באמצעות הזחלים Zebrafish ללמוד את ההשלכות הפתולוגיים של שבץ מדמם

שיטה זו מספקת גישה פרה-קלינית משלימה לחקר התגובה התאית המיידית לדם במוח בעקבות שבץ מדמם, מצב חמור מאוד שאין לנו תרופות ספציפיות זמינות לחולים. שלא כמו דגמי מכרסמים, השקיפות של זחלי הזברה מאפשרת לנו להתבונן בתגובות תאיות במוחם של בעלי חיים שלמים בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. כדי להתחיל, השתמש מסננת תה כדי לאסוף את כל העוברים מופרים מן ההשרקה הטבעית בקופסאות הרבייה המיוצר זכר אחד ואחד עד שתי נקבות דגי זברה בוגרים.

מעבירים 100 עוברים לכל צלחת פטרי המכילה מדיום עובר E3 סטנדרטי. דגירה ב 28 מעלות צלזיוס שלב על פי הנחיות סטנדרטיות. בשש שעות לאחר ההפריה, מוציאים מהצלחת עוברים מתים ולא מופרים באמצעות פיפטה פסטר ומכניסים את הכלים בחזרה לאנקובטור.

ב 24 שעות לאחר ההפריה, תחת מיקרוסקופ סטריאו שדה בהיר, להשתמש מעצורי ניתוח דקים במיוחד כדי לרוקן עוברים לטיפול Atorvastatin. לאחר מכן מוסיפים 30 מיליליטר של עובר E3 בינוני לשתי מנות פטרי נקיות, אחת לטיפול והשנייה לשליטה. הסר 60 microliters של מים עובריים מן צלחת הטיפול ולהוסיף 60 microliters של 0.5 מילימולרים Atorvastatin כדי להשיג 80% של זחלים מדממים.

באמצעות פיפטה פסטר, להעביר 100 עוברים במים מעט ככל האפשר לכל מנה. דגירה שתי מנות ב 28 מעלות צלזיוס. בכל עת לאחר 50 שעות לאחר ההפריה, תחת המיקרוסקופ להשתמש פיפטה פסטר להפריד בזהירות דגים מדממים מאוכלוסיות שאינן מדממות ולהעביר את הזחלים למנות חדשות המכילות מדיה E3 טרי.

כדי להקל על הפרדת זחלים חיוביים דימום, אתה יכול להשתמש דגים ללא פיגמנט או דגים המבטאים חלבון פלואורסצנטי בתאי דם אדומים. ביום השלישי, תחת מסך מיקרוסקופ פלואורסצנטי הזחלים כדי להבטיח את הביטוי של חלבון פלואורסצנטי. לאחר מכן מלא את תא ההרכבה של גיליון האור במדיה E3 המכילה 0.2%MS-222 לצורך הרדמה.

בעזרת פיפטה של פסטר, מעבירים טיפה אחת המכילה זחל אחד עד שישה זחלים למשטח צלחת פטרי יבש להרכבה. השתמש פיפטה כדי להסיר נוזלים ככל האפשר. הוסיפו ירידה של 1.5% בהמסה נמוכה מגוש החום של 45 מעלות צלזיוס לזחלים ולהשתמש ב נימי הרכבה של 800 מיקרומטר כדי למשוך את הזחלים במעלה הראש תחילה.

אם המיקום אינו מדויק, לגרש את הזחלים מן agarose ולהרים שוב. השאירו את נימי להתקרר ולאחר מכן להכניס לתוך תא גיליון האור. בתוכנת ההדמיה ZEN, לחץ ברציפות כדי לכוון את הזחלים ולחץ לרכוש כדי לרכוש תמונות מחסנית z של הראש בין עדשות העין.

בכרטיסיה 'עיבוד', צור תמונת הקרנה בעוצמה מרבית מכל מחסנית z. כדי לבחור באופן אקראי עבור משגיח תנועתיות, להעביר 24 זחלים לאחר הרדמה לתוך מדיה E3 טרי ולאפשר לבעלי החיים להתאושש הרדמה. לאחר הזחלים התאוששו לחלוטין מהרדמה, באמצעות פיפטה עם העברת הקצה לחתוך זחלים התאושש לתוך E3 בינוני ללא כחול מתילן.

צלחת זחל אחד במיליליטר אחד לכל באר של צלחת 24 באר. טען את הלוחית לתא המצלמה. בתוכנת המעקב את'ו ויז'ן XT, התאימו את הגדרות הניסוי כדי להגדיר שגרת בהלה לאור לבן כדי להגביר את תנועת השחייה וההתרגם הספונטנית למשך 10 דקות.

חזור על תצהיר הקטר ב 96 ו 120 שעות לאחר דשן. הערכה של מוות תאי המוח באמצעות כל מקום מהוסס Annexin V M קו הכתב הווריד תוצאות אשכולות ברורים מובהקים של תאים גוססים בזחלים מדממים הנעדרים בכל הזחלים שאינם מדממים המצוין על ידי פלואורסצנטיות ירוקה תמונות שדה בהיר להדגים את נוכחותם של דימומים במוח. תאים גוססים נצפו הן במודלים של Atorvastatin והן במודלים של ראש בועה לזחלים מדממים.

המורפולוגיה של המקרופאגים החיוביים MPEG1 משתנה בזחלים חיוביים של דימום תוך-מוחי כאשר התאים מאמצים בצורת אמובואיד מעוגלת פעילה. תאים מעוגלים מופעלים אלה היו במעקב לאורך זמן כדי להראות תגובה phagocytic מוגברת של אוביקיטין מופרש Annexin V M ורידים המביעים תאים גוססים בזחלים חיוביים דימום תוך מוחי. דימום מוחי קשור לירידה משמעותית בהנעה ב-72 ו-96 שעות לאחר ההפריה בהשוואה לשליטה שלילית בדימום תוך-מוחי.

תנועתיות ב 120 שעות לאחר ההפריה מתאוששת לרמות כמעט בסיסיות. ההיבט החשוב ביותר של הליך זה הוא להיות בטוח ביסודיות לבחון את הזחלים עבור נוכחות או היעדר דימומים במוח לפני שתמשיך לבדיקה פנוטיפית. מודל זה יכול לשמש גם להקרנת סמים כדי לקבוע אם חומרת פנוטיפ ניתן לשפר לאחר דימום, גישה אשר עשוי להוביל אותנו לזהות מועמדים חדשים לסמים בעתיד.

טכניקה זו מאפשרת לנו לחקור את התגובות התאיות מיד לאחר דימום במוח במהלך נקודת זמן אשר היה כל כך ידוע לשמצה קשה ללמוד עד עכשיו. למרות שאף אחד מהריגטים או המכשירים המתוארים בפרוטוקול זה אינו מסוכן במיוחד, יש לנקוט טיפול סטנדרטי ואמצעי זהירות בכל פעם שמשתמשים בכימיקלים, חדים או לייזרים.