Name: אנליזה ניסויית של האפוטוטיק הפיקרוציט על ידי המקפאגים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: למדו פרוטוקול להכנת תימוציטים אפופטוטיים ומקרופאגים פריטוניאליים לחקר אפופטוזה ואפגרוציטוזה. השיטה מאפשרת הערכת יעילות בליעת תאים מתים ומחקר השפעת מעכבים ספציפיים על התהליך בביולוגיית תאים ואימונולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר במעבדת האלה נתמך על ידי מחקר של פרס חדשני של המכללה לרפואה ואת הפרס טייס הפקולטה זוטר מהמחלקה לרפואה פנימית, אוניברסיטת סינסינטי וגרנט DK K01_095067 מ NIDDK/NIH.

עכברים ניסיוניים התרבו והחזיקו במושבת העכברים שלנו. כל העבודות בעלי החיים נערכו על פי ההנחיות של הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של אוניברסיטת סינסינטי.
1. הכנת תימוציטים מותווית של CFSE
<ol><li>המתת חסד שני העכברים C57/B6 על ידי CO2 שאיפת עבור 10 דקות ולנתח כדי לפתוח את חלל החזה, להסיר (למשוך החוצה) את התימוס עם מלקחיים בסדר מעוקל עצה לתוך צלחת התרבות הרקמה פטרי המכיל 10 מ ל של RPMI1640 medium.</li>
	<li>השג השעיה תא יחיד על ידי שיוף התימוס כולו נגד שני קצוות מזוגג של שקופיות מיקרוסקופ ולאחר מכן לסנן את ההשעיה דרך מסננת תא 100 יקרומטר.</li>
	<li>לאסוף את 10 מ"ל בלוטת התימוס הבולם לתוך צינור 50 mL ו צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות.</li>
	<li>הסר את הסופרנטאנט, השהה מחדש ב-40 mL של 1x PBS, וספור מספרי תאים עם הומוציטומטר.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות ולהסיר את supernatant.</li>
	<li>השהה מחדש 20 מ ל של 1x PBS בצינור 50 mL כמו תא אחד השעיה עם עד 2 x 108 תאים (אם יותר מ 2 x 108 תאים, להשעות את שאר התאים בעוד 20 מ ל של 1 x PBS ב שונים 50 ml שפופרת).</li>
	<li>לעשות 5 μM של CFSE בנפח שווה (20 מ ל) של 1x PBS בצינור 50 mL נפרד על ידי pipetting 40 μL של פתרון מלאי CFSE (2.5 mM) לתוך 20 מ ל של 1x PBS ומערבבים היטב על ידי היפוך הצינור 2-3 פעמים.</li>
	<li>הוסף את 20 מ ל CFSE משלב 1.7 לתוך 20 מ ל של השעיית תא משלב 1.6 (הריכוז הסופי של CFSE הוא עכשיו 2.5 μM). הערה: עבור כל 20 mL השעיית תא, 20 מ ל של צינור CFSE נדרש.</li>
	<li>היפוך התא ו CFSE תערובת שפופרת 2-3 פעמים ו דגירה את התערובת בחושך בטמפרטורת החדר עבור מקסימום של 2 דקות, ולאחר מכן להפסיק את התגובה על ידי הוספת 10 מ ל של סרום הסוס חום המופעל.</li>
	<li>צנטריפוגה את תערובת שפופרת 50 mL ב 300 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. הערה: אם התיוג CFSE מוצלח, גלולה תא יהיה צהוב בהיר בצבע.</li>
	<li>הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה בתא ב 40 mL של 1x PBS וספירת מספרי תאים עם הומוציטומטר.</li>
	<li>צנטריפוגה את ההשעיה התא ב 300 x g עבור 5 דקות ולהיפטר supernatant.</li>
	<li>לשטוף את הגלולה התא שוב עם 40 mL של מדיום RPMI1640.</li>
	<li>להסיר את supernatant ולהשעות את התאים עם RPMI1640 התרבות רקמות בינונית (RPMI1640, 20 מ"מ HEPES, 10% FBS (חום מופעל), 20 מ"מ גלוטמין, ו-1x עט/דלקת) בריכוז של 7 x 106 תאים/mL בצלחת התרבות 100 מ"מ רקמות. הערה: אם מתקבלים תאים נוספים, יהיה צורך בגידול נפרד של מ100 מ"מ ברקמות.</li>
	<li>הוסף סטרוספורטין לתוך התרבות ההשעיה התא בריכוז הסופי של 1 μM ותרבות עבור 4 h ב 37 ° c בחממה תרבות רקמות שסופקו עם 5% CO2.</li>
</ol>2. הכנת מקרופאגים הצפק
<ol><li>הכנס שני עכברים C57B6 (או כל העכברים מניפולציות הגנים במעבדה) intraperitoneally עם 1 mL של 3% בגילאי הזמן לאסוף ביום 0.</li>
	<li>המתת חסד העכברים ביום 5 כמו בשלב 1.1, לגזור ולקלף לפתוח את עור הבטן אבל לעזוב את צפק ללא פגע. ריקון החלל הצפק על ידי דוחף במהירות 10 מ ל של מאגר כביסה (RPMI1640, 2% FBS, 0.04% EDTA) לתוך חלל הצפק באמצעות מזרק 10 מ ל מוצמד עם מחט 18 גרם.</li>
	<li>לאחזר את מאגר לשטוף לאט עם אותו מחט/מזרק, ולאסוף את המאגר לשטוף לתוך צינור 50 mL (פרטים מתייחסים לסעיף מעבדה ג ' ינסן15).</li>
	<li>לשטוף את gavage הצפק פעמיים עם ה-PBS 1x, מחדש את מקרופאגים הצפק במדיום תרבות RPMI1640 רקמות בצפיפות של 2 x 106 תאים/mL ו-סדרת מחלקים 500 μl לתוך כל טוב של צלחת 24. השאירו את הצלחת בחממה לתרבית רקמות במשך 2 שעות.</li>
	<li>להסיר את התאים צף על ידי מתיף והחלפה עם 500 μL של מדיום תרבות טרייה, פעמיים.</li>
	<li>באופן אופציונלי, להוסיף את המעכב הקולטן של TAM מעכב, RXDX-106, בריכוזים שצוין באגדות דמות לתוך כל טוב של התרבות המקרופאג ו דגירה עבור 2 h אחר.</li>
</ol>3. שיתוף תרבות של מקרופאגים הצפק עם האפומוציטים
<ol><li>לאסוף thymocytes האפוציטים משלב 1 ולשטוף שלוש פעמים עם RPMI1640 medium. את היעילות של אינדוקציה האפוטוטית ניתן למדוד בשלב זה עם ערכת V/7-עמ ' של אנשין.</li>
	<li>הפץ 0-12 x 106 תאים (ב 500 μl בינונית) לתוך כל טוב של התרבויות המקרופאג מהפרוטוקול2, על פי הסדר ניסיוני (למשל, ראה איור 1). זה הופך את כל נפח התרבות של 1 mL בכל טוב של הצלחת 24-הבאר. להוסיף את הנוגדן חסימת לתוך התרבות מיד לפני התוספת של thymocytes האפוציטים.</li>
	<li>התרבות תערובת התאים ב 37 ° c עבור 4 h בחממה תרבות רקמות שסופקו עם 5% CO2.</li>
	<li>לשטוף כל היטב של התרבות עם 1x PBS (המכיל 500 μM EDTA) פעמיים כדי להסיר את התאים בחינם צף האפוטוטיים.</li>
	<li>הכתם את מקרופאגים מאוגדים בצלחת עם CD11b-PE בשלב זה.<ol>
<li>לשטוף את הצלחת מקרופאגים מאוגד עם מאגר צביעת (1x PBS, 1% BSA) פעם אחת.</li>
		<li>הוסף 200 μL של מאגר כתמים המכיל 2 μL CD11b-PE לתוך כל באר.</li>
		<li>מודקת את הצלחת ב 4 ° c עבור 20 דקות.</li>
		<li>רוחצים את כל הצלחות בצלחת שלוש פעמים עם מאגר הצביעת.</li>
		<li>הוסף 200 μL של מאגר כתמים ולהמשיך את הצלחת עבור ניתוח תמונה תחת מיקרוסקופ פלורסנט.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לחילופין, לנתק את מקרופאגים לוחית הרישוי על ידי הוספת 1 mL של 1% לידוקאין ב-PBS ו הדגירה עבור 10 דקות ב 37 ° c.</li>
	<li>ניתוק מקרופאגים מאוגדים בצלחת עם ליטוף חוזר.</li>
	<li>העברת מקרופאג השעיה לתוך בודד 5 מ ל הצינור התחתון FACS מתוך כל טוב של צלחת 24-הבאר.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות.</li>
	<li>הסר את הסופרנטאנט והוסף 200 μL של מאגר כתמים המכיל 2 μL של CD11b-PE (1:200 דילול במאגר הצביעת).</li>
	<li>מודקון התא הבולם במאגר מכתים ב 4 ° צ' עבור 20 דקות.</li>
	<li>שטוף את ההשעיה של התא פעמיים עם מאגר מכתים.</li>
	<li>הוסף 200 μL של מאגר כתמים ולהמשיך לניתוח FACS עם cytometer זרימה ולנתח עבור אחוז של מקרופאגים חיוביות CFSE.</li>
</ol>

<ol><li>Shao, W. H., Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disturbances+of+apoptotic+cell+clearance+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Disturbances of apoptotic cell clearance in systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis Research and Therapy. 13 (1), 202(2011).</li>
<li>Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cell+death+and+lupus%5BTitle%5D)+AND+%22Springer+Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cell death and lupus.</a> Springer Seminars in Immunopathology. 28 (2), 145-152 (2006).</li>
<li>Wong, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+cancer%3A+from+pathogenesis+to+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+and+Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment.</a> Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 30, 87(2011).</li>
<li>Baig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+apoptotic+pathway-targeted+cancer+therapeutic+research%3A+Where+do+we+stand%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Potential of apoptotic pathway-targeted cancer therapeutic research: Where do we stand.</a> Cell Death and Disease. 7, 2058(2016).</li>
<li>Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cell+clearance%3A+basic+biology+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (3), 166-180 (2014).</li>
<li>Qian, Y., Wang, H., Clarke, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+clearance+of+apoptotic+cells+induces+the+activation+of+autoreactive+anti-Sm+marginal+zone+and+B-1+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Impaired clearance of apoptotic cells induces the activation of autoreactive anti-Sm marginal zone and B-1 B cells.</a> Journal of Immunology. 172 (1), 625-635 (2004).</li>
<li>Hawkins, L. A., Devitt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+understanding+of+the+mechanisms+for+clearance+of+apoptotic+cells-a+fine+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Death%22%5BJournal%5D)">Current understanding of the mechanisms for clearance of apoptotic cells-a fine balance.</a> Journal of Cell Death. 6, 57-68 (2013).</li>
<li>Lemke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+the+TAM+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspective+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Biology of the TAM receptors.</a> Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (11), 009076(2013).</li>
<li>Stitt, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anticoagulation+factor+protein+S+and+its+relative%2C+Gas6%2C+are+ligands+for+the+Tyro+3%2FAxl+family+of+receptor+tyrosine+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The anticoagulation factor protein S and its relative, Gas6, are ligands for the Tyro 3/Axl family of receptor tyrosine kinases.</a> Cell. 80 (4), 661-670 (1995).</li>
<li>Linger, R. M., Keating, A. K., Earp, H. S., Graham, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAM+receptor+tyrosine+kinases%3A+biologic+functions%2C+signaling%2C+and+potential+therapeutic+targeting+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">TAM receptor tyrosine kinases: biologic functions, signaling, and potential therapeutic targeting in human cancer.</a> Advances in Cancer Research. 100, 35-83 (2008).</li>
<li>van der Meer, J. H., van der Poll, T., van 'T Veer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAM+receptors%2C+Gas6%2C+and+protein+S%3A+roles+in+inflammation+and+hemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">TAM receptors, Gas6, and protein S: roles in inflammation and hemostasis.</a> Blood. 123 (16), 2460-2469 (2014).</li>
<li>Lemke, G., Burstyn-Cohen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAM+receptors+and+the+clearance+of+apoptotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annal+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">TAM receptors and the clearance of apoptotic cells.</a> Annal of the New York Academy of Sciences. 1209, 23-29 (2010).</li>
<li>Shao, W. H., Zhen, Y., Eisenberg, R. A., Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mer+receptor+tyrosine+kinase+is+expressed+on+discrete+macrophage+subpopulations+and+mainly+uses+Gas6+as+its+ligand+for+uptake+of+apoptotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Mer receptor tyrosine kinase is expressed on discrete macrophage subpopulations and mainly uses Gas6 as its ligand for uptake of apoptotic cells.</a> Clinical Immunology. 133 (1), 138-144 (2009).</li>
<li>Scott, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+and+clearance+of+apoptotic+cells+is+mediated+by+MER%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis and clearance of apoptotic cells is mediated by MER.</a> Nature. 411 (6834), 207-211 (2001).</li>
<li>Klarquist, J., Janssen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bm12+Inducible+Model+of+Systemic+Lupus+Erythematosus+%28SLE%29+in+C57BL%2F6+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice.</a> Journal of Visualized Experiment. (105), e53319(2015).</li>
<li>Malawista, A., Wang, X., Trentalange, M., Allore, H. G., Montgomery, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+expression+of+tyro3%2C+axl%2C+and+mer+receptors+in+macrophage+ontogeny%5BTitle%5D)+AND+%22Macrophage+%28Houst%29%22%5BJournal%5D)">Coordinated expression of tyro3, axl, and mer receptors in macrophage ontogeny.</a> Macrophage (Houst). 3, (2016).</li>
<li>Elmore, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%3A+a+review+of+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Apoptosis: a review of programmed cell death.</a> Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).</li>
<li>Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Find-me+and+eat-me+signals+in+apoptotic+cell+clearance%3A+progress+and+conundrums%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: progress and conundrums.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1807-1817 (2010).</li>
<li>Rock, K. L., Kono, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammatory+response+to+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+in+Pathology%22%5BJournal%5D)">The inflammatory response to cell death.</a> Annual Review in Pathology. 3, 99-126 (2008).</li>
<li>Roberts, K. M., Rosen, A., Casciola-Rosen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+inducing+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Methods for inducing apoptosis.</a> Methods in Molecular Medicine. 102, 115-128 (2004).</li>
<li>Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+seeing+to+believing%3A+labelling+strategies+for+in+vivo+cell-tracking+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Interface+Focus%22%5BJournal%5D)">From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments.</a> Interface Focus. 3 (3), 20130001(2013).</li>
<li>Stijlemans, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+pHrodo-based+assay+for+the+assessment+of+in+vitro+and+in+vivo+erythrophagocytosis+during+experimental+trypanosomosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Development of a pHrodo-based assay for the assessment of in vitro and in vivo erythrophagocytosis during experimental trypanosomosis.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003561(2015).</li>
<li>Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearing+the+dead%3A+apoptotic+cell+sensing%2C+recognition%2C+engulfment%2C+and+digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspective+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion.</a> Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (1), 008748(2013).</li>
<li>Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Detachment+Methods+on+M2+Macrophage+Phenotype+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Methods%22%5BJournal%5D)">Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function.</a> Journal of Immunology Methods. 426, 56-61 (2015).</li>
<li>Fleit, S. A., Fleit, H. B., Zolla-Pazner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+recovery+of+macrophages+and+cell+lines+from+tissue+culture-treated+and+-untreated+plastic+dishes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Methods%22%5BJournal%5D)">Culture and recovery of macrophages and cell lines from tissue culture-treated and -untreated plastic dishes.</a> Journal of Immunology Methods. 68 (1-2), 119-129 (1984).</li>
<li>Fine, N., Barzilay, O., Glogauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Human+and+Mouse+Neutrophil+Phagocytosis+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of Human and Mouse Neutrophil Phagocytosis by Flow Cytometry.</a> Methods Molecular Biology. 1519, 17-24 (2017).</li>
<li>Summers, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+kinetics+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil kinetics in health and disease.</a> Trends in Immunology. 31 (8), 318-324 (2010).</li>
<li>Dale, D. C., Boxer, L., Liles, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phagocytes%3A+neutrophils+and+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The phagocytes: neutrophils and monocytes.</a> Blood. 112 (4), 935-945 (2008).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

אפופטוזיס הוא תהליך שימור מאוד תאים מוות המערבת הרבה אותות מפלי ומשרה ביטוי חלבון, הפרשה, ותחבורה. אפופטוזיס קשורה לעיתים קרובות עם שינויים מורפולוגיה הסלולר17. תאים אפוטוטיים משחררים ציטוקינים ונוגדנים שמושכים phagocytes כדי לעבור לאתר וליזום את תהליך של שריפת, מסלול מורכב מאוד תחת שליטה הדוקה18. מצד שני, מוות תאי נקרוטי משחרר אותות סכנה המפעילים תגובות דלקתיות1. הסיווג פגום או ממושך של תאים אפוטוטיים יוביל לנמק משני של תאים אלה19<...

הגוף שלנו מייצר 1-10 מיליארד תאי האפוטוטיים על בסיס יומי. מספר גדול של תאים אפוטוטיים חייב להיות מתנקה באופן שהתגובות החיסונית יישארו בשקט. כדי להבטיח את הסיווג של תאים האפוטוטיים בזמן, סוגים רבים של תאים תושב רקמות ותאים מחזורי לפתח מנגנונים לתאי האפוטוטיים מפרץ1. רגולציה מתפקדת של אפופטוזיס כבר מעורב בתחילתה והתקדמות של מחלות דלקתיות שונות החסינות האוטומטית2. אפופטוזיס גם משחק תפקיד קריטי בפתוגנזה של התפתחות הסרטן ההתנגדות הבאה שלה טיפולים קונבנציונליים3,4. הסרת תאים אפוטוטיים מקדמת בדרך כלל תגובה אנטי דלקתית, אשר עשויה להיות מקושרת לסובלנות החיסונית5. הפרעה של הסיווג תא האפוטוטיק כוננים חיסון עצמי תורמת לפיתוח של מחלות אוטואימוניות מערכתית בבני אדם ועכברים6.
כאשר התאים עוברים ואפופטוזיס, הם חושפים את הפוספלדיסרין (פטין) מתוך העלון הפנימי אל העלעל החיצוני של הקרום. לאחר מכן יהיה מזוהה על ידי phagocytes באמצעות קולטני פני השטח. למעלה מתריסר קולטנים זוהו לזהות ו/או להקל על הבזלת של תאים אפוטוטיים. באופן כללי, ישנם לפחות שלושה סוגים של קולטני פני השטח המעורבים בסיווג התא האפוטוטית: הקולטנים קולטני, לזהות תאים אפוטוטיים; לדגדג קולטנים, ליזום שתבלע; קולטנים למשגיחים, להקל על התהליך כולו7. שיטת הקולטן טאם (TAM RTKs) מורכבת מ- Tyro-3 , Xl, ו- Mer והם מבוטאים בעיקר על ידי תאים מיאלואידים של מערכת החיסון8. התפקיד העיקרי של TAM RTKs הוא לשמש קולטנים הקשירה, הקלה על הסרת phagocytic של תאים אפוטוטיים ופסולת. הקבוצה שלנו למדה את הסיווג של התאים טאם בתיווך במסגרת החסינות האוטומטית במשך שנים רבות. הגידול ויטמין K התלוי חלבון מעצר מסוים חלבון 6 (Gas6) וחלבון S (היתרונות) נקשר ומפעיל את קולטני טאם9,10. Gas6 מופק בלב, הכליות, והריאות. מקצוענים מיוצרים בעיקר בכבד11. TAM מזהה בתאים אפוטוטיים בצורה כזאת, כי N-מסוף של Gas6/המקצוענים נקשר לפטין על תא האפוטוטיק ואת C-מסוף של Gas6/המקצוענים נקשר לקולטני TAM המעוגן על פני השטח של phagocytes. יחד עם קולטני אחרים, הבזים של תאים אפוטוטיים מתרחש12. למרות Mer יכול לאגד הן מומחי ליגנדס ו Gas6, מצאנו כי Gas6 מופיע להיות ligands עבור מר בתיווך מקרופאג phagocyציטוזה של תאים אפוטוטיים, אשר ניתן לחסום על ידי נוגדן אנטי מאר13. מקרופאגים הם phagocytes מקצועי. סיווג מהיר של תאים אפוטוטיים על ידי מקרופאגים חשוב עיכוב של דלקת ותגובות אוטואימוניות נגד אנטיגנים תאיים. קולטן מר טירולך קינאז הוא קריטי עבור מקרופאג הבזים וסיווג יעיל של תאים אפוטוטיים14. בטחול העכבר, Mer מבטא בעיקר על אזור שולי מקרופאגים גוף מוחשי13.
הפרוטוקול המוצג כאן מתאר שיטה בסיסית כדי לגרום אפופטוזיס התא ולהפגין דרכים למדוד את התהליך ואת היעילות של efferocytosis. פרוטוקולים אלה ניתן להתאים בקלות כדי ללמוד efferocytosis על ידי סוגי תאים אחרים בתוך שתבלע של תאים אפוטוטיים של מקורות שונים.

<table><tbody><tr><td>מאגר ליזינג Ack</td><td>GIBCO</td><td>A10492</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V/7-AAD</td><td>BD Pharmingen</td><td>559763</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד Mer</td><td>R& D Systems</td><td>BAF591</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-PE (שיבוט M1/70)</td> <td>BD Pharmingen</td><td>553311</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Invitrogen</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-2650</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0.5 מ"מ)</td> <td>GIBCO</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>צינורות FACS</td><td>BD Biosciences</td><td>352017</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות חלביות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-552-343</td><td></td></tr><tr><td>סרום סוסים (מנוטרל בחום)</td><td>Invitrogen</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>לידוקאין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>L-5647</td><td>הכן מאגר 1% ב-1x PBS</td></tr><tr><td>PBS, 1x</td><td>קורנינג</td><td>21040CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>קורנינג</td><td>10040CV</td><td></td></tr><tr><td>RXDX-106</td><td>סלק כימיקלים</td><td>CEP-40783</td><td></td></tr><tr><td>סטאורוספרין (100 מ"ג)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP2541-100</td><td>הוסף 214.3 מ"ל של DMSO לתוך 100 מ"ג להכנת תמיסת גרב של 1 מ"מ</td></tr><tr><td>Thioglycolate Medium Brewer Modified</td><td>BD Biosciences</td><td>243010</td><td>הכן 3% מאגר תיוגליקולט ב-1&cute; PBS, חיטוי, ומאחסנים בחושך למשך 3 חודשים.</td></tr></tbody></table>

אנליזה ניסויית של האפוטוטיק הפיקרוציט על ידי המקפאגים

Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages

ואפופטוזיס תא הוא תהליך טבעי וממלא תפקיד קריטי בפיתוח עובריים, רגולציה הומסטטית, עמידות החיסונית אינדוקציה, ורזולוציה של דלקת. הצטברות של פסולת אפוטוטית בגוף עלולה לגרום לתגובות דלקתיות כרוניות המובילות מחלות אוטואימוניות מערכתית לאורך זמן. . מעורב במגוון מחלות אוטואימוניות סיווג האפוטוטיק הוא תהליך מורכב שנדיר לעתים רחוקות בתנאים פיזיולוגיים. זה כולל קולטני שטח שופע מולקולות איתות. לימוד התהליך של הסיווג התא האפוטוטיק מספק מנגנונים מולקולריים תובנה ותגובות ביולוגיות עוקבות, אשר עשוי להוביל לפיתוח של therapeutics חדש. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים עבור אינדוקציה של thymocytes האפוטוציטים, הכנת מקרופאגים הצפק, וניתוח של הסיווג התא האפוטוטיק על ידי הזרמת cy, ומיקרוסקופ. כל התאים יעברו אפופטוזיס בשלב מסוים, ומגורים רבים במחזור התאים יכולים ספיגה של פסולת אפוטוטית. לכן, הפרוטוקול המתואר כאן יכול לשמש ביישומים רבים כדי לאפיין את כריכת התא האפוטוטית ובליעה של סוגים רבים של תאים אחרים.

ניתוח של מקרופאג הצפק-מתווך של האפוטוציטים. מקרופאגים הצפק ותאי האפוטוטיק היו מוכנים ושיתוף תרבותי כפי שמתואר בפרוטוקול. מקרופאגים היו מנותקים ומוכתמים עם הנוגדן PE anti-CD11b באוב עבור 20 דקות על הקרח. מקרופאגים נשטפו לאחר מכן ועובדו באמצעות ציטוטומטר זורם. כפי שנראה, אין CFSE חיובי מקרופאג ברביע הימני התחתון כאשר לא נוספו תאים האפוטוטיים לתוך התרבות (איור 1A ואיור 2, הפאנל הראשון). ליוגליל-מקרופאגים בצפק ממריצים יש את הקיבולת ...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להכין thymocytes, מקרופאגים הצפק ולנתח את היעילות של efferocytosis ואת החסימה בתיווך מעכבי של האפוטוציטים thymocytes שתבלע. פרוטוקול זה יש יישום נרחב בסיווג התא-תיווך של חלקיקים אחרים כולל חרוזים מלאכותיים וחיידקים.

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution ...

הגוף שלנו מייצר אחד עד 10 מיליארד תאים אפטוטיים בכל יום. הסיווג היעיל של תאים אלה מסייע בהסרת פסולת תאים ושמירה על מלאי. שיטה זו עשויה לשמש ביישומים רבים כדי לאפיין איגוד תאים אפטוטיים בליעה על ידי סוגים רבים אחרים של תאים phagocytic.הדגמת הליך זה יהיה Yuxuan ג'ן, טכנאי בכיר במעבדה שלי. כדי לקצור thymocytes, לאחר פתיחת חלל החזה של עכבר C57 שחור נאיבי 6, להשתמש מלקעות קצה דק מעוקל לשלוף את התימוס. מניחים את האיבר לתוך צלחת תרבות רקמות המכיל 10 מיליליטר של RPMI 1640 בינוני.טוחנים את כל התימוס כנגד הקצוות הקפואים של שתי מגלשות מיקרוסקופ ומסננים את ההשעיה של הרקמה שנוצרת דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לצינור של 50 מיליליטר. לאסוף את thymocytes על ידי צנטריפוגה ולתלות את גלולה ב 40 מיליליטר. לאחר הספירה, צנטריפוגה התאים שוב resuspend עד פעמיים 10 לשמונה תאים ב 20 מיליליטר של PBS טרי לכל צינור 50 מיליליטר.סמן את התאים עם חמישה CFSE מיקרומולרי ב 20 מיליליטר של PBS לכל צינור. הפוך את הצינורות פעמיים עד שלוש פעמים כדי לערבב לפני דגירה thymocytes במשך לא יותר משתי דקות בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור. בסוף הדגירה, לעצור את התגובה עם 10 מיליליטר של חום מושבת סרום סוס ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה.תן שימוש חוזר בתאים המסומנים ב-40 מיליליטר של PBS טרי לספירה וצנטריפוגה ואחריו שטיפה נוספת עם 40 מיליליטר של מדיום. לאחר שטיפה בינונית, להשתמש מחדש thymocytes ב 7 פעמים 10 לשישה תאים למיליליטר של רקמות תרבות ריכוז בינוני וזרע את התאים בצלחת 100 מילימטר רקמה. לאחר מכן הוסיפו סטאורוספורין לתרבות התאים בריכוז סופי מיקרומולרי אחד וה מניחים את הצלחת באינקובטור של תרבות הרקמות במשך ארבע שעות.לבידוד מקרופאג צפק, הזריקו שני עכברים שחורים C57 6 תוך-אפית עם מיליליטר אחד של תיוגליקולאט בגיל 3% ביום אפס לפני פתיחת עור הבטן מבלי להפריע לפריטון ביום החמישי. כדי לשטוף את חלל הצפי, השתמש מזרק 10 מיליליטר מצויד מחט מד 18 לדחוף במהירות 10 מיליליטר של חיץ לשטוף לתוך החלל לפני שאיפה איטית את מאגר לשטוף לאוסף לתוך צינור 50 מיליליטר. לשטוף את שטיפת צבד פעמיים עם PBS.תן שימוש חוזר במאקרופאגים צפי פעמיים 10 לשישה תאים למיליליטר של ריכוז בינוני של תרבות הרקמות. הזרע הבא 500 microliters של מקרופאגים לתוך כל באר של צלחת 24 גם למקם את הצלחת באינקובטור תרבות רקמות במשך שעתיים. בסוף הדגירה, שאפו את העל-טבעי כדי להסיר את התאים הצפים ולהוסיף 500 מיקרוליטרים של מדיום של תרבות רקמות לכל באר.מיד להוסיף אפס ל 12 פעמים 10 לשישה thymocytes ב 500 microliters של בינוני לכל באר של התרבות ולמקום את הצלחת באינקובטור תרבות הרקמה במשך ארבע שעות. בסוף הדגירה, לשטוף כל טוב פעמיים עם PBS טרי כדי להסיר את כל התאים apoptotic צף חינם ואחריו לשטוף אחד עם חיץ כתמים. לאחר מכן תייג את המקרופאגים הקשורים לצלחת עם 200 מיקרוליטרים של מאגר כתמים בתוספת נוגדן אנטי-CD11b מתאים ל הבאר והצב את הצלחת בארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.בניסוי מייצג זה, עד 30% מהמקרופאגים התיוגליקולטים הממריצים את ה- peritoneal הפגינו איתות חיובי בערוץ CFSE המציין כי phagocytes אלה בלעו תאים אפופוטוטיים המסומנו על ידי CFSE. תצפית מיקרוסקופית של אפילוף מקרופאג של תאים אפופטיים חיונית לחקירת היכולת של מקרופאגים לבלוע תאים אפטוטיים כמו מקרופאגים חיוביים CFSE פרושים ברביע הימני התחתון בשל התעצמויות שונות המציין כי מספר תאים apoptotic בתוך מקרופאגים בודדים שונה. יחס גבוה יותר של תאים אפופטיים למאקרופגים לא רק מגדיל את מספר המקרופגים הנבלעים תאים אפופטיים, אלא גם משפר את היכולת של המקרופגים לבלוע יותר תאים אפופטיים.בסדרה אחרת של ניסויים, כ -15% מהמקרופאג'ים הפכו לחיוביים CFSE כאשר CFSE שכותרתו thymocytes apoptotic נוספו לתרבות המקרופאז 'במשך ארבע שעות המציין כי מקרופאגים אלה היו מקרופאגים phagocytic. הנוגדן Mer חוסם את יעילות המקרופאגים באופן תלוי מינון והחסימה הכוללת עשויה להיות אחראית ל-30% מיעילות היעילות של היעילות בסביבה הנוכחית. בנוסף, מעכב קולטן TAM שאושר לאחרונה מחליט את יעילות המקרופאז' באופן תלוי מינון עד לריכוז של כ -100 ננומולרים.זכור תמיד לבדוק את אחוז התאים apoptotic כמו מספר זה משפיע ישירות על היעילות של efferocytosis. מקרופאגים phagocytic ניתן לנתח עוד יותר על ידי כתם מערבי כדי לחקור את מולקולות איתות מוסדר על ידי תהליך אפילציה על ידי מיקרוסקופיה כדי לחקור את הדינמיקה של אפילציה.

experimental-analysis-of-apoptotic-thymocyte-engulfment-by-macrophages

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

בסרטון זה, אנו מדגימים את בדיקת האפרוציטוזיס כדי לחקור את פינוי התאים האפופטוטיים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. אפרוציטוזה היא תהליך רב-שלבי שבו תאים אפופטוטיים נבלעים על ידי פגוציטים ומתפרקים בתוך שלפוחיות הנקראות אפרוזומים. פרוטוקול זה מספק שיטה לדמיין חלקים מופנמים ולא מופנמים של תאים אפופטוטיים בודדים ולכמת אפרוציטוזה.

בדיקת אפרוציטוזה של תאים קבועים: שיטה לחקר ספיגה אפרוציטית של תאים אפופטוטיים על ידי מקרופאגים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

סרטון זה מדגים הליך לניתוח אפרוציטוזה בתיווך מקרופאגים פריטוניאליים של תימוציטים של עכבר אפופטוטי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

ניתוח של efferocytosis של thymocytes אפופטוטי על ידי מקרופאגים פריטוניאליים

סרטון זה מציג בדיקת אפופטוזיס בתאי סרטן המושרה על ידי תאי T משפיעים שהופעלו מראש. על ידי תרבית משותפת של תאים אלה עם תאים סרטניים המסומנים בגרעינים פלואורסצנטיים, מתווסף מצע פלואורוגני הניתן לשבירה קספאזית. תאי סרטן אפופטוטיים יציגו צבע שונה בגרעין שלהם, מה שיוביל לפלואורסצנטיות כפולה. פלואורסצנטיות כפולה זו מעידה על תאים סרטניים העוברים אפופטוזיס.

בדיקת מבחנה לחקר ציטוטוקסיות של תאי T CD8+ מופעלים מראש נגד תאים סרטניים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לקביעת אירועי איתות תוך-תאיים המושרים בתאים ברי קיימא על ידי אינטראקציה פיזית עם תאים מתים או גוססים סמוכים. הפרוטוקול מתמקד באירועי איתות המושרים על ידי זיהוי בתיווך קולטנים של התאים המתים, בניגוד לספיגה הפגוציטית שלהם או שחרור של מתווכים מסיסים.

זיהוי של איתות תאיים אירועים מושרה תאים קיימא על ידי אינטראקציה עם תאים שכנים מוות של תאים אפופטוטיים שעברו

אנו כאן לתאר assay phagocytosis באמצעות תאים עובריים מפוזרים של תסיסנית . זה מאפשר לנו בקלות ובמדויק לכמת רמות phagocytosis vivo , וכדי לזהות מולקולות חדשות הנדרשות phagocytosis של תאים אפופטוטיים.

Assay Phagocytosis עבור תאים אפופטוטיים ב תסיסנית עוברים

כאן נתאר שיטות באמצעות דיסק מסתובב קונפוקלית לאירועים phagocytic יחיד תמונה על-ידי מקרופאגים הצפק תושב העכבר. ניתן להאריך את הפרוטוקולים לתאים אחרים phagocytic.

זמן לשגות הדמיה תלת-ממדית של Phagocytosis על ידי העכבר מקרופאגים

Efferocytosis, הסרת phagocytic בתאים אפופטוטיים להיפגע, הוא נדרש כדי לשמור על הומאוסטזיס, בהנחייתם של רצפטורים, איתות המסלולים המאפשרים זיהוי, היבלעות של הפנמה של מוות תאים. במסמך זה, אנו מציגים מיקרוסקופ פלורסצנטיות פרוטוקול עבור כימות של efferocytosis וכן את פעילותם של efferocytic איתות המסלולים.

כימות של Efferocytosis על-ידי קרינה פלואורסצנטית תא בודד מיקרוסקופ

נתאר כאן פרוטוקול לחקור cytotoxicity של טרום הופעל CD8+ T תאים נגד תאים סרטניים על ידי גילוי אפופטוטיים להיפגע סרטן תאים באמצעות בזמן אמת מיקרוסקופ. פרוטוקול זה יכול לחקור מנגנונים מאחורי מיאלואידית הנוצרות על-ידי תאי T cell דיכוי והערכת תרכובות שמטרתה חידוש תאי T באמצעות המצור של תאים חיסוניים מיאלואידית מדכאים.

זיהוי בזמן אמת של הגידול Vitro תאים אפופטוזיס שנגזרות CD8+ T תאים ללמוד פונקציות החיסונית מדכא גידולים הסתננות התאים מיאלואידית

מחלות ניווניות קשורות לתפקודי מיקרוגליה דיסרגטיים. מאמר זה מתאר במבחנה של פאגוציטוזיס של תאי נוירובלסטומה על ידי iPSC-מקרופאגים. קריאות מיקרוסקופיה כמותית מתוארות הן עבור הדמיה בזמן-זמן של תאים חיים והן עבור הדמיה בעלת תוכן גבוה של תאים קבועים.

במבחנה הדמיה כמותית אסאי עבור פאגוציטוזיס של תאי נוירובלסטומה מתים על ידי iPSC-מקרופאגים

פרוטוקול זה מבוסס על LPS ומוות כתוצאה מ-ATP של מקרופאגים THP-1 ממוינים ב-PMA. אנו משתמשים בציטומטריית זרימה כדי לנתח צביעה כפולה של Annexin V ו-7-AAD כדי לזהות מוות תאי, תוך שימוש בתא כולו ושימוש במיקרוסקופ אלקטרונים סורק כדי לצפות במורפולוגיה של קרום התא.

LPS ומוות כתוצאה מ-ATP של מקרופאגים THP-1 ממוינים ב-PMA ותיקופו

למדו פרוטוקול להכנת תימוציטים אפופטוטיים ומקרופאגים פריטוניאליים לחקר אפופטוזה ואפגרוציטוזה. השיטה מאפשרת הערכת יעילות בליעת תאים מתים ומחקר השפעת מעכבים ספציפיים על התהליך בביולוגיית תאים ואימונולוגיה.

אנליזה ניסויית של האפוטוטיק הפיקרוציט על ידי המקפאגים

גלה סרטונים נוספים