הפאן-lyssavirus בזמן אמת RT-PCR לאבחון כלבת

RT-PCR זה בזמן אמת מתאים לאבחן במהירות כלבת בדגימות אנטה-נתיחה שלאחר המוות. פריימרים פאן-Lyssavirus כבר אופטימיזציה כדי לזהות את כל החברים בסוג Lyssavirus. זוהי בדיקה מהירה, רגישה וסגורה שמזהה וירוסים מכל רחבי סוג Lyssavirus כולל מינים שונים מאוד מדגימות קליניות.

OIE קיבל לאחרונה בדיקות מולקולריות לדווח על זיהום בכלבת. זה חשוב במיוחד עבור דגימות מפורקות אשר לא תמיד יכול להיות מאובחנים על ידי תרבות וירוסים או שיטות גילוי אנטיגן. בשל הרגישות של ההסתערות הזו, תרגול מעבדה טוב כולל הפרדת השלבים השונים חיוני כדי למזער את הסיכון לזיהום.

הדגימה של ההליך תהיה דייזי ג'נינגס, מאבחנית מהמעבדה שלי. התחל על ידי כימות RNA עם ספקטרופוטומטר מיקרו נפח. ודא שהמכונה מוגדרת ל- RNA ולהשתמש במיקרוליטר אחד עד שניים של מים מולקולריים כדי לנרמל את המכונה ולהקים בסיס.

למדוד את ריכוז ה-RNA ולהתאים אותו למיקרוגרם אחד לכל מיקרוליטר. תכנן את הפריסה של לוח PCR באמצעות גיליון אלקטרוני שלוקח בחשבון הן דוגמאות בדיקה והן דוגמאות בקרה. הכן תחנת עבודה PCR על ידי חיטוי משטחים ואם באמצעות ארון UV, להפעיל את אור UV 10 דקות לפני תחילת.

מוציאים את הריג'ים ואת פריימרים מהמקפיא כדי להפשיר אבל לשמור על תערובת האנזים על הקרח בכל עת. מערבבים את הרייבגנטים והצנטריפוגות לזמן קצר כדי לאסוף את הנוזל. הכינו את תערובות המאסטר של PCR עבור Lyssavirus ובטא-אקטין בהתאם לכיווני כתב היד.

השאירו את האב מתערבב על קרח עד שהוא מוכן לשימוש. מערבבים וצנטריפוגים את ערבובי המאסטר המוכנים ומחלקים 19 מיקרוליטרים לתוך בארות הרלוונטיות של צלחת או רצועת צינור תואמת מכונת PCR. בחדר נפרד או ארון UV, הוסיפו בזהירות מיקרוליטר אחד של ה-RNA המוכן.

אם אתם משתמשים ארון UV, להפעיל את אור UV 10 דקות לפני ההתחלה. לאחר דגימות הבדיקה, הוסף את הפקד החיובי ואת פקד ללא תבנית. בעת הוספת ה- RNA לערבובים הראשיים, ודא שהוא נוסף לגם הנכון.

השתמש בתוכנית צלחת כדי לסייע לשלב זה. לאטום את הצלחת בודק כי המכסים שטוחים על פני הצלחת ולסובב אותו למטה כדי לאסוף את כל הנוזל בתחתית בארות. ודא שלכל באר יש את אותו נפח של נוזל ואף בועות אינן נראות לעין.

לאחר מכן העבר את הדגימות למחשב PCR. פתח את התוכנית בחירת SYBR ירוק עם דיסוציאציה. בחר את בארות להיות מנותח בחירה לא ידועה כמו סוג המדגם SYBR כצבע פלואורסצנטי.

סמן את הבארות בפריסת הלוח עם המידע לדוגמה, כולל אם ההבטחה היא עבור Lyssavirus L או Beta-Actin. לחץ על הגדרת פרופיל תרמו ולשנות את תנאי האופניים התרמיים כמפורט בכתב היד. לחץ על התחל ולאחר מכן בחר מיקום לשמירת הקובץ וסמן את התיבה כדי לכבות את המנורה בסוף ההפעלה.

כאשר האפשרות להתחיל לפני חימום מנורה מופיע, לחץ על הפעל עכשיו אבל לוודא כי המנורה יש פחות מ 15 דקות כדי להתחמם. לאחר השלמת הפעלת ה- PCR, המשך בניתוח נתונים. ראשית, לנתח את עלילות הגברה Lyssavirus.

דגימות חיוביות מציגות רמפות מעריכיות בעוד שלדגימות שליליות יש חלקות הגברה שטוחות ללא ערכי CT. לאחר מכן, לנתח את תוצאות עקומת דיסוציאציה Lyssavirus של דגימות הבדיקה לצד דגימות הבקרה. מדגם חיובי Lyssavirus יהיה טמפרטורת התכה בין 77 ל 80 מעלות צלזיוס וחופפים עם השליטה החיובית.

לאחר מכן, נתח את עלילות ההגברה של Beta-Actin ואת עקומות הדיסוציאציה בהשוואה לפקדים כדי לפרש את התוצאה הכוללת. הצג את דוח הטקסט ולהשתמש בפרטים כדי לתעד את ערכי CT ו- TM שהושגו עבור RNA הפקד בכרטיס בקרה כדי לאשר כי הריצה הצליחה כי תוצאות מדגם הבדיקה ניתן לדווח. פרוטוקול זה משמש כדי להדגים את הרגישות של RT-PCR פאן-Lyssavirus על סדרת דילול RNA של וירוס תקן בקרה.

עקומת ההגברה מצביעה על כך שניתן לזהות עד 10 פיקוגרמות של ליסווירוס ועקומות הדיסוציאציה מאמתות את טמפרטורת ההיתוך של המוצר. טמפרטורת ההיתוך משמשת כדי לאשר כי האמפליקון הוא ספציפי Lyssavirus. התוצאות כאן מדגימות טווח טמפרטורות נמס על פני סוג Lyssavirus של 77.34 עד 79.67 מעלות צלזיוס.

ערכי טמפרטורה נמסים מתחת ל- 76.8 ומעלה 80.2 נחשבים לא ספציפיים. הרגישות של המדגמה RT-PCR זה נקבע גם על ידי גילוי RNA משלוש דגימות מוח חיוביות Lyssavirus. ניתן לזהות מעט כמו 0.1 פיקוגרמות למיקרוליטר של RNA היעד עבור שתיים מתוך שלוש דגימות.

יש לציין, נציגים מכל מיני Lyssavirus מוכרים מזוהים באמצעות הבטחה זו. אם מנתחים תמציות RNA מדגימות קליניות כגון רוק או CSF, תוצאות בטא-אקטין עשויות להיות שליליות עקב מחסור בחומצות גרעין מארח. התוספת של פקד אקסוגני עשויה לפתור בעיה זו.

רצף של דגימות חיוביות Lyssavirus מומלץ לספק מידע נוסף לגבי המקורות הגיאוגרפיים והמארח של זיהום כלבת. הטיפול בדגימות חיוביות או חשודות בדגימות חיוביות חייב להיות בהתאם להנחיות הבריאות והבטיחות המקומיות. ה- RNA שחולץ אינו מדבק, ולכן ניתן לטפל בו במעבדות בלימה נמוכות.