הפרדת אפידרמיס ראט ודרמיס עם תרמוליסין לזיהוי mRNA וחלבון דלקתיים ספציפיים לאתר

הפרוטוקול שלנו הוא טכניקת הפרדה אפידרמלית-עורית קלה וזולה לקביעת הייצור הספציפי לאתר של מתווכים דלקתיים ונוירוטרופינים במהלך דלקת בעור. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי הפרדה אנזימטית של האפידרמיס מן הדרמיס מבוצעת בארבע מעלות צלזיוס, שמירה על שלמות mRNA וחלבון. שיטה זו מספקת תובנה על סוגי המתווכים החושניים מסופים אמינים ראשוניים במהלך דלקת חריפה וכרונית להתפתחות התערבויות טיפוליות חדשניות.

ריפוי פצעים, מחלות עור, פצעים כרוניים וכוויות יכולים להפיק תועלת ממחקר זה. ושיטה זו יכולה להיות מיושמת על משטחים אפיתל אחרים, כגון מערכת העיכול והקרנית. זמן ההפרדה האופטימלי עשוי להיות שונה במקצת בין המעבדות.

ניסוי ראשוני המשווה נקודות זמן שונות בשילוב עם הערכת מורפולוגיה 2D מומלץ לקבוע את איכות ההפרדה. לאחר אישור חוסר תגובה לרפלקס הדוושה בחולדת ספראג דולי בת שמונה עד תשעה שבועות, הזריקו באופן תת עורי את כף הרגל האחורית הגלברו הימנית עם 100 מיקרוליטרים של קרגינן 1X למבדה מדולל ב- PBS. השתמש calipers כדי למדוד את עובי metatarsal כף היד האחורית מיד לפני וב 6 ו 12 שעות לאחר ההזרקה כדי לקבוע את נפח בצקת בתגובה לגירוי.

בנקודת הקצה הניסיונית המתאימה, השתמש באזמל חד כדי לקצור חתיכה אחת על שני מילימטר של עור כף רגל אחורית גלברו מכפפת הכף המוזרקת ולהשתמש במלקחיים microdissection להעביר את העור לתוך מיליליטר אחד של DMEM קר בצינור microcentrifuge על קרח במשך 15 עד 60 דקות. בזמן שהרקמה מדגירה, הוסיפו מיליליטר אחד של תרמוליסין פעיל טרי ל-10 בארות של צלחת תרבית תאים בת 24 בארות על קרח. בסוף הדגירה, השתמש במלקחיים microdissection כדי להעביר דגימת עור אחת לתוך כל באר של תרמוליסין פעיל, רובד קרנית בצד למעלה מבלי לטבול את הדגימות בתמיסה.

זה קריטי כי העור אינו שקוע התרמוליסין וכי קרנית השכבה פונה למעלה כדי להשיג הפרדה יעילה. לאחר שעתיים עד שלוש שעות, השתמש במלקחיים microdissection כדי לטבול דגימת עור אחת בשבע עד שמונה מיליליטר של ארבע מעלות צלזיוס DMEM בצלחת פטרי כדי לאפשר יותר מקום לאפידרמיס להיפרד הדרמיס. השתמש במלקחיים כדי לצחצח בעדינות את האפידרמיס סביב היקף העור עד האפידרמיס שקוף כמעט נצפה בגבולות המדגם.

כאשר האפידרמיס נפרד באופן ניכר מהדרמיס, תפס בזהירות כל שכבה של העור בזוג מלקחיים אחד ומשוך לאט את האפידרמיס מהדרמיס, ואז להעריך את התחלת האפידרמיס המבודדת על ידי מיקרוסקופיה קלה כדי לוודא שהיא עקבית אופטית. אם השכבות הופרדו כראוי, מניחים את הרקמות האפידרמליות והעריות במיכלים בודדים של EDTA חמישה מילימולרים ב- DMEM בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר השבתת התרמוליצין, לתקן חלק של האפידרמיס קיבוע מתאים במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר עם תסיסה.

בסוף הדגירה, מניחים את הרקמה הקבועה ב-10% סוכרוז ב-PBS למשך שעה בטמפרטורת החדר עם עצבנות, לפני הקפאת הדגימה במטריצה מתאימה להטבעת רקמות לחתך. השתמש cryostat כדי להשיג 14 חתך בעובי מיקרומטר ולהפשיר את החלקים על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית מצופה ג'לטין. לאחר הייבוש על מחמם שקופיות, להכתים את הדגימות עם פתרון עובד של טולואידין כחול במשך 90 שניות.

לאחר מכן, יש לשטוף בעדינות את טולואידין כחול מהמגלשות עם PBS ולהתנגד לכיסויים עם מדיום הרכבה מימי, ואז להתבונן באפידרמיס עם מיקרוסקופיית ברייטפילד בהגדלה של פי 50 עד 250. הזרקת קרגינן לתוך כף רגלו האחורית של העכברוש גורמת לתסמינים קלאסיים של דלקת, כגון אדמומיות ובצקת הן 6 ו 12 שעות לאחר הזרקה. מיקרוסקופיית ברייטפילד יכולה לשמש להערכת האפקטיביות של הפרדת התרמולצין של האפידרמיס והדרמיס של עור כף רגלו האחורית של החולדה גלברוס.

אכן, כתמים כחולים טולואידין של חתך האפידרמיס מראה כי האפידרמיס מופרד מן הדרמיס בקרום הבסיסי, אבל כי רכסי רט האפידרמיס ואת החריצים מן papilla העורי נשארים שלמים. יתר על כן, כל שכבות התא קרטינוציט נצפות. סופג מערבי של האפידרמיס המופרד התרמוליסין מייצר תוצאות עקביות, המצביעות על רמות חלבון יציבות במהלך הטכניקה בארבע מעלות צלזיוס.

מעט מאוד חלבון NGF מזוהה באפידרמיס החולדה הנאיבית, אבל רמות חלבון NGF הם רגולציה משמעותית לאחר שש שעות של דלקת הנגרמת על ידי carrageenan. 12 שעות לאחר ההזרקה, רמות NGF מופחתות בהשוואה לאלה שנצפו בשש שעות, אך נשארות גבוהות ביחס לבקרות. כצפוי מניתוח כתם מערבי, חיסוניות NGF אינה מזוהה בדגימות רקמת אפידרמיס בקרה נאיבית, אבל בשש שעות לאחר דלקת הנגרמת carrageenan, NGF חיסוניות נצפתה ברוב הקראטינוציטים של גרנולוזום השכבה ו שבדנית.

כמה תאים בספינוסאום השכבה הם גם אימונוריים NGF. בעת שימוש התרמוליסין כדי לבודד את האפידרמיס שלם, חשוב לזכור כי זמן ההפרדה האופטימלי חייב להיקבע אמפירית על ידי משתמש הקצה. ניתן להשתמש בטכניקות פרוטאומיות ומולקולריות שונות כדי לאמת את הביטוי של חלבונים ספציפיים ו/או תמלילי גנים ראשוניים כדי לאשר כי הליך זה אינו משנה את הביטוי הבזלי.

טכניקה זו של הפרדה אפידרמלית-עורית תאפשר לחוקרים לענות על שאלות נוספות לגבי הביטוי הספציפי לאתר של נוירוטרופינים ומתווכים דלקתיים במודלים דלקתיים עוריים שונים. חומצה פיארית ופרפורמלדהיד הם מסוכנים. עבוד עם שני הכימיקלים במכסה המנוע של האדים, השתמש בבגדי מגן אישיים וכפפות ושטוף את הפנים והידיים לאחר הטיפול.