מחזיק מדגם All-in-one עבור קריסטלוגרפיה Macromolecular X-ray עם פיזור רקע מינימלי
6 ביולי 2019
מחזיק לדוגמה הרומן לקריסטלוגרפיה macromolecular רנטגן יחד עם פרוטוקול טיפול מתאים מוצג. המערכת מאפשרת צמיחה גביש, הטבילה גביש באוסף נתונים עקיפה באתרו בשניהם, הסביבה ואת הטמפרטורה הקריוגני ללא צורך של כל מניפולציה גביש או הרכבה.
מחזיק מדגם זה יכול לשמש לגידול גבישים ואיסוף נתוני דיפוזיה של קרני רנטגן. מחזיק מדגם זה נעשה לשימוש על צלחות 24 באר אשר נמצאים בשימוש נרחב בקהילת MX. ההיבט החשוב ביותר הוא שאין צורך במניפולציה.
מחזיק מדגם המציג היבטים אלה המתוארים כאן לא היה קיים קודם לכן. לראות משהו זה תמיד הרבה יותר טוב מאשר לקרוא על זה. על ידי צפייה בסרטון, משתמש פוטנציאלי יכול לתפוס את התכונות והמורכבות של מחזיק הדגימה החדש באופן מיידי.
כדי להתחיל, צור משטח נקי ונשחרר מאבק באמצעות מטלית לחה ונשחררת מוך. קח מחזיק מדגם אחד מהתיבה שלו והצב אותו בעדינות, רדיד אלומיניום צהוב פונה כלפי מעלה, על המשטח הנקי כדי למנוע נזק או ניקוב לא רצוי של רדיד COC האחורי. הגדר את טיפות התגבשות על רדיד צהוב כפי שהוא ייעשה על שקופיות כיסוי נפוץ.
מניחים את הטיפות בעדינות, כדי למנוע כל קרע או פירסינג של רדיד באמצעות פיפטה. במחזיקי מדגם מסוג 2 וסוג 3, שתי טיפות הן המקסימום המומלץ. במחזיק מדגם מסוג 1, ניתן להציב עד שלוש טיפות.
הופכים את מחזיק הדגימה ומ מניחים אותו על חלל משומן מראש של צלחת בסגנון לינברו 24 באר. השתמשו בעזרי המיקום של מחזיק הדגימה כדי להנחות אותו למיקום האופטימלי שלו. ודא את המיקום הנכון של מחזיק הדגימה על מנת למנוע אידוי לא רצוי.
על ידי הנחת לוח ההתגבשות תחת מיקרוסקופ אור שידור, ללא או בלי מקטבים, לפקח על צמיחת גביש ללא כל הפרעה של הניסוי. בצע קריו-פרוטקציה תחת מיקרוסקופ של אור שידור. לנקב בעדינות את רדיד COC החיצוני באמצעות canula בסדר.
ודא שהרדיד הצהוב הפנימי נותר ללא שינוי. הדקירה צריכה להיות ממש ליד הירידה שיש לתמרן. הכנס פתיל נייר משובח לחור התקוע.
בזהירות לדחוף את הפתיל קדימה עד שהוא נוגע בנייר הפולימיד הצהוב. שמור על הפתיל במגע עם רדיד הכסף מחורר. הפתיל ישאב את כל הפתרון העודף.
הזמן הנדרש להסרת נוזלים מלאה תלוי צמיגות של הפתרונות ואת הרכב המשקאות האם. אחרי שכל הנוזל נשאב משם, בעדינות לסגת פתיל הנייר. זכור את המיקום של הירידה, שכן זה לא יכול להיות גלוי לאחר הסרת המשקאות האם.
קח פיפטה סטנדרטית כדי להחיל נפח קטן של פתרון מגן קריו, באמצעות קצה מובלט דרך אותו חור. כדי לסנות מחדש את רדיד ה- COC המרפא את עצמו, מניחים בעדינות אצבע מוגנת על החור למשך כשני שנייה ומחלקים אותו על-פני הדקירה. הלחץ הקל בשילוב עם הטמפרטורה הגבוהה יקדם את החרימות מחדש של נקבים שהם לא גדולים מדי.
ממיסים את הליגנד באלכוהול אם בריכוז הרצוי בצינור תגובה. לסובב את הפתרון במשך 10 דקות ב 12, 000 פעמים גרם כדי להסיר חלקיקים מסיסים. יש להשתמש בצנטריפוגה מבוקרת טמפרטורה במידת הצורך.
מניחים בעדינות מקסימום שלושה מיקרוליטרים של פתרון המכיל ליגנד בפער שבין רדיד ה- COC לסרט הפולימיד באמצעות קצה פיפטה ארוך ומובלט;לסגת מהקצה. כדי לסנות מחדש את רדיד ה- COC המרפא את עצמו, מניחים בעדינות אצבע מוגנת על החור למשך כשני שנייה ומחלקים אותו על-פני הדקירה. דגירה הניסוי במשך זמן מה כדי לאפשר דיפוזיה על פני הממברנה.
זמן ההשריה תלוי מאוד צמיגות של פתרון פיזור ומרכיביו. חזור על שלבי השריית ליגנד מספר פעמים כדי להשרות לאחר מכן ליגנדים שונים. כדי למזער את פיזור הממסים, הסר פתרון עודף לפני איסוף הנתונים.
ודאו סביבת קורות יציבה ומבוקרת לחות עם תנאים שנקבעו מראש. כדי לבצע איסוף נתוני דיפוזיה במקום בטמפרטורת הסביבה, הרם בעדינות את רדיד ה- COC השקוף בנקודה המיועדת באמצעות מלקחים וקלף אותו. עכשיו בעדינות להרים את מחזיק המדגם מהחלל שלה ולהכניס אותו מיד לתוך בסיס מחזיק מדגם מגנטי מוכן מראש.
אין צורך בדבק עבור שלב זה. יש להפעיל לחץ עדין כדי להבטיח את המיקום הנכון של מחזיק הדגימה בתוך הבסיס. למחזיקי דגימה עם טבעת חיצונית נשלפת, יש להפעיל לחץ עדין על ידי החזקת הטבעת החיצונית ולשבור אותה בנקודות ההפסקה המיועדות.
הדוגמה מוכנה כעת לאיסוף נתוני מרכונים ועבירה. הר את מחזיק הדגימה על גוניומטר קורן ולהבטיח מיקום נכון של המחזיק. בהתאם לגיאומטריית הגוניומטר, ניתן לסובב את מחזיק הדגימה עד 160 מעלות מבלי לגרום להצלה במהלך ניסוי ההפשטה.
השתמש פתיל נייר בעדינות לגעת בנייר פולימיד צהוב מהישבן כדי להסיר עודף ליקר אמא. הדוגמה מוכנה כעת לאיסוף נתוני מרכונים ועבירה. היכונו לאיסוף נתוני דיפרציה במקום בטמפרטורה קריוגנית כפי שנעשה לטמפרטורת הסביבה, ואז לצלול את המדגם לתוך חנקן נוזלי ולהעביר אותו לתוך בקבוקון תואם SPINE.
הגיאומטריה של סוגי מחזיק הדגימה 2 ו -3 מאפשרת את העברתם לבקבוקונים לדוגמה סטנדרטיים של SPINE, אשר ניתן להשתמש בהם להרכבה מדגם בסיוע רובוט. מחזיק הדגימה סוג 1 וסוג 2 תוכננו להתאים לגם של צלחת בסגנון לינברו 24 בארות. כל מחזיק מדגם מכיל עזרי מיקום משני צדי השפה החיצונית על מנת להבטיח מיקום אופטימלי על שפת הבאר.
צלחת בסגנון לינברו 24 באר שימש עם מחזיק מדגם מסוג 1 כדי לצייד טיפה ב 293 קלווין נגד 500 microliters של משקאות חריפים אמא. גבישים של 40 עד 50 מיקרון נצפו לאחר חמש שעות באמצעות מיקרוסקופ אור שידור עם או בלי מקטב. מחזיק מדגם עם גבישי ליזוזיים לבנים ביצה הוצב בזרם אוויר מבוקר לחות על קורת HZB-MX 14.3.
תמונת דיפוזיה טיפוסית מוצגת כאן. לא ניתן לזהות פיזור רקע מוגבה על תמונת ההתעקנות. זה קריטי כי זיהומים של רדיד פולימיד יש להימנע.
כמו כן, חשוב כי מחזיק המדגם ממוקם במדויק מניפולציה גביש מתבצע בזהירות. מחזיק הדגימה מאפשר טיפול בגבישים עדינים מאוד, אחד השלבים החשובים ביותר בקריסטלוגרפיה מיקרומולקולרית. השימוש בו מקטין מאוד את הסיכוי להרוס את המדגם.
סקירה כללית
מוצג מחזיק דגימות חדש עבור קריסטלוגרפיית קרני X של מקרו-מולקולות, המאפשר גידול של גבישים ואיסוף נתוני דיפרקציה in situ בטמפרטורות שונות ללא מניפולציה של הגביש.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- קריסטלוגרפיה של קרני X למקרו-מולקולות
- טכניקות לגידול גבישים
- איסוף נתוני דיפרקציה
רקע
- שיטות מסורתיות דורשות מניפולציה של גבישים, דבר העלול להוביל לשגיאות.
- מחזיקי דגימות קיימים אינם מאפשרים טיפול קל במהלך ניסויים.
- פלטות בעלות 24 בארות נמצאות בשימוש נפוץ בקהילת ה-MX לצורך קריסטליזציה.
- ניטור גידול הגבישים ללא הפרעה הוא קריטי להשגת תוצאות מדויקות.
מטרת המחקר
- להציג מחזיק דגימה המפשט את תהליך גידול הגבישים ואיסוף הנתונים.
- לבטל את הצורך במניפולציה של הגבישים במהלך הניסויים.
- לספק פרוטוקול לשימוש יעיל במחזיק הדגימות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת משטח נקי עבור מחזיק הדגימה.
- הנחת טיפות התגבשות על המחזיק.
- ניטור צמיחת הגבישים באמצעות מיקרוסקופ אור חדירה (transmission-light microscope).
- איסוף נתוני דיפרקציה in situ בטמפרטורת החדר ובטמפרטורות קריוגניות.
תוצאות עיקריות
- נצפתה צמיחה מוצלחת של גבישים במינימום מניפולציות.
- איסוף הנתונים הניב תמונות דיפרקציה ברורות ללא פיזור רקע.
- תושבות דגימה תוכננו לתאימות עם פלטות סטנדרטיות של 24 בארות.
- הוקמו פרוטוקולים יעילים להגנה קריוגנית ולהספגת ליגנדים.
מסקנות
- מחזיק הדגימות החדש משפר משמעותית את קלות ביצוע ניסויי קריסטלוגרפיה של קרני X.
- הוא מאפשר ניטור ומניפולציה יעילים של תהליכי התגבשות.
- חדשנות זו יכולה לשפר את איכות נתוני הדיפרקציה שנאספו.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
קריסטלוגרפיה של קרני X למקרו-מולקולות נותרה אבן יסוד בביולוגיה מבנית ברזולוציה גבוהה לצורך גילוי תרופות, אך טיפול בגבישים שבירים כרוך בסיכון משמעותי לאובדן דגימות ולהדרדרות בנתונים. מחזיק דגימות רב-תכליתי זה ממזער את ההתערבות המכנית במהלך גידול הגבישים, ספיגת ליגנדים, קריו-הגנה ואיסוף נתונים, ובכך מגדיל את הסבירות להשגת נתוני דיפרקציה שמישים מגבישים מקרו-מולקולריים עדינים. על ידי הפחתת נזקים הנגרמים מטיפול, הכלי תומך בקביעה מהימנה יותר של מבנה המטרה, שלב מוקדם וקריטי בתכנון תרופות מונחה-מבנה ובאופטימיזציה של תרכובות מובילות (lead optimization).
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר אפיון מבני של מטרות מקרו-מולקולריות שבירות מבלי לגרום לנזק לסריג במהלך המניפולציה.
- ערך תפעולי: מפחית את אובדן הגבישים במהלך שלבי ההשריה של ליגנדים וההגנה בקריוגניה, ובכך משפר את שיעורי ההצלחה בשלבים מוקדמים של הפחתת סיכונים במטרות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: תומך בניטור in situ של גדילה של גבישים ודיפוזיה של ליגנדים תחת תנאים מבוקרים, ומאפשר הערכה בזמן אמת של קישור תרכובות.
- ערך תפעולי: מבטל את הצורך בהעברת גבישים בין פלטות או תושבות, ובכך מייעל את זרימת העבודה עבור סריקת התגבשות בעוצמה גבוהה (high-throughput).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מספק נתונים מבניים מגבישים במצב טבעי (native-state) שנשמרו באמצעות טיפול מינימלי, ובכך מגביר את הביטחון במודלים של אינטראקציה בין יעד לליגנד.
- ערך תפעולי: תואם לפלטות Linbro סטנדרטיות בעלות 24 בארות ולמבחנות SPINE, מה שמקל על השילוב במערכות אוטומטיות להרכבת גבישים ובקווי קרן (beamline).
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד (Pipeline)
מחזיק הדגימות תומך בזרימת עבודה רציפה, החל מהכנת טיפות הגביש ועד לאיסוף נתוני עקיפת קרני X in situ בטמפרטורת החדר או בטמפרטורות קריוגניות, ובכך הוא מפחית את מספר שלבי ההעברה בין שלבי הגילוי לשלבי האימות המבני.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת היפותזות באמצעות תצפית מבנית על מצבים קשורי-ליגנד ללא פגיעה בשלמות הגביש במהלך הסריקה.
- סריקה: מספקת פלטפורמה סטנדרטית וניתנת לשימוש חוזר להקמה ומעקב אחר טיפות, ובכך משפרת את השחזוריות בין ניסיונות הגבשת שונים.
- אנליטיקה: מניבה תמונות דיפרקציה עם רקע נמוך המתאימות למיפוי כמותי של צפיפות אלקטרונים ולאישור תנוחת הליגנד.
- מחקר תרגומי: שומרת על חיוניות הגביש משלב הסריקה בטמפרטורת הסביבה ועד לאיסוף נתונים קריוגני, מה שמאפשר ניתוח מבני רציף.
- שימוש חוזר ארגוני: תוכננה לשימוש חוזר במספר יעדים ומסעות סריקה, ובכך מפחיתה את בזבוז החומרים המתכלים ואת זמן ההקמה במתקני קריסטלוגרפיה משותפים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בנתונים מבניים על ידי מזעור ארטיפקטים הנגרמים מטיפול במיקרו-גבישים ושימור האריזה הגבישית הטבעית.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של שלבי המניפולציה של הגבישים, ובכך מפחית שונות ועומס הדרכה בקרב צוותים רב-תחומיים.
- ערך אסטרטגי: מוריד את שיעור הכשלונות בפרויקטים של קביעת מבנה, ובכך משפר את ההחזר על ההשקעה במאמצי תיקוף המטרה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר קבלת החלטות מהירה יותר לגבי המשך הפרויקט (go/no-go) על בסיס נתונים מבניים מהימנים, ומפחית נשירה בשלבים מאוחרים עקב הנחות שגויות לגבי המטרה.
שיקולי יישום
- דורש היכרות עם טכניקות מיקרופיפט ומיקרוסקופיה של אור פלואורסצנציה או אור תמסורת לצורך הגדרת הטיפה ומעקב אחריה.
- תלוי בגישה לקווי קרן (beamlines) המצוידים לדיפרקציה in situ ולסביבות בבקרה על הלחות.
- מחייב הכשרה סטנדרטית כדי להבטיח עקביות בפעולות ניקוב הרדיד, שימוש בפתיל ופרוצדורות איטום מחדש בין המשתמשים.
- יש להתחשב בהבדלים בצמיגות של תמיסת האם בעת אופטימיזציה של משכי הזמן להשריה של ליגנדים וחומרים קריו-פרוטקטורים.
- מוגבל לפורמטים תואמים של פלטות (למשל, סגנון Linbro עם 24 בארות) ועשוי לדרוש התאמה עבור פלטפורמות סריקה לקריסטליזציה אחרות.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:04
Title
0:37
Setting up Crystallization Drops and Observing Crystal Growth
1:56
Crystal Manipulation
4:23
In Situ Diffraction Data Collection at Ambient Temperature and at Cryogenic Temperature
6:20
Results: Novel Sample Holder in Macromolecular X-Ray Crystallography for Crystal Growth, Crystal Manipulation, and X-Ray Diffraction Data Collection
7:23
Conclusion
