ניתוח אינטראקציות בין האנדוביוטיקה לבין מיקרוביוטה של האדם באמצעות מערכות תסיסה מחוץ לאמבט

הפרוטוקול שלנו יכול להיות בשימוש נרחב עבור תפוקה גבוהה סינון מהיר של האינטראקציות בין אנדוביוטיקה microbiota המעיים האנושיים. עלות נמוכה והימנעות מהשפעות הפרעה מחילוף החומרים של המארח. הליך זה יש פוטנציאל לשמש באבחון.

ראשית, להמיס BIF EPS ועיוולן בנפרד במים חמים על מסית מגנטי כדי להפוך את הריכוז של שמונה גרם לליטר. במדיום התרבות הבסיסית המוכן, VI, הוסף 100 מיליליטר של פתרון BIF EPS כדי ליצור פתרון תרבות VI BIF. הוסף 100 מיליליטר של פתרון עמילן כדי להפוך את פתרון עמילן VI תרבות.

אוטוקלאב את שתי המדיה עם מקור פחמן, ואת המדיום ללא מקור פחמן כבקרה, ב 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. אפשר להם להתקרר לטמפרטורת החדר ולהוסיף יימן וציסטאין. מעבירים תת מדגם של חמישה מיליליטר של כל מדיום לצינורות תרבות.

ולאחסן באינקובטור אנאירובי. אחסן את שאר המדיה בארבע מעלות צלזיוס. כדי להכין מדגם צואה אנושי, להעביר גרם אחד של מדגם צואה טרי לתוך 10 מיליליטר של 0.1 PBS אנאירובי טוחן ב pH שבע ב זכוכית.

ואז להשתמש מוט זכוכית כדי לבחוש אותו כדי להשיג תרחיף. בתא אנאירובי, להוסיף 500 microliters של תרחיף צואה מסונן לתוך שלוש מדיה תסיסה מוכן, בנפרד. ואז, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס.

לאחר 24 שעות ו -48 שעות, לאסוף שני מיליליטר של דגימות מותססות בתא אנאירובי. ואז צנטריפוגה מחוץ לתא ב 6000 פעמים G, במשך שלוש דקות. מעבירים בזהירות את העל-טבעיים לצינורות צנטריפוגה חדשים שישמשו לניתוח השפלת פוליסכריד ומדידות חומצות שומן קצרות שרשרת.

אחסן את כדורי הצנטריפוגה ב-80 מעלות צלזיוס. לטעון 0.2 microliters של supernatants מותססים על כל ג'ל סיליקה מצופה מראש 60 לוח אלומיניום TLC מערבולת להתפשט. לאחר מכן השתמש במייבש שיער עם אוויר חם לייבוש.

לטבול קצה אחד של הלוחות שנדגמו ב 20 מיליליטר של חומצה פורמית:n-butanol:פתרון מים במשך כמה דקות, עד אלקטרופורזה משתרע כמעט לקצה השני. ואז להוציא את הצלחות עם מדפים, ויבש עם מייבש שיער. ואז להשרות את הצלחות בריג'נט orcinol במשך שתי דקות לצבוע.

ויבש שוב. מעבירים את הצלחות לתנור אפייה ב-120 מעלות לחום במשך שלוש דקות. לאחר מכן צלם את הלוח כדי להעריך השפלה של EPS על ידי מדידת להקות TLC.

כדי לחקור את ההשפעות של EPS על ייצור SCFA, להוסיף מיליליטר אחד של supernatants מותססים צינורות צנטריפוגה שני מיליליטר ולהוסיף 0.2 מיליליטר של 25 משקל / נפח אחוז של חומצה גרורתית לכל מדגם. מערבולת לערבב ביסודיות את הפתרונות. צנטריפוגה תערובות ב 13, 000 פעמים G במשך 20 דקות.

בינתיים, להכין פתרונות של 120 מילימולרית אצטית, propionic, butyric, isobutyric, ולרי, וחומצות isovaleric בצינורות. לאחר מכן מוסיפים מיליליטר אחד של כל חומצה מוכנה לצינור המכיל 1.2 מיליליטר של 25 משקל / נפח אחוז חומצה מטא-זרחנית. ולהעמיס אותם לתוך בקבוק הדגימה של מכשיר כרומטוגרפיה גז כמו קוקטיילים סטנדרטיים.

מוציאים את הצינורות מהצנטריפוגה, ומעבירים את העל-טבעיים לצינורות טריים. השתמש במזרק המצויד במסנן 0.22 מיקרון כדי לסנן את העל-טבעיים לצינורות חדשים לניתוח כרומטוגרפיה של גז. במחקר זה, הייצור של EPS ריר נצפתה בתרבויות bifidobacterium longum על צלחות PYG, לאחר דגירה אנאירובית במשך 72 שעות.

צנטריפוגה של שריטות תרבות, ואחריו משקעים אתנול וייבוש, הביא אוסף של EPS דמוי תאית. ניתוח TLC גילה כי שיעור ההשפלה של עמילן על ידי מיקרוביוטה צואה אנושית היה מהיר יותר מזה של BIF EPS. ניתוח קואורדינטות ראשי מראה תרבות VI BIF, ותרבות VI קבוצות עמילן, מקובצים בנפרד זה מזה, המציין כי EPS וזמינות עמילן באופן דיפרנציאלי לעצב קהילות חיידקים צואה אנושית.

ניתוח מפלה ליניארי על גודל האפקט מראה את סוג קולינסלה, coprococcus, parabacteroides, ו rhodopseudomonas היו באופן משמעותי יותר בשפע בתרבות VI BIF דגימות מאשר בתרבות VI דגימות עמילן. יתר על כן, מדידות GC מראות SCFAs שנמדדו מתרבויות תסיסה כללו אצטית, פרופיונית, isobutyric, butyric, isovaleric, וחומצות ולריות. לאחר תסיסה של 24 שעות ו-48 שעות, חמישה מתוך ששת ריכוזי SCFA היו דומים ולא שונים סטטיסטית בין התרבות VI BIF, עמילן תרבות VI וקבוצות תרבות VI.

עם זאת, ריכוזי חומצה פרופריונית היו גבוהים באופן משמעותי בקבוצת התרבות VI BIF מאשר בקבוצת עמילן VI תרבות, לאחר 48 שעות של תסיסה. לעשות את הניסוי הזה בתנאים אנאירוביים, ולאחר מכן להעביר את הדגימות הקבועות לתוך אינקובטור אנאירובי בהקדם האפשרי. חלק מהריגנסים של TLC מסוכנים.

אתה צריך להיות זהיר להשתמש בהם.