאים גדוש פלואורופורי תואם את הנוגדן גילוי FISH במשך שעה אחת, בארבע מעלות צלזיוס. לאחר שלוש שטיפות PBS כפי שהוכח, לתקן את הדגימות שוב 4%פורמלדהיד ב PBS במשך 10-15 דקות לפני חלחלה שנייה כפי שהוכח. לאחר מכן מכסים את השקופית בנייר אלומיניום כדי לשמר את האות הפלואורסצנטי ולמנוע צילום.

ולשטוף את התאים עם 2x מלוחים נתרן ציטראט, לפני החלת 45 microliters של פתרון הכלאה. לאחר שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס בתא לח, להוסיף מים מזוקקים אוליגונוקלאוטידים antisense של עניין להביא את נפח denaturation ל 10 microliters. Denature oligonucleotides ב 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, לפני הוספת 35 microliters של פתרון הכלאה טרי לכל שקופית.

ואז להדגר את הדגימות מ 10-24 שעות בתא לח ב 37 מעלות צלזיוס, מוגן בנייר כסף. למחרת, לשטוף את התאים עם שתיים, 10 דקות. 2X מלוחים נתרן ציטראט שוטף בטמפרטורת החדר, ואחריו לשטוף אחד 1X מלוחים נתרן ציטראט במשך 10 דקות, ב 25 מעלות צלזיוס.

לאחר הכביסה האחרונה, לתקן את התאים עם pre-chilled 4% פורמלדהיד ב PBS, במשך 10-15 דקות על קרח, ואחריו שלוש שטיפות עם PBS טרי. לאחר מכן, לחלחל דגימות כפי שהודגם, ואחריו דגירה עם FTC אנטי דיוקסיגנין ו pre-chilled 0.1%BSA ב PBS, במשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, לשטוף את השקופיות שלוש פעמים PBX טרי, ולתקן את הדגימות עם מראש מקורר 4% paraformaldehyde ב PBS, במשך 10-15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר שלוש שטיפות ב- PBS, סמן את הגרעינים עם 0.4 מיקרוגרם למיליליטר של DAPI ו- 0.5% טריטון-X ב- PBS במשך 15 דקות על קרח, ואחריו שלוש שטיפות סופיות ב- PBS. הר מחליק עם חרוזים פלואורסצנטיים, רלוונטיים מבחינה ניסיונית ובמדיום הרכבה מתאים. לאחר הסרת מדיום הרכבה עודף עם מגבונים סטריליים, לאטום אחד מכסה לכל שקופית עם מעילים מרובים של לק שקוף, ולהשתמש מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לאשר ביצוע מוצלח של הניסוי.

לאחר מכן ניתן יהיה לנקוט תמונות במיקרוסקופ קונפוקל כדי לאסוף תמונות של הדגימות תוך שעה עד שבוע מההגדלה, בהגדלה של פי 630. תוצאות הדגים והאימונו-פלואורסצנטיות המייצגות הללו הן חצי-עקביות ומציעות תובנה לגבי לוקליזציה של אוליגונוקלאוטיד, ולא להשוואות בין התעצמויות הכתמים הפלואורסצנטיים השונים, מכיוון שניסויים אלה לא כללו חרוז פלואורסצנטי בהכנת השקופיות. בניסויים אלה, האזורים הציטופלסמיים והגרניים ויחסיהם היו שונים עבור תאים נגועים KSHV סמויים וליטיים.

כפי שמודגם באיור זה, האזור נשלט ביחס הגרעינים. כאשר שכפול DNA KSHV מעוכב בשלב lytic, החלבון הליטיטי המוקדם של תעתיק אוליגונוקלאוטיד KSHV עובר לוקליזציה ציטופלסמית בעיקר. KSHV polyadenylated RNA, עם זאת, לוקליזציה לאתרים גרעיניים ספציפיים למרות העיכוב של שכפול DNA ויראלי.

בעת הסרת התאים מהמגלשות, יש לדאוג כי יש מעט מאוד שאריות דבק על הכלי, ולהשתמש באתנול כדי לחלחל לתאים להחליש את דבק. ניתן לבצע בדיקות ביוכימיות כגון QPCR, כתם מערבי ותפירה גבוהה, יחד כדי להגדיל את הנתונים הכמותיים שנאספו מהמיקרוגרפים.