Name: ניתוח אינטראקציות בין האנדוביוטיקה לבין מיקרוביוטה של האדם באמצעות מערכות תסיסה מחוץ לאמבט (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 s
Description: חקור אינטראקציות בין אנדוביוטיקה למיקרוביוטה של המעי באמצעות מערכות תסיסה מחוץ לאמבט. שיטה זו מאפשרת סינון מהיר בעלות נמוכה ללא הפרעות מטבוליזם המארח.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (No. 31741109), קרן הונאן למדעי הטבע (No. 2018JJ3200), ואת התוכנית לבנות של משמעת אופיינית מיושם באוניברסיטת הונאן של המדע וההנדסה. אנו מודים LetPub (www.letpub.com) על הסיוע הלשוני שלה במהלך הכנת כתב היד הזה.

פרוטוקול זה עוקב אחר ההנחיות של ועדת האתיקה של הונאן אוניברסיטת המדע והנדסה (הונאן, סין), ואת אוניברסיטת ג'ה-ג'יאנג גונגאנג (ג'ג'יאנג, סין).
1. הכנת חיידקים
<ol><li>הכנת מרק בינוני ביפידוחיידק<ol>
<li>שלב את הרכיבים הבאים ב 950 מ ל של מים מזוקקים: תמצית בשר, 5 g/L; תמצית שמרים, 5 גר'/L; פנימה של קזאין, 10 גרם/ליטר; soytone, 5 g/L; גלוקוז, 10 g/L; K2hpo4, 2.04 g/L; MgSO4· 7h2O, 0.22 g/L; . בסדר. H20, 0.05 g/L; המשך, 5 גר'/L; . רצף 80, 1 מ ל תמיסת מלח, 40 mL (CaCl2.2 h2O, 0.25 g/L; KH2פו4, 1 g/L; נחקו3, 10 גר'/L; הרוג, 2 גרם/ליטר); ו resazurin, 0.4 mL (2.5 mg/L). להתאים את ה-pH כדי 6.8 עם 2 M NaOH.</li>
<li>אוטוקלב ב 121 ° c עבור 15 דקות ולאפשר ציר להתקרר לטמפרטורת החדר (RT) תחת תנאים אנאירובית (10% H2, 10% CO2, 80% N 2). הוסף סינון-מעוקר cysteine-HCl (0.5 g/L) ו-mupirocin (5 מ"ג/L) למדיום.</li>
</ol>
</li>
<li>להוסיף סדרת מחלקים (50 μl) של הקפואים bifidobacterium לונגום לצינור תרבות עם 5 מ ל של ציר בינוני של bifidobacterium תחת תנאים אנאירובית, אז תרבות בחממה אנאירובית עבור 24 h ב 37 ° c.</li>
</ol>2. הכנת משקפיים
<ol><li>הכנת בינונית-PYG אגר<ol>
<li>שלב את הפעולות הבאות: peptone, 20 g/L; תמצית שמרים, 10 גרם/ליטר; גלוקוז, 5 g/L; המשך, 0.08 ג'/ל; CaCl2, 0.008 g/L; MgSO4· 7h2O, 0.008 g/L; K2hpo4, 0.04 g/L; KH2PO4, 0.04 g/L; נחקו3, 0.4 ג'/ל; אגר, 12 g/L. להתאים את ה-pH כדי 7.2 באמצעות 10 M NaOH.</li>
<li>אוטוקלב את התקשורת ב 121 ° c עבור 15 דקות וקריר עד ~ 50 ° c. אז, עבור 1 L של בינוני, להוסיף 0.5 mL של מסנן ויטמין K1 פתרון (1 גרם של ויטמין k1 מומס 99 mL של 99% אתנול), 5 מ ל של פתרון האמין (0.5 g של האמין הומס 1 מ ל 1 מול/L ' naoh , ואז הביא עד 100 mL עם מים מזוקקים), ו 0.5 g של cysteine-HCl.</li>
<li>לפני שיוצקים את לוחיות PYG, להוסיף מסנן-מעוקר 5-bromo-4-כלורט-3-indolyl β-D-גלטופאוסייד (X-גל, 0.06 g/L), LiCl · 3H2O (5.7 g/l) ו-mupirocin (5 מ"ג/l) למדיום. הערה: X-Gal ו-LiCl. 3H2O לאפשר זיהוי של B. longum מושבות על לוחות באמצעות שינויי צבע.</li>
</ol>
</li>
<li>מחסן 20 μL של B. longum זנים (שלב 1.2) כדי pyg צלחות ומקום בחממה אנאירובית ב 37 ° c עבור 72 h.</li>
<li>לאסוף מושבות חיידקי mucoid מן הצלחות PYG באמצעות סקופ שקילה, ואז לחלוטין להשעות בתוך 10 מ ל של פוספט מאגור מלוחים (PBS) באמצעות מתנד מערבולת. הערה: תערובות בקטריאלי ו-EPS צריך להיות מושהה לחלוטין על ידי vortexing או ללטף למעלה ולמטה שוב ושוב עד הסיבים מומס לחלוטין ב-PBS.</li>
<li>צנטריפוגה את ההשעיה ב 6,000 x g עבור 5 דקות.</li>
<li>העבירו בזהירות את הסופרנטנים לצינור הצנטריפוגה החדש וערבבו לגמרי עם שלושה כרכים של קור 99% אתנול על ידי היפוך ומיזוג חוזרות ונשנות.</li>
<li>צנטריפוגה את התערובת ב 6,000 x g עבור 5 דקות לחלוטין להסיר את supernatants.</li>
<li>הסר את הזרזים מצינורות הצנטריפוגה על ידי גירוד וייבוש של מחלץ EPS לילה באמצעות ואקום מהירות.</li>
</ol>3. הכנת מדיום תסיסה
<ol><li>הכנת מדיום תרבות בסיסית VI<ol>
<li>שלב את הפעולות הבאות: peptone, 3 g/L; טריטונים, 3 גר'/L; תמצית שמרים, 4.5 g/L; mucin, 0.5 g/L; מלחי מרה מס ' 3, 0.4 g/L; המשך, 4.5 ג'/ל; KCl, 2.5 g/L; MgCl2· 6h2O, 4.5 g/L; 1 מ ל רצף 80; CaCl2. 6h2O, 0.2 g/L; KH2PO4, 0.4 g/L; MgSO4· 7h2O, 3.0 g/L; MnCl2· 4h2O, 0.32 g/L; FeSO4· 7h2o, 0.1 g/L; CoSO4· 7h2O, 0.18 g/L; CaCl2· 2h2O, 0.1 g/L; לאשר את היום4· 7h2O, 0.18 g/L; CuSO4· 5h2O, 0.01 g/L; ו-NiCl2· 6h2O, 0.092 g/L. להתאים את ה-PH כדי 6.5 עם HCl 1 M.</li>
<li>הכן את האמין והציסטנין כפי שנעשה בסעיף 2.1 והוסף לאחר התיקון והצינון.</li>
</ol>
</li>
<li>הכן מדיה תרבותית המכילה מקורות פחמן שונים עם מדיית בסיס VI. לפני הפעלה אוטומטית, יש להוסיף 8 גרם/ליטר של סיבי EPS ל-VI הבינוני, הכולל קבוצה VI_Bif. בנוסף, הוסף 8 עמילן g/L ל-VI הבינוני כדי לייצג קבוצה VI_Starch. לבסוף, VI בינונית ללא תוספת של מקור פחמן משמש כפקד (קבוצה VI). הערה: אם EPS ו עמילן הם הומס הראשון במים חמים באמצעות מגנטים מגנטיים, ולאחר מכן מעורבב עם הכין מדיום VI.</li>
<li>האוטוקלב כל המדיה ב 121 ° c עבור 15 דקות ולאפשר קריר כדי RT.</li>
<li>העבר מדגם משנה (5 מ"ל) של כל בינוני לצינורות תרבות בחממה אנאירובית, ואחסן את המדיה הנותרת ב-4 ° c.</li>
</ol>4. הכנה לדגימת צואה של אדם
<ol><li>לאסוף דגימות בצואה טרי מיד לאחר הצרכים הטריים מתנדבים בריאים מבוגרים אנושיים באמצעות מכולות צואה, ולאחר מכן להשתמש לקראת הכנה להשתהות. הערה: לפני איסוף המדגם, יש להקפיד על כל המתנדבים כדי להבטיח שאין צורך בטיפול באנטיביוטיקה, בפרוביוטיקה או בטיפולים מוקדמים למשך שלושה חודשים לפחות לפני תרומת דגימות. בנוסף, כל התורמים חייבים לספק הסכמה מושכלת, בכתב.</li>
<li>העבר מדגם צואה טרי (1 גרם) עד 10 מ"ל של 0.1 M אנאירובית PBS (pH 7.0) לתוך כוסות זכוכית, ואז להשתמש מוטות זכוכית כדי להכין 10% (w/v) ללגום.</li>
<li>השתמש במכתש 0.4 מ"מ כדי לסנן את השימוש בצואה. לאחר מכן, השתמש במדגם משנה של המבחנות המסוננות כדי להשתמש בניסויי התסיסה של תרבות האצווה, ואחסן את השארית ב-80 ° צ' לניתוח נוסף. הערה: צעדים 4.2 – 4.3 מתנהלים בחדר אנאירובי.</li>
</ol>5. תסיסה מחוץ למבחנה
<ol><li>הוסף שאיפה מסוננים בצואה (500 μL) למדיום התסיסה שהוכן בשלב 3.2 בתוך חדר אנאירובי, ולאחר מכן דגירה ב 37 ° c.</li>
<li>לאסוף 2 מ ל של דגימות מותסס ב 24 h ו 48 h בחדר אנאירובי ולאחר מכן צנטריפוגה מחוץ לחדר ב 6,000 x g עבור 3 דקות.</li>
<li>העבירו בקפידה את הסופרנטנים לצינור הצנטריפוגה החדש שישמש לניתוח השפלה רב-סוכר וחומצות שומן קצרות (SCFAs) מדידות.</li>
<li>לאחסן את צנטריפוגה כדורי ב-80 ° c ולאחר מכן להשתמש להפקת DNA חיידקים גנומית.</li>
</ol>6. השפלה EPS על-ידי מיקרוביוטה של צואה אנושית
<ol><li>טען 0.2 μL של סופרנטנים מותטים על גבי סיליקה ג'ל מצופה מראש-60 לוחות אלומיניום ולאחר מכן יבש באמצעות מייבש שיער.</li>
<li>לפתח את הצלחות 20 מ ל של חומצה פורמית/n-butanol/מים (6:4:1, v:v: v) פתרון יבש באמצעות מייבש שיער.</li>
<li>משרים את הצלחות בתוך מגיב orcinol כדי לצבוע, ואז יבש באמצעות מייבש שיער.<ol>
<li>להכין orcinol ריאגנטים על ידי המסת 900 מ"ג של Lichenol ב 25 מ ל של מים מזוקקים ולאחר מכן הוספת 375 mL של אתנול. לאחר מכן, חומצה גופרתית מרוכזת צריך להתווסף לאט והפתרון מעורבב ביסודיות.</li>
</ol>
</li>
<li>לוחות חום ב120 ° c במשך 3 דקות בתנור אפייה והערכת השפלה של EPS על ידי מדידת להקות האהבה.</li>
</ol>7. השפעות EPS על מיקרוביוטה של המעי האנושי
<ol><li>הקפא הפשרה דגימות צואה המקורי הכין בשלב 4.3 ודגימות מותסס הכין בשלב 5.4.</li>
<li>לחלץ דנ א חיידקי גנומית (gDNA) מכל הדגימות באמצעות שרפרף בקטריאלי גנטי גנומית ערכת החילוץ בעקבות הוראות היצרן.</li>
<li>קביעת ריכוזי DNA, integrities, וגודל הפצות באמצעות מיקרו ספקטרוסקופיה ואלקטרופורזה ג'ל אגר.</li>
<li>התנהלות ה-PCR של גנים rRNA של בקטריאלי 16 מ-gDNA שחולצו באמצעות הבאים תיאר בעבר והפוך התחל12: -קדימה פריימר (ברקוד פריימר 338F): הוראות -הפוך פריימר (806R): מהפך השתמש בתנאי הציקלer התרמיים הבאים:<ol>
<li>94 ° c עבור 5 דקות.</li>
<li>94 ° c עבור 30 ס מ.</li>
<li>55 ° c עבור 30 ס מ.</li>
<li>72 ° c במשך 1 דקות.</li>
<li>חזור על 2 – 4 עבור 35 מחזורים</li>
<li>72 ° c עבור 5 דקות.</li>
<li>4 ° c להחזיק עד ההסרה של הציקלאה תרמית.</li>
</ol>
</li>
<li>ניהול רצף התפוקה הגבוהה של מוצרי ה-PCR בחברה ברצפי DNA באמצעות התפוקה ברמה גבוהה ביותר מיקרוביאלית הקהילה בדיקות.</li>
<li>השיגו רצפים איכותיים ונקיים בעזרת התובנות הכמותיות לניתוח רצף של מיקרוביאלית (QIIME).</li>
<li>הגדרת יחידות מיסוי מבצעיות (OTUs) עבור רצפי הגנים של 16S rRNA עם יותר מ-97% נוקלאוטיד דמיון באמצעות כלים ביואינפורמטיקה כגון חבילת התוכנה של מוארתור14.</li>
<li>בחר רצף מייצג מכל OTU והשתמש במסווג ה-RDP יחד עם מסד הנתונים הטקמי של סילבה כדי לסווג רצפים מייצגים15.</li>
<li>לחשב כיסוי של טוב, מדדים מגוון אלפא (כולל המדד סימפסון ושאנון), ועושר (מספר נצפה של OTUs) באמצעות כלים בביואינפורמטיקה16.</li>
</ol>8. השפעות EPS על הפקת SCFA על ידי מיקרוביוטה המעי האנושי
<ol><li>הוסיפו סופרנטנים מותטים (1 מ ל) המוכנים בשלב 5.3 עד 2 מנורות צנטריפוגה.</li>
<li>הוסף 0.2 mL של 25% (w/v) חומצה מטאמזרחנית לכל הדגימות ולערבב ביסודיות את הפתרונות על ידי vortexing.</li>
<li>צנטריפוגה את התערובות ב 13,000 x g עבור 20 דקות ולהעביר את supernatants כדי צינורות טריים.</li>
<li>במקביל, להכין פתרונות 120 של propionic mM אצטית, בוטירית, איזווטיריק, חומצות ואלאריק ו isobutyric. אז, להוסיף 1 מ ל של כל חומצה מוכנה ל 1.2 mL של 25% (w/v) חומצה מטורית ולהשתמש כמו קוקטיילים סטנדרטיים.</li>
<li>מסננים את הדגימות באמצעות קרום μM 0.22.</li>
<li>זיהוי ריכוזי scfa באמצעות כרומטוגרפיה גז ביצועים גבוהים לפי פרוטוקולים שתוארו בעבר11,17. הערה: העמודה InertCap FFAP (0.25 mM x 30 m x 0.25 μM) משמש כרומטוגרפיה גז (GC). ריכוזי SCFA מבוססים לאחר מכן על בסיס אזורי שיא באמצעות שיטת התקן הפנימי של נקודה אחת בחבילת התוכנה של הפתרון GC.</li>
</ol>

<ol><li>Maarten, V. D. G., Blottière Hervé, M., Doré, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humans+as+holobionts%3A+implications+for+prevention+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Humans as holobionts: implications for prevention and therapy.</a> Microbiome. 6 (1), 81(2018).</li>
<li>Allen, A. P., Dinan, T. G., Clarke, G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+psychology+of+the+human+brain-gut-microbiome+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Social+and+Personality+Psychology+Compass%22%5BJournal%5D)">A psychology of the human brain-gut-microbiome axis.</a> Social and Personality Psychology Compass. 11 (4), e12309(2017).</li>
<li>Arora, T., Bäckhed, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut+microbiota+and+metabolic+disease%3A+current+understanding+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">The gut microbiota and metabolic disease: current understanding and future perspectives.</a> Journal of Internal Medicine. 280, 39-349 (2016).</li>
<li>Maurice, C., Haiser, H., Turnbaugh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenobiotics+shape+the+physiology+and+gene+expression+of+the+active+human+gut+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Xenobiotics shape the physiology and gene expression of the active human gut microbiome.</a> Cell. 152 (1-2), 39-50 (2013).</li>
<li>Carmody, R. N., Turnbaugh, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-microbial+interactions+in+the+metabolism+of+therapeutic+and+diet-derived+xenobiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Host-microbial interactions in the metabolism of therapeutic and diet-derived xenobiotics.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4173-4181 (2014).</li>
<li>Lu, K., Mahbub, R., Fox, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenobiotics%3A+interaction+with+the+intestinal+microflora%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+Journal%22%5BJournal%5D)">Xenobiotics: interaction with the intestinal microflora.</a> ILAR Journal. 56 (2), 218-227 (2015).</li>
<li>Taguer, M., Maurice, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+interplay+of+diet%2C+xenobiotics%2C+and+microbial+metabolism+in+the+gut%3A+implications+for+clinical+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">The complex interplay of diet, xenobiotics, and microbial metabolism in the gut: implications for clinical outcomes.</a> Clinical Pharmacology & Therapeutics. 99 (6), 588-599 (2016).</li>
<li>Anubhav, D., Meenakshi, S., Shankar, G. T., Mande, S. S., Wilson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenobiotic+metabolism+and+gut+microbiomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Xenobiotic metabolism and gut microbiomes.</a> PLoS One. 11 (10), e0163099(2016).</li>
<li>Koppel, N., Rekdal, V. M., Balskus, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+transformation+of+xenobiotics+by+the+human+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chemical transformation of xenobiotics by the human gut microbiota.</a> Science. 356 (6344), 1246-1257 (2017).</li>
<li>Hidalgo-Cantabrana, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+overview+and+biological+functions+of+exopolysaccharide+biosynthesis+in+Bifidobacterium+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Genomic overview and biological functions of exopolysaccharide biosynthesis in Bifidobacterium spp.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (1), 9-18 (2014).</li>
<li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+bifidobacteria-produced+exopolysaccharides+on+human+gut+microbiota+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Effects of bifidobacteria-produced exopolysaccharides on human gut microbiota in vitro.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. , 1-10 (2018).</li>
<li>Tang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbial+profile+is+altered+in+primary+biliary+cholangitis+and+partially+restored+after+UDCA+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Gut microbial profile is altered in primary biliary cholangitis and partially restored after UDCA therapy.</a> Gut. 67 (3), 534-541 (2018).</li>
<li>Kuczynski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+QIIME+to+analyze+16S+rRNA+gene+sequences+from+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Using QIIME to analyze 16S rRNA gene sequences from microbial communities.</a> Current Protocols in Microbiology. 27 (1), 1-28 (2012).</li>
<li>Hiltemann, S. D., Boers, S. A., van der Spek, P. J., Jansen, R., Hays, J. P., Stubbs, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galaxy+mothur+Toolset+%28GmT%29%3A+a+user-friendly+application+for+16S+rRNA+gene+sequencing+analysis+using+mothur%5BTitle%5D)+AND+%22GigaScience%22%5BJournal%5D)">Galaxy mothur Toolset (GmT): a user-friendly application for 16S rRNA gene sequencing analysis using mothur.</a> GigaScience. , giy166 (2018).</li>
<li>Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%C3%AFve+Bayesian+classifier+for+rapid+assignment+of+rRNA+sequences+into+the+new+bacterial+taxonomy%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Naïve Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy.</a> Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5261-5267 (2007).</li>
<li>Schloss, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introducing+mothur%3A+open-source%2C+platform-independent%2C+community-supported+software+for+describing+and+comparing+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7537-7541 (2009).</li>
<li>Bai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+on+the+in+vitro+effects+of+pseudomonas+aeruginosa+and+seaweed+alginates+on+human+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Comparative study on the in vitro effects of pseudomonas aeruginosa and seaweed alginates on human gut microbiota.</a> Plos One. 12 (2), e0171576(2017).</li>
<li>Zhang, Z., Xie, J., Zhang, F., Linhardt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin-layer+chromatography+for+the+analysis+of+glycosaminoglycan+oligosaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Thin-layer chromatography for the analysis of glycosaminoglycan oligosaccharides.</a> Analytical Biochemistry. 371, 118-120 (2007).</li>
<li>Simon, J. C., Marchesi, J. R., Mougel, C., Selosse, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-microbiota+interactions%3A+from+holobiont+theory+to+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Host-microbiota interactions: from holobiont theory to analysis.</a> Microbiome. 7 (5), (2019).</li>
<li>Postler, T. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+Holobiont%3A+how+microbial+metabolites+affect+human+health+and+shape+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Understanding the Holobiont: how microbial metabolites affect human health and shape the immune system.</a> Cell Metabolism. 26 (1), 110-130 (2017).</li>
<li>Kramer, P., Bressan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humans+as+superorganisms%3A+how+microbes%2C+viruses%2C+imprinted+genes%2C+and+other+selfish+entities+shape+our+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Perspectives+on+Psychological+Science%22%5BJournal%5D)">Humans as superorganisms: how microbes, viruses, imprinted genes, and other selfish entities shape our behavior.</a> Perspectives on Psychological Science. 10 (4), 464-481 (2015).</li>
<li>Malfertheiner, P., Nardone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiota%3A+the+forgotten+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+Diseases%22%5BJournal%5D)">Gut microbiota: the forgotten organ.</a> Digestive Diseases. 29 (6), (2011).</li>
<li>Andoh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut+microbiota+is+a+new+organ+in+our+body%5BTitle%5D)+AND+%22The+Japanese+journal+of+Gastro-Enterology%22%5BJournal%5D)">The gut microbiota is a new organ in our body.</a> The Japanese journal of Gastro-Enterology. 112 (11), 1939-1946 (2015).</li>
<li>Mika, A., Van, W. T., González, A., Herrera, J. J., Knight, R., Fleshner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+is+more+effective+at+altering+gut+microbial+composition+and+producing+stable+changes+in+lean+mass+in+juvenile+versus+adult+male+f344+rats%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Exercise is more effective at altering gut microbial composition and producing stable changes in lean mass in juvenile versus adult male f344 rats.</a> PLoS One. 10 (5), e0125889(2015).</li>
<li>Hugenholtz, F., de Vos, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+human+intestinal+microbiota+research%3A+a+critical+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Mouse models for human intestinal microbiota research: a critical evaluation.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (1), 149-160 (2018).</li>
<li>Takagi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-batch+fermentation+system+to+simulate+human+colonic+microbiota+for+high-throughput+evaluation+of+prebiotics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A single-batch fermentation system to simulate human colonic microbiota for high-throughput evaluation of prebiotics.</a> PLoS One. 11 (8), e0160533(2016).</li>
<li>Ning, T., Gong, X., Xie, L., Ma, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiota+analysis+in+rats+with+methamphetamine-induced+conditioned+place+preference%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Gut microbiota analysis in rats with methamphetamine-induced conditioned place preference.</a> Frontiers in Microbiology. 8 (1), 1620(2017).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי אינטרסים. הנתונים הצוטטים ביין ואח '. . בסדר, 11

התקדמות משמעותית נעשתה לקראת הבנה מיקרוביוטה הבטן האנושית הרכב ופעילויות בעשור האחרון. כתוצאה ממחקרים אלה, הושג הולובימונט, המייצג את האינטראקציות בין מחשבים מארחים לבין קהילות מיקרוביאלית הקשורות, כגון בין בני אדם לבין המעיים שלהם מיקרוביוטה19,20. יתר על כן, בני האדם נחשבים כעת גם כיום בתור סופר אורגניזמים21, שבו מיקרוביוטה בטן הוכרה כאחד האיברים הפונקציונליים בבני אדם22,23. הגוף ...

מיקרוביוטה במעיים ממלאים תפקיד חשוב בתפקוד המעי האנושי ובבריאות המארחת. כתוצאה מכך, המעיים microbiota לאחרונה להיות יעד חשוב למניעת מחלות וטיפול1. יתר על כן, בקטריה המעיים אינטראקציה עם תאי מעיים מארחים ומווסת תהליכים מארחים יסודיים, כולל פעילויות מטבוליות, זמינות מזינים, אפנון מערכת חיסונית, ואפילו תפקוד המוח וקבלת ההחלטות2,3 . אנדוביוטיקה יש פוטנציאל רב להשפיע על הרכב חיידקי וגיוון של מיקרוביוטה בטן. כך, אינטראקציות בין האנדוביוטיקה ומיקרוביוטה האדם משכו את תשומת הלב מחקר הגוברת4,5,6,7,8,9.
קשה להעריך את האינטראקציות בין האנדוביוטיקה לבין מיקרוביוטה האנושית בvivo בשל האילוצים הביואתיים וההגבלות הכלכליות. לדוגמה, ניסויים החוקרים את האינטראקציות בין האנדוביוטיקה לבין מיקרוביוטה האדם לא ניתן לבצע ללא אישור של מינהל המזון והתרופות, וגיוס מתנדבים הוא יקר. לכן, מודלים בעלי חיים משמשים לעתים קרובות לחקירות כאלה. עם זאת, השימוש במודלים בעלי חיים מוגבל בשל קומפוזיציות microbiota שונים וגיוון בבעלי חיים לעומת הקהילות הקשורות לאדם. חלופה בשיטת חוץ גופית כדי לחקור את האינטראקציות בין האנדוביוטיקה ומיקרוביוטה האדם הבטן היא באמצעות השימוש בניסויים בתרבות האצווה.
הפרפוליסכדים (EPSs) הם prebiotics שתורמים באופן משמעותי לשמירה על בריאות האדם10. ברור epss כי מורכב של קומפוזיציות חד-סוכר שונים ומבנים יכולים להפגין פונקציות נפרדות. ניתוחים קודמים קבעו את ההרכב של ביף EPSs, אשר הם הנציג הבכיר ממוקד במחקר הנוכחי11. עם זאת, אפקטים מטבוליים המשויכים למארח לא נחשבו ביחס לקומפוזיציה ולגיוון של EPS.
הפרוטוקול המתואר כאן משתמש במיקרוביוטה צואה מ -12 מתנדבים להחמיץ את ביף EPSs. כרומטוגרפיה של שכבה דקה (למעלה), 16 s rRNA התפוקה הגבוהה ברצף של הגז, כרומטוגרפיה גז (GC) משמשים בשילוב כדי לחקור את האינטראקציות בין EPSs לבין מיקרוביוטה בטן האדם. יתרונות שונים של פרוטוקול זה בהשוואה לניסויים vivo הם בעלות נמוכה והימנעות של אפקטים מפריעים מחילוף החומרים של המארח. יתרה מזאת, ניתן להשתמש בפרוטוקול המתואר במחקרים אחרים החוקרים את האינטראקציות בין האנדוביוטיקה לבין מיקרוביוטה בבטן האדם.

<table><tbody><tr><td>0.22 ומיקרו; מסנני ממברנה m</td><td>Millipore SLGP033RB</td><td></td><td>השתמש לסינון דגימות</td></tr><tr><td>0.4 מ"מ מסננת</td><td>תרמו פישר</td><td>308080-99-1</td><td>השתמש להכנת דגימות צואה אנושיות</td></tr><tr><td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl &beta;-D-galactopyranoside (X-Gal)</td> <td>Solarbio</td><td>X1010</td><td>השתמש להכנת צלחת צבע</td></tr><tr><td>Acetic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71251</td><td>מדגם סטנדרטי עבור SCFA</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Solarbio</td><td>YZ-1012214</td><td>הרכיב של</td></tr><tr><td>תא אנאירובי</td> בינוני <td>Electrotek&nbsp;</td><td>AW 400SG</td><td>תרבית חיידקים ותסיסה</td></tr><tr><td>חיטוי</td><td>SANYO</td><td>MLS-3750</td><td>השתמש לחיטוי</td></tr><tr><td>Bacto soytone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70178</td><td>הרכיב של</td></tr><tr><td>תנור אפייה</td> בינוני <td>שנחאי Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd</td><td>DHG-9240A</td><td>השתמש לחימום ואפייה</td></tr><tr><td>של תמצית בקר</td><td>Solarbio</td><td>G8270</td><td>הרכיב של בינוני</td></tr><tr><td>Bifidobacterium longum Reuter</td><td>ATCC</td><td>ATCC&reg; 51870&trade;</td><td>חיידקים</td></tr><tr><td>מלחי מרה</td><td>Solarbio</td><td>YZ-1071304</td><td>הרכיב של מדגם</td></tr><tr>סטנדרטי<td>בוטירי</td><td>בינוני Sigma-Aldrich</td><td>19215</td><td>עבור SCFA</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Solarbio</td><td>C7250</td><td>תמיסת מלח של</td></tr><tr><td>עמוד נימי</td> בינוני <td>SHIMADZU-GL</td><td>InertCap FFAP (0.25 מ"מ ופעמים; 30 מ' ופעמים; 0.25 &mu; m)</td> <td>משמש לזיהוי SCFA</td></tr><tr><td>קזאין פפטון</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>39396</td><td>הרכיב של</td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>בינונית Thermo Scientific</td><td>Sorvall ST 8</td><td>שימוש לצנטריפוגה</td></tr><tr><td>CoSO4.7H2O</td><td>Solarbio</td><td>C7490</td><td>הרכיב של</td></tr><tr><td>CuSO4.5H2O</td><td>Solarbio</td><td>203165</td><td>הרכיב של בינוני</td></tr><tr><td>Cysteine-HCl</td><td>Solarbio</td><td>L1550</td><td>הרכיב של</td></tr><tr><td>אתנול</td> בינוני <td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>השתמש להכנת ויטמין K1</td></tr><tr><td>FeSO4.7H2O</td><td>Solarbio</td><td>YZ-111614</td><td>הרכיב של</td></tr><tr><td>חומצה פורמית</td> בינונית <td>Sigma-Aldrich</td><td>399388</td><td>משמש</td></tr><tr><td>לכרומטוגרפיה של גז</td> TLC <td>Shimadzu Corporation</td><td>GC-2010 Plus</td><td>משמש לזיהוי SCFA</td></tr><tr><td>זכוכית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>FB10050</td><td>משמש להכנת תרחיץ</td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>Solarbio</td><td>G8760</td><td>הרכיב של</td></tr><tr><td>בינוני Haemin</td><td>Solarbio</td><td>H8130</td><td>הרכיב של</td></tr><tr><td>HCl</td> <td>בינוניSigma-Aldrich</td><td>30721</td><td>תמיסה בסיסית המשמשת להתאמת ה-pH של המאגרים</td></tr><tr><td>איזובוטירית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46935-U</td><td>מדגם סטנדרטי עבור</td></tr><tr><td>חומצות איזווולריות</td> SCFA <td>Sigma-Aldrich</td><td>129542</td><td>מדגם סטנדרטי עבור SCFA</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Solarbio</td><td>D9880</td><td>תמיסת מלח של</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Solarbio</td> בינוני<td>P9921</td><td>הרכיב של בינוני</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Solarbio</td><td>P7392</td><td>תמיסת מלח של</td></tr><tr><td>LiCl.3H2O</td><td>בינוני Solarbio</td><td>C8380</td><td>השתמש להכנת צלחת צבע</td></tr><tr><td>תמצית בשר</td><td>Sigma-Aldrich-Aldrich</td><td>70164</td><td>הרכיב של</td></tr><tr><td>חומצה מטפוספורית</td> בינונית <td>Sigma-Aldrich</td><td>B7350</td><td>דגימה סטנדרטית עבור SCFA</td></tr><tr><td>MgCl2.6H2O</td><td>Solarbio</td><td>M8160</td><td>הרכיב של</td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Solarbio</td><td>M8300</td><td>תמיסת מלח של מערכת</td></tr><tr><td>MISEQ</td><td>בינונית</td><td>Illumina MiSeq 300PE</td><td>רצף DNA</td></tr><tr><td>MnSO4. H20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8179</td><td>תמיסת מלח של</td></tr><tr><td>בינוני Mupirocin</td><td>Solarbio</td><td>YZ-1448901</td><td>אנטיביוטיקה</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Solarbio</td><td>YZ-100376</td><td>תמיסת מלח של בינוני</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792519</td><td>תמיסת מלח של בינוני</td></tr><tr><td>NanoDrop ND-2000</td><td>NanoDrop Technologies</td><td>ND-2000</td><td>קבע את ריכוזי ה-DNA</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30620</td><td>תמיסה בסיסית המשמשת להתאמת ה-pH של המאגרים</td></tr><tr><td>n-בוטנול</td><td>ChemSpider</td><td>71-36-3</td><td>משמש ל-TLC</td></tr><tr><td>NiCl2</td><td>Solarbio</td><td>746460</td><td>הרכיב של</td></tr><tr><td>Orcinol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>447420</td><td>בינוני המשמש להכנת ריאגנטים</td></tr> <tr><td>אורצינולPropionic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94425</td><td>מדגם סטנדרטי עבור SCFA</td></tr><tr><td>QIAamp DNA שרפרף מיני ערכת</td><td>QIAGEN</td><td>51504</td><td>לחלץ DNA גנומי חיידקי</td></tr><tr><td>אבקת PBS מוכנה לשימוש</td><td>סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ</td><td>A610100-0001</td><td>משמש להכנת תרחיף השומנים</td></tr><tr><td>Resazurin</td><td>Solarbio</td><td>R8150</td><td>ציוד אנאירובי</td></tr><tr><td>רכז ואקום מהירות</td><td>LABCONCO</td><td>CentriVap</td><td>השתמש להכנת EPS</td></tr><tr><td>עמילן</td><td>Solarbio</td><td>YZ-140602</td><td>השתמש למקור הפחמן</td></tr><tr><td>חומצה גופרתית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>150692</td><td>משמש להכנת ריאגנטים</td></tr> <tr>אורצינול<td>T100 PCR</td><td>BIO-RAD</td><td></td> 1861096 <td>הגברת PCR</td></tr><tr><td>TLC יריעות אלומיניום</td><td>MerckMillipore</td><td>116835</td><td>משמש ל-TLC</td></tr><tr><td>Trypticase פפטון</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>Z699209</td><td>הרכיב של בינוני</td></tr><tr><td>טריפטון</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T7293</td><td>הרכיב של בינוני</td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Solarbio</td><td>T8360</td><td>תמיסת מלח של בינוני</td></tr><tr><td>Valeric</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75054</td><td>מדגם סטנדרטי ל-SCFA</td></tr><tr><td>ויטמין K1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V3501</td><td>הרכיב של</td></tr><tr><td>מתנד מערבולת</td> בינוני Scientific <td>Industries</td><td>Vortex.Genie2</td><td>השתמש למערבולת</td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1625</td><td>הרכיב של</td></tr><tr><td>בינוני ZnSO4.7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z0251</td><td>הרכיב של המדיום</td></tr></tbody></table>

ניתוח אינטראקציות בין האנדוביוטיקה לבין מיקרוביוטה של האדם באמצעות מערכות תסיסה מחוץ לאמבט

Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems

מיקרואורגניזמים מעיים אנושיים הפכו לאחרונה למטרה חשובה של מחקר בקידום בריאות האדם ומניעת מחלות. כתוצאה מכך, חקירות של אינטראקציות בין אנביוקינטיקה (למשל, תרופות וטרום ביודונטיה) ומיקרוביוטה לבטן הפכו לנושא מחקר חשוב. עם זאת, בניסויים vivo עם מתנדבים אנושיים אינם אידיאליים למחקרים כאלה בשל ביואתיקה ואילוצים כלכליים. כתוצאה מכך, מודלים בעלי חיים שימשו להערכת האינטראקציות הללו בvivo. למרות זאת, לימודי מודל בעלי חיים עדיין מוגבלים בשיקולים ביולוגיים, בנוסף לקומפוזיציות והבדלים שונים של מיקרוביוטה בבעלי חיים לעומת בני אדם. אסטרטגיית מחקר אלטרנטיבית היא השימוש בניסויים תסיסה אצווה המאפשרים הערכה של האינטראקציות בין אנדוביוטיקה לבין מיקרוביוטה בטן במבחנה. כדי להעריך את האסטרטגיה הזאת, נעשה שימוש ב-EP (ביף) האקפוליסכאנטיות (בדומה) כנציג מסוג xenobiotic יוטי. לאחר מכן, האינטראקציות בין ביף EPS לבין מיקרוביוטה בבטן האדם נחקרו באמצעות מספר שיטות כגון כרומטוגרפיה של שכבה דקה, ניתוח מקומי קהילתי חיידקי עם רצף התפוקה הגבוה של 16 rRNA, וכרומטוגרפיה של גז של חומצות שומן קצרות (SCFAs). המוצג כאן הוא פרוטוקול לחקור את האינטראקציות בין האנדוביוטיקה לבין מיקרוביוטה האדם המעיים באמצעות מערכות תסיסה מחוץ למערכת. וחשוב מכך, פרוטוקול זה יכול להיות גם שונה כדי לחקור אינטראקציות כלליות בין האנדוביוטיקה אחרים המעיים microbiota.

הייצור של EPS mucoid ניתן לצפות ב -B. longum התרבויות על לוחיות pyg לאחר דגירה אנאירובית עבור 72 h (איור 1a). צנטריפוגה של שריטות התרבות, ואחריו משקעים אתנול וייבוש, הביא את האוסף של תאית כמו EPS (איור 1B). EPS מיובש ועמילן מסיסים שימשו לאחר מכן כמקורות פחמן לתרבויות תסיסה. השימוש ב-oligosaccharide לצורך הפרדה וניתוח טוהר בשל העלות הנמוכה והתוצאות המהירות18. למרות שקצב ההתדרדרות של העמילן על ידי מיקרוביוטה של הצואה האנושית היה מה...

המתואר כאן הוא פרוטוקול לחקור את האינטראקציות בין האנדוביוטיקה לבין מיקרוביוטה האדם המעיים באמצעות מערכות תסיסה מחוץ למערכת.

Human intestinal microorganisms have recently become an important target of research in promoting human health and preventing diseases. Consequently, ...

הפרוטוקול שלנו יכול להיות בשימוש נרחב עבור תפוקה גבוהה סינון מהיר של האינטראקציות בין אנדוביוטיקה microbiota המעיים האנושיים. עלות נמוכה והימנעות מהשפעות הפרעה מחילוף החומרים של המארח. הליך זה יש פוטנציאל לשמש באבחון.ראשית, להמיס BIF EPS ועיוולן בנפרד במים חמים על מסית מגנטי כדי להפוך את הריכוז של שמונה גרם לליטר. במדיום התרבות הבסיסית המוכן, VI, הוסף 100 מיליליטר של פתרון BIF EPS כדי ליצור פתרון תרבות VI BIF. הוסף 100 מיליליטר של פתרון עמילן כדי להפוך את פתרון עמילן VI תרבות.אוטוקלאב את שתי המדיה עם מקור פחמן, ואת המדיום ללא מקור פחמן כבקרה, ב 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. אפשר להם להתקרר לטמפרטורת החדר ולהוסיף יימן וציסטאין. מעבירים תת מדגם של חמישה מיליליטר של כל מדיום לצינורות תרבות.ולאחסן באינקובטור אנאירובי. אחסן את שאר המדיה בארבע מעלות צלזיוס. כדי להכין מדגם צואה אנושי, להעביר גרם אחד של מדגם צואה טרי לתוך 10 מיליליטר של 0.1 PBS אנאירובי טוחן ב pH שבע ב זכוכית.ואז להשתמש מוט זכוכית כדי לבחוש אותו כדי להשיג תרחיף. בתא אנאירובי, להוסיף 500 microliters של תרחיף צואה מסונן לתוך שלוש מדיה תסיסה מוכן, בנפרד. ואז, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס.לאחר 24 שעות ו -48 שעות, לאסוף שני מיליליטר של דגימות מותססות בתא אנאירובי. ואז צנטריפוגה מחוץ לתא ב 6000 פעמים G, במשך שלוש דקות. מעבירים בזהירות את העל-טבעיים לצינורות צנטריפוגה חדשים שישמשו לניתוח השפלת פוליסכריד ומדידות חומצות שומן קצרות שרשרת.אחסן את כדורי הצנטריפוגה ב-80 מעלות צלזיוס. לטעון 0.2 microliters של supernatants מותססים על כל ג'ל סיליקה מצופה מראש 60 לוח אלומיניום TLC מערבולת להתפשט. לאחר מכן השתמש במייבש שיער עם אוויר חם לייבוש.לטבול קצה אחד של הלוחות שנדגמו ב 20 מיליליטר של חומצה פורמית:n-butanol:פתרון מים במשך כמה דקות, עד אלקטרופורזה משתרע כמעט לקצה השני. ואז להוציא את הצלחות עם מדפים, ויבש עם מייבש שיער. ואז להשרות את הצלחות בריג'נט orcinol במשך שתי דקות לצבוע.ויבש שוב. מעבירים את הצלחות לתנור אפייה ב-120 מעלות לחום במשך שלוש דקות. לאחר מכן צלם את הלוח כדי להעריך השפלה של EPS על ידי מדידת להקות TLC.כדי לחקור את ההשפעות של EPS על ייצור SCFA, להוסיף מיליליטר אחד של supernatants מותססים צינורות צנטריפוגה שני מיליליטר ולהוסיף 0.2 מיליליטר של 25 משקל / נפח אחוז של חומצה גרורתית לכל מדגם. מערבולת לערבב ביסודיות את הפתרונות. צנטריפוגה תערובות ב 13, 000 פעמים G במשך 20 דקות.בינתיים, להכין פתרונות של 120 מילימולרית אצטית, propionic, butyric, isobutyric, ולרי, וחומצות isovaleric בצינורות. לאחר מכן מוסיפים מיליליטר אחד של כל חומצה מוכנה לצינור המכיל 1.2 מיליליטר של 25 משקל / נפח אחוז חומצה מטא-זרחנית. ולהעמיס אותם לתוך בקבוק הדגימה של מכשיר כרומטוגרפיה גז כמו קוקטיילים סטנדרטיים.מוציאים את הצינורות מהצנטריפוגה, ומעבירים את העל-טבעיים לצינורות טריים. השתמש במזרק המצויד במסנן 0.22 מיקרון כדי לסנן את העל-טבעיים לצינורות חדשים לניתוח כרומטוגרפיה של גז. במחקר זה, הייצור של EPS ריר נצפתה בתרבויות bifidobacterium longum על צלחות PYG, לאחר דגירה אנאירובית במשך 72 שעות.צנטריפוגה של שריטות תרבות, ואחריו משקעים אתנול וייבוש, הביא אוסף של EPS דמוי תאית. ניתוח TLC גילה כי שיעור ההשפלה של עמילן על ידי מיקרוביוטה צואה אנושית היה מהיר יותר מזה של BIF EPS. ניתוח קואורדינטות ראשי מראה תרבות VI BIF, ותרבות VI קבוצות עמילן, מקובצים בנפרד זה מזה, המציין כי EPS וזמינות עמילן באופן דיפרנציאלי לעצב קהילות חיידקים צואה אנושית.ניתוח מפלה ליניארי על גודל האפקט מראה את סוג קולינסלה, coprococcus, parabacteroides, ו rhodopseudomonas היו באופן משמעותי יותר בשפע בתרבות VI BIF דגימות מאשר בתרבות VI דגימות עמילן. יתר על כן, מדידות GC מראות SCFAs שנמדדו מתרבויות תסיסה כללו אצטית, פרופיונית, isobutyric, butyric, isovaleric, וחומצות ולריות. לאחר תסיסה של 24 שעות ו-48 שעות, חמישה מתוך ששת ריכוזי SCFA היו דומים ולא שונים סטטיסטית בין התרבות VI BIF, עמילן תרבות VI וקבוצות תרבות VI.עם זאת, ריכוזי חומצה פרופריונית היו גבוהים באופן משמעותי בקבוצת התרבות VI BIF מאשר בקבוצת עמילן VI תרבות, לאחר 48 שעות של תסיסה. לעשות את הניסוי הזה בתנאים אנאירוביים, ולאחר מכן להעביר את הדגימות הקבועות לתוך אינקובטור אנאירובי בהקדם האפשרי. חלק מהריגנסים של TLC מסוכנים.אתה צריך להיות זהיר להשתמש בהם.

analysis-interactions-between-endobiotics-human-gut-microbiota-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מקור: אחמדי, ס. ואחרים. מודל גידול באצווה במבחנה להערכת השפעות משטרים התערבותיים על מיקרוביוטה בצואה אנושית. J. Vis. Exp. (2019).הסרטון הזה מדגים שיטה למידול תסיסה מיקרוביאלית במעי על ידי דגירה של דגימות צואה עם סיבים תסיסים בתנאי אנאירוביה לחקר ייצור מטבוליטים על ידי מיקרוביום המעיים.

In-Vitro מודל גידול אצווה לחיקוי תסיסה של המעי הגס על ידי מיקרוביום המעי האנושי

מקור: הו, י. ואחרים. ניתוח אינטראקציות בין אנדוביוטיקה למיקרוביום המעי האנושי באמצעות מערכות תסיסה במבחנה. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים את השימוש בכרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC) להערכת פירוק אקסופוליסכרידים (EPS) על ידי מיקרוביום צואה אנושי. קטעי EPS בסופרנטנטים של תסיסה מופרדים לפי גודל וקוטביות באמצעות TLC, ואז מוצגים כרצועות צבעוניות לאחר צביעה ספציפית לפחמימות.

ביצוע כרומטוגרפיה בשכבה דקה להערכת פירוק אקסופוליסכריד חיידקי

מקור: הו, י. et.al., ניתוח אינטראקציות בין אנדוביוטיקה למיקרוביום המעי האנושי באמצעות מערכות תסיסה במבחנה. J. Vis. Exp. (2019)הסרטון הזה מדגים את ניתוח ייצור חומצות שומן קצרות שרשרת על ידי מיקרוביום המעי האנושי בתגובה לאקסופוליסכרידים. זה מדגיש את הפרדת וכימותי מוצרי התסיסה המיקרוביאליים באמצעות כרומטוגרפיית גז. התוצאות מגלות כי אקסופופוליסכרידים מווסתים את המטבוליטים המיקרוביאליים המשפיעים על דינמיקת הפתוגן של המארח במעי.

חקר פעילות מיקרוביאלית במעי האנושי על אקסופופוליסכרידים

בסרטון זה, אנו מתארים את המתודולוגיה להקמת מערכת תרבית איברי מעיים ex vivo כדי לחקור את יחסי הגומלין בין מקטעי רקמת מעיים של עכבר לבין חיידקי מעיים ספציפיים. המכשיר מורכב משני זוגות של יציאות קלט-פלט, הראשון מחבר את לומן רקמת המעי ומספק את המתלה החיידקי הספציפי לתוכו, והשני מספק ברציפות מדיה לבארות המכשיר כדי לשמור על כדאיות רקמת ex vivo.

מערכת תרבית איברי מעיים Ex Vivo לחקר אינטראקציות מיקרוביוטה מארחת

אנו מתארים פרוטוקול במבחנה Microbiome במעיים שיתוף תרבות villi מעיים במשך תקופה ארוכה באמצעות אדם בטן-על-שבב מערכת microphysiological.

עמית תרבות Microbiome חי עם Microengineered אדם המעיים villi בתוך גוט-על-שבב מכשיר microfluidic

אינטראקציות מארח-חיידק מעיים היו העריכו באמצעות גישה מוזרה שילוב קהילה אוראלי סינתטי במבחנה במערכת העיכול עיכול, דגם של האפיתל המעי הדק. אנו מציגים שיטה שבה ניתן להתאים כדי להעריך את התא הפלישה של גורמי מחלה, biofilms מינים רב, או אפילו כדי לבדוק את השרידות של פרוביוטיקה ניסוחים.

הערכת הכדאיות של קונסורציום חיידקי סינתטי על הממשק מארח-חיידק במעיים במבחנה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור culturing microbiota את הבטן של המעי הגס במבחנה, באמצעות סדרה של ריאקטורים שמדמות את התנאים הפיזיולוגיים של דרכי עיכול.

מתקדמים במבחנה Culturing טכנולוגיה ללמוד את Microbiota בטן האדם

פרוטוקול זה מתאר את מערכת התסיסה התרבותית של תרבות האצווה האנושית של מיקרוביוטה בצואה, באמצעות אינולין (באופן מוכר, ואחד מהמיקרוביוטה הנפוצים ביותר) כדי להדגים את השימוש במערכת זו בהערכת השפעות ספציפיות התערבויות על הרכב microbiota צואה ופעילויות מטבולית.

באצווה מחוץ לגופית-מודל תרבות להעריך את ההשפעות של משטרי התערבותית על האדם מיקרוביוטה בצואה

מאמר זה מציג שיטה ייחודית לניתוח אינטראקציות בין מארח למיקרוביום באמצעות מערכת תרבית איברי מעיים חדשנית לניסויים ex vivo.

מערכת תרבית איברי מעיים לניתוח אינטראקציות מארח-מיקרוביוטה

פרוטוקול זה מפרט את הרכבת מערכי מיני-ביו-ריאקטור שישמשו לתרבית זרימה רציפה של קהילות צואה מורכבות בתנאים אנאירוביים. אנו דנים גם בשיטות ההרכבה, החיסון והדגימה של הכורים להמשך ניתוח.

מכלול ביו-ריאקטור לתרבית מתמשכת של קהילות צואה מורכבות

מערך המיני-ביו-ריאקטור (MBRA) הוא מערכת תרבית בעלת תפוקה גבוהה, ניתנת להתאמה אישית, זרימה רציפה המאפשרת טיפוח של קהילות מיקרוביאליות מורכבות, ותומכת בניסויים מקבילים לחקר דינמיקת המיקרוביום, אינטראקציות טיפוליות ותגובות מיקרוביאליות לגורמים סביבתיים.

פרוטוקול מעודכן להרכבה ושימוש במערך המיני-ביו-ריאקטור (MBRA)

חקור אינטראקציות בין אנדוביוטיקה למיקרוביוטה של המעי באמצעות מערכות תסיסה מחוץ לאמבט. שיטה זו מאפשרת סינון מהיר בעלות נמוכה ללא הפרעות מטבוליזם המארח.

ניתוח אינטראקציות בין האנדוביוטיקה לבין מיקרוביוטה של האדם באמצעות מערכות תסיסה מחוץ לאמבט

גלה סרטונים נוספים