Name: הערכה של אינטראקציות חלבונים-חלבונים באמצעות טכניקת העיכול האנטי-ממברנה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: למד טכניקת העיכול האנטי-ממברנה להכנת דגימות לספקטרומטריית מסות ולניתוח אינטראקציות חלבונים. שיטה זו מייעלת את התהליך על ידי ביטול הצורך באלקטרופורזה בג'ל פוליאקרילאמיד.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה היה נתמך בחלק על ידי החברה היפן לקידום המדע KAKENHI גרנט מספר 17K09869 (כדי AM), יפן האגודה לקידום המדע KAKENHI גרנט מספר 15K09418 (ל TM), מענק מחקר מבית החולים Kanehara איצ'ירו המדע ומענק מחקר מקרן הזיכרון של סוזוקן (all-TM).

1. Immunoprecipitation
הערה: השתמשנו במאגר הליזה שאינו נתרן dodecyl סולפט (SDS) ומשחרלי ציטראט, כפי שמתואר בסעיפים הבאים. עם זאת, השימוש בטכניקה immunoprecipitation חלופית בתוך הבית עשוי להיות גם ישים עבור הכנת דגימות LC-MS/MS.
<ol><li>מעבר תאים מתורבתים עם וקטורים קידוד תג אפירופה לבד או חלבון פיוז'ן. עבור רכישת נתונים נציג, העברת J774 תאים (1 x 106) עם וקטורים קידוד חלבון פלורסנט ירוק (gfp) בלבד או gfp-התמזגו Capn6 (calpain-6 גנים) באמצעות ליפוזומים בליקיק.</li>
	<li>נוגדן ממשלים לחרוזים מגנטיים.<ol>
<li>למטרה זו, לערבב אנטי GFP נוגדן (2 μL/התגובה) עם חרוזים מגנטיים (25 μL/תגובה) ב 500 μL של מאגר ציטראט פוספט (24.5 מ"מ חומצה לימון, 51.7 mM dibasic נתרן פוספט; pH 5.0) במבחנה 1.5 mL.</li>
		<li>לסובב את התערובת ב 50 סל ד עבור 1 h בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטוף את החרוזים המצוייסים שלוש פעמים עם מאגר פוספט ציטראט המכיל 0.1% פוליוקסלין (20) סורביתן מונאולאורון.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאחר מכן תאים מזוהמים באמצעות מאגר פירוק המתאים. עבור רכישת נתונים נציג, לאחר תאים מזוהמים 30 דקות על הקרח ב 400 μL של מאגר לפירוק (50 mM טריס-HCl; pH 7.5, 120 mM הנאקל, 0.5% פולי (oxye,) octylphenyl אתר) המכיל 40 Μm/L פנילתיל סולולוניל, 50 μg/mL לleupeptin, מתוך. mL aprotinin נין, 200 μm/ליטר נתרן אורטודאנואט, ו 1 מ"מ אתילן (EGTA) בחומצה בדיקה 1.5 mL 24 שעות לאחר הזיהום.</li>
	<li>נקה את הליפוסט על ידי תפרידו ב 15,000 x g עבור 5 דקות ולאסוף את supernatant.</li>
	<li>. לנקות את הליפוסט הוסף חרוזים מגנטיים ללא תווית (25 μL/תגובה) במבחנה 1.5 mL-מבחן. שטוף את החרוזים שלוש פעמים עם 500 μL של מאגר ציטראט פוספט. לאחר הסרת מאגר פוספט ציטראט בשטיפה הסופי, להוסיף את התא למטה על החרוזים המגנטיים. לסובב את התערובת באמצעות מסובבי ב 50 סל ד עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>מניחים את צינור הבדיקה על מעמד מגנטי עבור 5 דקות עבור הפרדה מגנטית, ולאסוף את התא ליפוסט. מומלץ להשתמש במעמד המגנטי המיועד ליצרן.</li>
	<li>אגד את חלבונים היעד לחרוזים מצוהים. מניחים את החרוזים החיסוני (Ig) G-מעלה על דוכן מגנטי עבור 5 דקות עבור הפרדה מגנטית, למחוק את מאגר ציטראט, ולאחר מכן להוסיף את התא ליפוסט החרוזים המופרדים.</li>
	<li>לסובב את התערובת ב 50 סל ד עבור 1 h בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הפרד בין החלבונים היעד מחלבונים ללא יעד בחינם. לשטוף את החרוזים שלוש פעמים באמצעות 500 μL של מאגר פוספט ציטראט המכיל 0.1% Polyoxyethylene (20) סורביתן monolaurate. לאחר השטיפה הסופית, להוסיף 30 μL של מאגר ציטראט (pH 2 – 3), ו דגירה עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי elute היעד חלבונים. הערה: אם ההתאוששות מimmunoprecipitation אינה מספיקה, השימוש בתגי אפירופה חלופיים, כגון דגל או שלו, עשוי לשפר את היעילות. אם היעילות של הימנעות אינה מספיקה, השימוש באלואנטים אחרים, כגון פתרון מבוסס SDS, עשוי לשפר את היעילות.</li>
</ol>2. העיכול על-ממברנה של חלבונים
הערה: שימוש בחומרים וציוד ללא חלבון הכרחי כדי למנוע זיהום בחלבונים אקגניים. בנוסף, מומלץ כי המפעיל ללבוש מסכה כירורגית וכפפות כדי למנוע זיהום על ידי חלבונים אנושיים.
<ol><li>חותכים ממברנות PVDF לתוך 3 מ"מ x 3 מ"מ חתיכות באמצעות מספריים כירורגי כי נמחקו עם מתנול ומיובשים מיד לפני השימוש.</li>
	<li>הוסף 2 – 5 μL של אתנול על פיסות של קרום PVDF על רדיד אלומיניום נקי.</li>
	<li>לפני שהם יבשים לחלוטין, להוסיף את הללויה (2 – 5 μL כל אחד, 4 – 6 חתיכות לכל מדגם) על הקרומים PVDF הידרופילי, ולאחר מכן האוויר יבש הקרומים עד משטח הקרום הופך מאט. ניתן לאחסן ממברנות יבשים ב -4 ° c.</li>
	<li>העבר את כל הקרומים לתוך 1.5 מ"ל צינורות פלסטיק, להוסיף 20 – 30 μL של אתנול כדי להפוך את הקרומים הידרופילי, ולאחר מכן להסיר את האתנול באמצעות פיפטה.</li>
	<li>לפני הקרום מתייבש לחלוטין, להוסיף 200 μL של dithiothreitol (DTT) מבוססי פתרון התגובה (80 mM NH4hco3, 10 מ"מ dtt, ו 20% acetonitrile) ו-דגירה את זה ב 56 ° c עבור 1 h.</li>
	<li>החלף את פתרון התגובה עם 300 μL של פתרון iodoacetamide (80 mM NH4hco3, 55 mm iodoamide, ו 20% acetonitrile), ו דגירה עבור 45 מינימום בטמפרטורת החדר בחושך.</li>
	<li>רוחצים את הקרומים פעמיים עם 1 מ ל של מים מזוקקים ופעם אחת עם 1 מ ל של 2% acetonitrile על ידי ערבוב מערבולת עבור > 10 s.</li>
	<li>התמוססות הגברת טריפסין (טבלת חומרים) ישירות בפתרון הריאקציה (30 מ"מ NH4hco3 המכיל 70% acetonitrile). הוסף 100 μL של פתרון התגובה המכיל 1 μg של טריפסין (טבלת חומרים) (30 מ"מ NH4hco3 המכיל 70% acetonitrile) ו דגירה ב 37 ° צ' לילה.</li>
	<li>העבר את פתרון התגובה המכיל את מעכל טריטיק לתוך שפופרת נקי 1.5 mL באמצעות פיפטה.</li>
	<li>הוסף 100 μL של הפתרון לשטוף (70% acetonitrile/1% trifluoroacetic חומצה) כדי קרום ו מודטה אותו ב 60 ° צ' עבור 2 h. לאסוף את הפתרון לשטוף ולערבב אותו עם פתרון התגובה. הוסף עוד 100 μL של הפתרון לשטוף את קרום וsonicate אותו עבור 10 דקות. לאחר מכן לאסוף את הפתרון לשטוף ולערבב עם פתרון התגובה.</li>
	<li>מכסים את צינור הבדיקה עם פיסת סרט מעבדה ולעשות כמה חורים קטנים עם מחט. יבש את הפתרון באמצעות מרכז ואקום.</li>
	<li>מפזר את שאריות ב 10 μl של 0.2% חומצה פורמית. לאחר צנטריפוגה (12,000 × g, 3 דקות בטמפרטורת החדר), העבר את הסופרנטנט לתוך שפופרת דגימה. הערה: הסירים הם הצעדים הקריטיים בסעיף זה. במהלך העיכול חלבון ממברנה, כביסה של הקרומים המכילים את החלבונים לאחר הפחתת והאללציה עם מים מזוקקים, ואחריו 2% acetonitrile, עבור יותר מ 10 שניות כל אחד, הוא קריטי להסרת הריאגנטים.</li>
</ol>3. LC-electrospray יינון (ESI)-ניתוח MS/MS
<ol><li>הפעלת כלי ESI-MS/MS (טבלת חומרים) בשילוב עם מערכת מערכות ננו-LC (טבלת חומרים). קישור עמוד מראש (טבלת חומרים) וטור אנליטי (טבלת חומרים).</li>
	<li>לפני הניתוח, לכייל את ספקטרומטר המסה באמצעות מעכל טריטיק של סרום שור מומס 0.2% פורמית חומצה, המספקת פפטידים סטנדרטיים.</li>
	<li>ניתוח דגימות באמצעות מצב יון חיובי וטווח מסה של 400 – 1250 m/z; לאחר מכן לרכוש עד 10 ms/ms ספקטרום (100 ms כל אחד) עם טווח המוני של 100-1600 m/z ו מעבר ליניארי של 2% – 80% acetonitrile ו 0.2% פורמית חומצה עבור 80 דקות בקצב הזרימה של 300 nL/min.</li>
	<li>ניתוח נתוני הפלט באמצעות תוכנה לזיהוי חלבונים (טבלת חומרים) כדי לזהות את המועמדים המשויכים חלבונים. לזיהוי חיובי של חלבון מועמד, יש צורך בזיהוי של רסיס פפטיד באיכות גבוהה אחד לפחות (> 95% אמינות).</li>
	<li>להשמיט את החלבונים כי הם זירז דומה ב-GFP-ביטוי lysates (העברה של וקטור ביטוי תג GFP לבד) מרשימת חלבונים המועמדים. הערה: אם מעט חלבונים מזוהים בניתוח מסד הנתונים, שינוי של תנאי הרכישה MS/MS (g., שינוי הזמן מ 100 ms כל אחד ל 50 ms כל) עשוי להגדיל את מספר החלבונים המזוהים.</li>
</ol>

<ol><li>Thommen, M., Holtkamp, W., Rodnina, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-translational+protein+folding%3A+progress+and+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Co-translational protein folding: progress and methods.</a> Current Opinion in Structural Biology. 42, 83-89 (2017).</li>
<li>Miyazaki, T., Miyazaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+protein+catabolism+in+atherosclerotic+vascular+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Defective protein catabolism in atherosclerotic vascular inflammation.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 79(2017).</li>
<li>Miyazaki, T., Miyazaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+calpain+proteolytic+systems+underlies+degenerative+vascular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Atherosclerosis+and+Thrombosis%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of calpain proteolytic systems underlies degenerative vascular disorders.</a> Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 25 (1), 1-15 (2018).</li>
<li>Steckelberg, A. L., Boehm, V., Gromadzka, A. M., Gehring, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CWC22+connects+pre-mRNA+splicing+and+exon+junction+complex+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">CWC22 connects pre-mRNA splicing and exon junction complex assembly.</a> Cell Reports. 2 (3), 454-461 (2012).</li>
<li>Turriziani, B., von Kriegsheim, A., Pennington, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interaction+detection+via+mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interaction detection via mass spectrometry-based proteomics.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 919, 383-396 (2016).</li>
<li>Obama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+modified+apolipoprotein+B-100+structures+formed+in+oxidized+low-density+lipoprotein+using+LC-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of modified apolipoprotein B-100 structures formed in oxidized low-density lipoprotein using LC-MS/MS.</a> Proteomics. 7 (13), 2132-2141 (2007).</li>
<li>Matsudaira, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+from+picomole+quantities+of+proteins+electroblotted+onto+polyvinylidene+difluoride+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted onto polyvinylidene difluoride membranes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 262 (21), 10035-10038 (1987).</li>
<li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+method+for+N-terminal+sequencing+of+proteins+by+MALDI+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High-throughput method for N-terminal sequencing of proteins by MALDI mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 77 (2), 645-651 (2005).</li>
<li>Iwamatsu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-carboxymethylation+of+proteins+transferred+onto+polyvinylidene+difluoride+membranes+followed+by+in+situ+protease+digestion+and+amino+acid+microsequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">S-carboxymethylation of proteins transferred onto polyvinylidene difluoride membranes followed by in situ protease digestion and amino acid microsequencing.</a> Electrophoresis. 13 (3), 142-147 (1992).</li>
<li>Strader, M. B., Tabb, D. L., Hervey, W. J., Pan, C., Hurst, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+specific+trypsin+digestion+of+microgram+to+nanogram+quantities+of+proteins+in+organic-aqueous+solvent+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Efficient and specific trypsin digestion of microgram to nanogram quantities of proteins in organic-aqueous solvent systems.</a> Analytical Chemistry. 78 (1), 125-134 (2006).</li>
<li>Miyazaki, T., Miyazaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+calpain+proteolytic+systems+in+macrophage+cholesterol+handling%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of calpain proteolytic systems in macrophage cholesterol handling.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (16), 3011-3021 (2017).</li>
<li>Miyazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calpain-6+confers+atherogenicity+to+macrophages+by+dysregulating+pre-mRNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Calpain-6 confers atherogenicity to macrophages by dysregulating pre-mRNA splicing.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3417-3432 (2016).</li>
<li>Tonami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calpain-6%2C+a+microtubule-stabilizing+protein%2C+regulates+Rac1+activity+and+cell+motility+through+interaction+with+GEF-H1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Calpain-6, a microtubule-stabilizing protein, regulates Rac1 activity and cell motility through interaction with GEF-H1.</a> Journal of Cell Science. 124 (Pt 8), 1214-1223 (2011).</li>
<li>Rodnina, M. V., Wintermeyer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+elongation%2C+co-translational+folding+and+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein elongation, co-translational folding and targeting.</a> Journal of Molecular Biology. 428 (10 Pt B), 2165-2185 (2016).</li>
<li>Bunai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+acrylamide+gel+separated+proteins+immobilized+on+polyvinylidene+difluoride+membranes+following+proteolytic+digestion+in+the+presence+of+80%25+acetonitrile%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of acrylamide gel separated proteins immobilized on polyvinylidene difluoride membranes following proteolytic digestion in the presence of 80% acetonitrile.</a> Proteomics. 3 (9), 1738-1749 (2003).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

בעבר תיארנו ניתוח של שינויים חמצוניים של אפוליפופרוטאין B-100 ב תחמוצת בצפיפות נמוכה ליפופרוטאין באמצעות LC-ms/ms לפניו על-ידי טכניקה העיכול הממברנה6. במחקר הנוכחי, אנו משולבים טכניקה זו עם immunoprecipitation וזיהה מספר calpain-6-הקשורים חלבונים. טכניקה זו מייצגת שיטה נוחה להקרנה עבור חלבונים הקשורים למועמדים. Calpain-6 הוא חבר שאינו פרוטנוגד חרדה של המשפחה calpain פרוטחרדה משפחה11 כי הדיווחים לשנות את הפונקציות הסלולר באמצעות החלבון שלה אינטראקציות חלבון...

למרות החלבונים לשחק תפקידים מחוקה באורגניזמים חיים, הם מסונתז ללא הרף, מעובד, ומושפל בסביבה תאיים. יתר על כן, חלבונים תאיים לעתים קרובות האינטראקציה פיזית ביולוגית, אשר משפיע על הפונקציה של אחד או שניהם1,2,3. לדוגמה, הכריכה הישירה של הומוCWC22 החלבון המשויך ל-איקריוטית באמצעות תרגום מסוג 4a3 (eIF4A3) הכרחית להרכבת מתחם הצומת אקסון4. בהתאם למצב זה, מוטציה eIF4A3 חסר אהדה עבור CWC22 נכשלת להקל על החדרת הצומת mRNA מונחה מורכבים מורכב של שחבור4. לפיכך, המחקר של אינטראקציות חלבונים הוא חיוני להבנה מדויקת של רגולציה הפיזיולוגית כמו גם של פונקציות סלולריות.
ההתקדמות האחרונה בספקטרומטר המסה (MS) הוחלו על הניתוח המקיף של אינטראקציות חלבונים בחלבון. למשל, שיתוף משקעים של חלבונים אנדוגני או אקסוגנבאופן ברור הציג חלבונים מתויגים עם החלבונים המשויכים שלהם, ואחריו ניתוח MS, מאפשר זיהוי של אינטראקציות החלבון הרומן5. עם זאת, בקבוק אחד גדול של ניתוח MS/MS הוא התאוששות ירודה מעיכול טריפטי של דגימות חלבון. עבור ניהול ניתוחים פרוטאומית על lysates תא, ב-ג'ל ושיטות עיכול על-ממברנה מועסקים בדרך כלל כדי להכין בדיקות MS/MS. בעבר השוונו הליך העיכול ב-ג'ל עם טכניקת העיכול6, והראה כי האחרון היה קשור כיסוי רצף טוב יותר. Pvc difluoride (pvdf) קרום עשוי להיות מתאים למטרה זו, כי היא חזקה מכנית עמידים בפני ריכוזים גבוהים של ממיסים אורגניים7,8, המתיר העיכול אנזימטי של קיבוע חלבונים בנוכחות 80% acetonitrile9. יתר על כן, השתק על קרום יכול לגרום לשינויים שינויים בחלבונים היעד, המוביל שיפורים ביעילות העיכול הטריפטי10. בהתאם לכך, במאמר זה, תיארנו את השימוש בניתוח immunoprecipitation-LC/MS/MS של אינטראקציות חלבונים באמצעות טכניקת העיכול על הממברנה. שיטה פשוטה זו מקלה על הניתוח הנוח של אינטראקציות חלבונים בחלבון גם במעבדות שאינן מתמחות.

<table><tbody><tr><td>אצטוניטריל</td><td>וואקו</td><td>014-00386</td><td></td></tr><tr><td>חומצת לימון</td><td>Wako</td><td>030-05525</td><td></td></tr><tr><td>DiNA</td><td>KYA Tech Co.</td><td></td><td>כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים של nanoflow</td></tr><tr><td>DiNa AI</td><td>KYA Tech Co.</td><td></td><td>כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים של nanoflow המצוידת בדגימה אוטומטית</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Nacalai tesque</td><td>14112-94</td><td></td></tr><tr><td>חלבון Dynabeads G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>חומצה פורמית</td><td>Wako</td><td>066-00461</td><td></td></tr><tr><td>HiQ Sil C18W-3</td><td>KYA Tech Co.</td><td>E03-100-100</td><td>0.10 מ"מ * 100 מ"מ</td></tr><tr><td>יודואצטמיד</td><td>Wako</td><td>095-02151</td><td></td></tr><tr><td>ליפופקטמין 3000</td><td>תרמו פישר L3000008</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צבעים חיים A.v. נוגדן חד שבטי (JL-8)</td> <td>Clontech</td><td>632380</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Wako</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>NH4HCO3</td><td>Wako</td><td>018-21742</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>Sigma</td><td>N6507</td><td>poly (oxyethelene) octylphenyl ether (n = 9)</td></tr> <tr><td>פפטיד סטנדרטי</td><td>KYA Tech Co.</td><td>tBSA-04</td><td>תקצירים טריפטיים של אלבומין סרום בקר</td></tr><tr><td>PP בקבוקון</td><td>KYA Tech Co.</td><td>03100S</td><td>פלסטיק צינור דגימה</td></tr><tr><td>מעכב פרוטאז קוקטייל</td><td>סיגמא</td><td>P8465</td><td></td></tr><tr><td>ProteinPilot תוכנה</td><td>Sciex</td><td>5034057</td><td>תוכנה לזיהוי חלבונים</td></tr><tr><td>רצף כיתה שונה טריפסין</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td>טריפסין</td></tr><tr><td>נתרן אורתוואנדאט</td><td>סיגמא</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט דיהידראט</td><td>Sigma</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>TFA</td><td>Wako</td><td>206-10731</td><td></td></tr><tr><td>עמוד מלכודת</td><td>KYA Tech Co.</td><td>A03-05-001</td><td>0.5 מ"מ ID * 1 מ"מ</td></tr><tr><td>TripleTOF 5600 מערכת</td><td>Sciex</td><td>4466015</td><td>היברידית מרובע זמן טיסה טנדם ספקטרומטר מסה</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Wako</td><td>207-06275</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Wako</td><td>160-21211</td><td></td></tr></tbody></table>

הערכה של אינטראקציות חלבונים-חלבונים באמצעות טכניקת העיכול האנטי-ממברנה

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

חלבונים תאיים רבים אינטראקציה פיזית בהתאם לנסיבות תאיים שלהם מסחטות. אכן, פונקציות הסלולר תלוי במידה רבה חלבון תאיים – אינטראקציות חלבון. לכן, המחקר הנוגע לאינטראקציות אלו הוא הכרחי להקלה על הבנת התהליכים הפיזיולוגיים. שיתוף משקעים של חלבונים משויכים, ולאחריו ניתוח ספקטרומטר המסה (MS), מאפשר זיהוי אינטראקציות של חלבונים חדשניים. במחקר זה, סיפקנו את הפרטים של הטכניקה הרומן של immunoprecipitation-נוזלי כרומטוגרפיה (LC)-MS/MS ניתוח בשילוב עם העיכול על הקרום לניתוח של חלבון-אינטראקציות החלבון. טכניקה זו מתאימה לimmunoprecipitants גולמי ויכולה לשפר את התפוקה של ניתוחים פרוטאואריים. מתויג רקומביננטי חלבונים היו זירז באמצעות נוגדנים ספציפיים; בשלב הבא, immunoprecipitants מחק על החלקים הממבראני של הממברנה, שהיו חשופים לאלקיללציה. בעקבות טריסיזציה, משקעי החלבון המשועכלים נותחו באמצעות LC-MS/MS. באמצעות טכניקה זו, הצלחנו לזהות מספר מועמדים משויכים חלבונים. כך, שיטה זו היא נוחה ושימושית לאפיון של החלבון הרומן – אינטראקציות חלבונים.

באמצעות ההליך הנ ל תיאר, immunoprecipitants נותחו באמצעות LC-MS/MS (איור 1). לאחר החרגה של חלבונים הנגזרים באופן שונה (חלבונים ממינים אחרים IgGs), 17 חלבונים זוהו calpain-6-הקשורים immunoprecipitants (שולחן 1) ו 15 חלבונים זוהו ב gfp הקשורים immunoprecipitants ( טבלה 2). של calpain-6 ו-GFP הקשורים חלבונים, 11 זוהו הן immunoprecipitants (איור 2). ברגע אלה ו calpain-6 עצמו היו מנשלל, חמישה calpain-...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור טכניקת העיכול על הקרום להכנת דגימות עבור ספקטרומטר מסה. טכניקה זו מקלה על ניתוח נוח של אינטראקציות חלבון-חלבון.

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

חקר האינטראקציה בין חלבון לחלבון הוא הכרחי להבנת תהליכים פיזיולוגיים במספר תחומים. בסרטון זה אנו מציגים טכניקת עיכול על הממברנה המאפשרת לחוקרים לבצע ניתוח מקיף של חלבונים מחייבים על ידי טרשת נפוצה בצורה נוחה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנחנו יכולים לשפר את התפוקה של ניתוח פרוטומי עבור immunoprecipitants גולמי כי הפרדת חלבונים על ידי אלקטרופורזה ג'ל polyacrylamide אינו הכרחי.התחל באוב את הנוגדן אל חרוזים מגנטיים, על ידי ערבוב נוגדן נגד GFP עם חרוזים ב 500 microliters של חיץ ציטראט פוספט. סובבו את התערובת ב-50 סל"ד למשך שעה בטמפרטורת החדר. ואז לשטוף את חרוזים מצומדים שלוש פעמים עם חיץ פוספט ציטראט המכיל 1%polysorbate 20.ליס תפור תאים לפי הוראות כתב יד. מגרדים את המנה ומעבירים את הליטאזט למבחנה של 1.5 מיליליטר. ואז לנקות את lysate על ידי צנטריפוגה ב 15, 000 x g במשך חמש דקות ולאסוף את העל טבעי.הכינו חרוזים מגנטיים ללא חגורה על ידי שטיפתם שלוש פעמים עם 500 מיקרוליטרים של חיץ ציטראט פוספט. לאחר הכביסה הסופית, להסיר את המאגר ולהוסיף lysate תא חרוזים. סובבו את התערובת ב-50 סל"ד למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.בצע הפרדה מגנטית על מעמד מגנטי ולאסוף את התא lysate. כדי לקשור את חלבוני המטרה לחרוזים המצומדים אימונוגלובולין, מניחים את חרוזים על מעמד מגנטי במשך חמש דקות. השלך את מאגר הציטראט והוסף את lysate התא אל חרוזים.מסובבים את התערובת במשך שעה ב-50 סל"ד. כדי להפריד חלבוני מטרה מחלבונים חופשיים שאינם יעד, לשטוף את חרוזים שלוש פעמים עם 500 microliters של חיץ פוספט ציטראט המכיל 1%polysorbate 20. לאחר הכביסה הסופית, מוסיפים 30 מיקרוליטרים של חיץ ציטראט, ולתת את חרוזים לשבת במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לחמק חלבוני היעד.כדי להכין את הממברנה, לחתוך קרום PVDF לתוך 3 מילימטר על ידי חתיכות 3 מילימטר באמצעות מספריים כירורגיים שנוקו מיד לפני השימוש. מניחים את חתיכות הממברנה על רדיד אלומיניום ומוסיפים שניים עד חמישה מיקרוליטרים של אתנול לכל חתיכה. לפני שהממברנות יבשות לחלוטין, מוסיפים שניים עד חמישה מיקרוליטרים של החלבון אלבנט לכל חתיכה ומייבשים אותם באוויר עד שמשטח הממברנה הופך מט.ואז להעביר ממברנות לתוך 1.5 צינורות מיליליטר ולאחסן אותם בארבע מעלות צלזיוס. אם משתמשים מיד, מוסיפים שניים עד 30 מיקרוליטרים של אתנול אשר יגרום להם הידרופילי. הסר את האתנול עם פיפטה, אבל לפני הממברנות להתייבש, להוסיף לחלוטין 200 microliters של פתרון תגובה מבוסס DTT לכל צינור, ו דגירה אותם ב 56 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.לאחר הדגירה, להחליף את פתרון התגובה עם 300 microliters של פתרון iodoacetamide, דגירה בחושך במשך 45 דקות. לאחר מכן לשטוף את הממברנות פעמיים עם מים מזוקקים ופעם אחת עם 2% אצטוניטריל על ידי מערבולת לפחות עשר שניות. עבודה עם אצטוניטריל הקשורות diaphanous יכול להיות מסוכן מאוד.מסכה, משקפיים וכפפות תמיד צריך להיות משוחק בעת ביצוע הליך העיכול על קרום. הכינו טריפסין לפי הוראות כתב היד, והוסיפו 100 מיקרוליטרים של פתרון תגובת טריפסין לכל קרום. דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס לעיכול.למחרת, להעביר את פתרון התגובה לתוך צינור נקי 1.5 מיליליטר, ולהוסיף 100 microliters של פתרונות לשטוף את הממברנה. דגירה הממברנה ב 60 מעלות צלזיוס במשך שעתיים, ולאחר מכן לאסוף את פתרון לשטוף ומערבבים אותו עם פתרון התגובה. מוסיפים עוד 100 מיקרוליטרים של פתרון כביסה לממברנה ומניקים אותו במשך 10 דקות.לאחר מכן לאסוף את פתרון לשטוף ולערבב אותו עם פתרון התגובה. מכסים את המבחנה עם פיסת סרט מעבדה ולעשות חורים קטנים בסרט עם מחט. יבש את הפתרון באמצעות רכז ואקום, ולהמיס את השאריות ב 10 microliters של 2% חומצה פורמית.צנטריפוגה הצינור ב 12, 000 x גרם במשך שלוש דקות, ולהעביר את supernatant לתוך צינור מדגם. נתח את הדגימה באמצעות ספקטרומטר מסה המקושר למערכת ננו LC/HPLC. באמצעות פרוטוקול זה, זוהו 17 חלבונים ב- Calpain-6 הקשורים immunoprecipitant, 15 ב immunoprecipitant הקשורים GFP, ו 11 זוהו בשניהם.חשוב לציין כי זיהוי של שבר פפטיד אחד לפחות בנאמנות גבוהה נדרש לזיהוי חיובי של חלבון מועמד. חלבונים שזירזו את ליסאט GFP המביע כמו גם היסטון, חלבונים אקסוגניים וריבוזומליים הושמטו מהרשימה. שטיפת הממברנות לפני עיכול טריפטי במים מזוקקים ו-2% אצטוניטריל היא הצעד החשוב ביותר בהליך העיכול על הממברנה על חלבונים.בעקבות שיטה זו, ניתן לאשר משקעים שותף של חלבון היעד על ידי ביצוע ניסויים אחרים, כגון immunoprecipitation וניתוח כתם מערבי. שיטה פשוטה זו מאפשרת לחוקרים לחקור את אינטראקציות החלבון-חלבון החדשות עם ניתוח נוח ורגיש.

evaluation-proteinprotein-interactions-using-an-on-membrane-digestion

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

וידאו זה מראה ניסויים עם ניתוח בדיעבד של חלבונים אינטראקציות על ידי שימוש במיקרו בדוגמת משטחים. הגישה מציעה את האפשרות לזהות אינטראקציות חלבון בתאים חיים, והוא משלב יכולות התפוקה גבוהה עם אפשרות לחלץ מידע כמותי.

In-vivo גילוי של חלבונים אינטראקציות על מיקרו-בדוגמת משטחים

חלבונים אינטראקציה בדיקה הכרחית לנתיחה של פונקציונליות חלבון. הנה, אנחנו...

חלבון ממברנה Assay Overlay: פרוטוקול בדיקת אינטראקציה בין חלבונים מסיסים ובחלקם לא מסיסים במבחנה</em

טיהור טנדם הזיקה היא גישה חזקה לזיהוי של שותפים חלבון מחייב. כהוכחה של המושג, מתודולוגיה זו יושמה כדי eIF4E היטב מאופיין ייזום גורם תרגום המשקע שיתוף סלולריים גורמים המארחות מעורב בייזום תרגום. שיטה זו היא להתאים בקלות לכל חלבון רצוי נייד או ויראלי.

זיהוי שותפים חלבון אינטראקציה באמצעות טיהור טנדם זיקה

טיהור זיקה של חלבונים מתויגים בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (APMS) היא שיטה רבה עצמה למיפוי השיטתי של רשתות אינטראקצית חלבון ועל חקירת הבסיס המכאני של תהליכים ביולוגיים. כאן, אנו מתארים פפטיד הליך אופטימיזציה רציפת זיקה (SPA) APMS פתח...

זיהוי של קומפלקסי חלבונים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות טיהור זיקת פפטיד סדרתית בשילוב עם טנדם המוני ספקטרומטריית

סרטון זה מדגים קומפלקסים של חלבונים בעלי זירוז חיסוני משותף על קרום PVDF לצורך ניתוח אינטראקציה בין חלבון לחלבון. החלבונים המופחתים מקומפלקסים טופלו בטריפסין כדי לבקע את החלבונים הבודדים בפפטידים הקטנים יותר, ולאחר מכן, שאר הפפטידים הופקו מקרום PVDF. הפפטיד הנמשך שמקורו בשני החלבונים בקומפלקס יובש והושעה מחדש בריכוז נמוך של חומצה פורמית לניתוח נוסף.

עיכול חלבונים על הממברנה להכנת חלבונים בעלי קו-אימונוזיקציה למחקרי אינטראקציה

גישת יוכימיים מתוארת לזהות באינטראקציות vivo חלבונים (PPI) של חלבונים בממברנה. השיטה משלבת צלב המקשר חלבון, טיהור זיקה וספקטרומטריית מסה, וניתנת להתאמה כמעט לכל סוג תא או האורגניזם. עם גישה זו, גם זיהוי של PPI החולף הופך לאפשרי.

קרום עמוד שדרה: ביוכימית כלי לזיהוי חלבונים אינטראקציות של חלבונים בממברנה בVivo

כאן אנו מתארים פרוטוקולים לשבש בתאי יונקים ידי כרסום מצב מוצק בטמפרטורה קריוגני, לייצר תמצית התא מן אבקת התא וכתוצאה מכך, ולבודד קומפלקסים חלבונים של עניין על ידי לכידת זיקה על חרוזים פאראמגנטיים בקנה מידה מיקרון מצמידים נוגדנים.

לכידת חלבון זיקה מורכבת מ בתאי יונקי Cryomilled

אנו מתארים פרוטוקול גילוי של דטרגנט רגיש אינטראקציות בין חלבונים ממברנה איגוד של הקולטן מיון, sortilin, כדי luminal הלולאה הראשונה של החלבון טרנספורטר גלוקוז, GLUT4, כדוגמא.

זיהוי של דטרגנט רגיש אינטראקציות בין חלבונים ממברנה

אינטראקציות חלבון-חלבון, חלבון-מטבוליט מכריעים עבור כל פונקציות הסלולר. במסמך זה, אנו מתארים את פרוטוקול המאפשר ניתוח מקביל של אינטראקציות אלה עם חלבון של בחירה. פרוטוקול שלנו היה אופטימיזציה עבור הצמח תרביות תאים, והוא משלב טיהור זיקה עם חלבון מבוסס ספקטרומטר מסה וזיהוי מטבוליט.

2 ב 1: בשלב אחד טיהור זיקה לניתוח מקבילים של חלבון, מתחמי חלבון-מטבוליט

מוצג כאן הוא פרוטוקול לקביעת המצב האוליגומרי של חלבוני קרום המשתמשת במערכת ננו חלקיקים קרום התא המקומי בשילוב עם מיקרוסקופ אלקטרונים.

מערכת חלקיקי קרום התא המקורי לניתוח אינטראקציה של חלבון-חלבון קרום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המאפשר לכידה וזיהוי של אינטראקציות חלבון-חלבון ספציפיות למחלה מתאים ורקמות מקומיות באמצעות בדיקות כימיות וספקטרומטריית מסה. מערכי הנתונים של האינטראקציה המתקבלים מנותחים באמצעות פלטפורמה ייעודית מבוססת אינטרנט כדי לחשוף ליקויים דינמיים ברשת ושינויים במסלול הקשורים למחלות.

מיפוי אינטראקציות חלבון-חלבון לא מתפקדות במחלה

למד טכניקת העיכול האנטי-ממברנה להכנת דגימות לספקטרומטריית מסות ולניתוח אינטראקציות חלבונים. שיטה זו מייעלת את התהליך על ידי ביטול הצורך באלקטרופורזה בג'ל פוליאקרילאמיד.

הערכה של אינטראקציות חלבונים-חלבונים באמצעות טכניקת העיכול האנטי-ממברנה

גלה סרטונים נוספים