הדמיה של מיקרוסקופיה ואנדופלזמית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים באור ונפח

טכניקת מיקרוסקופ אלקטרונים נפחית זו משמשת לביצוע מחקרים ביולוגיים הדורשים תצפית של מבנה תלת-מימדי. מציע מוט, תצוגת שדה ואחסון לדוגמה לפני שהתמונה תחזור. Fx2 Asan תכנן את שלבי הנתיב הממזמזמים את הדיבילציה כדי להגדיל את בדיקת האלקטרונים של מבני המטרה ונועץ להשתמש בהם כדי לאתר יעד מסוים של עניין.

חלקיקים אלה משלבים את השימוש באור מאכל ובטכניקת מיקרוסקופ אלקטרונים תלת-מיתת כדי לחקור את האינטראקציות בין אורגנים ממברניים לתאים מארחים. 16 עד 24 שעות לאחר ההמרה, לשטוף בעדינות את התרבות עם 250 microliters של 30 עד 37 מעלות צלזיוס פתרון קיבוע. החלפת שטיפה במהירות עם 1.5 מיליליטר של פתרון קיבוע טרי, ומניחים את התרבות על הקרח במשך 30 דקות.

בסוף הדגירה, לשטוף את התאים עם שלוש עשר דקות שוטף במיליליטר אחד של קר כקרח 0.1 מאגר נתרן קאודילאט טוחן לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, מוסיפים מיליליטר אחד של קרח קר 0 עד 4 מעלות צלזיוס 20 מילימולר גליצין פתרון למנה עבור דגירה של עשר דקות על קרח ואחריו שלוש חמש דקות שטיפה עם מיליליטר אחד של טרי, קר 0.1 חיץ נתרן קאודילאט טוחן לכל לשטוף. לאחר מכן, סמן את התאים עם 500 מיקרוליטרים של פתרון DAB שהוכן טרי.

ולהידגר את התאים על קרח במשך כחמש עד ארבעים וחמש דקות. כאשר כתם חום בהיר נראה תחת מיקרוסקופ אור הפוך, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של טרי, קר 0.1 מאגר נתרן קאודילאט טוחן במשך עשר דקות לכל לשטוף. לאחר מכן, השתמש במיקרוסקופ הפוך ניגודיות פאזה כדי לדמיין את ויטראז' ה- DAB בהגדלה של פי 100 ומעלה ולסמן את תחתית הזכוכית שבה ממוקם אזור העניין.

להכנת דגימת בלוק מיקרוסקופ אלקטרונים, תחילה לאחר לתקן את התאים עם מיליליטר אחד של 2% מופחת osmium tetroxide במשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס. בסוף קיבעון, לשטוף את התאים עם שלוש שטיפות חמש דקות ומיליליטר אחד של מים מזוקקים טריים לכל לשטוף. לפני הטיפול בתאים עם מיליליטר אחד של פתרון TCH מסונן במשך 20 דקות.

בסוף הדגירה, לשטוף את התאים שלוש פעמים במים מזוקקים כפי שהוכח רק ולתקן את התאים עם דגירה של 30 דקות ב 2% מופחת osmium tetroxide. בסוף קיבעון השני, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם מים מזוקקים לכסות את התרבות עם מיליליטר אחד של אצטט 1%uranyl מימית לילה ב 4 מעלות צלזיוס מוגן מפני אור. למחרת בבוקר, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם מים מזוקקים לפני הכתם עם מיליליטר אחד של 60 מעלות צלזיוס חימם את הפתרון אספרטט עופרת של וולטון במשך 30 דקות בתנור 60 מעלות צלזיוס.

בסוף הדגירה, לשטוף את התאים שלוש פעמים במים מזוקקים. ותדגירה את התרבות בסדרה מדורגת של 20 דקות 2 מיליליטר אתנול aliquots. לאחר החשיפה האחרונה של 100%אתנול, הדגירה את התאים במשך 30 דקות במיליליטר אחד של שלושה עד אחד אתנול צמיגות נמוכה הטממעת תערובת בינונית בטמפרטורת החדר.

בסוף הדגירה, להחליף את המדיום עם מיליליטר אחד של אתנול אחד לאחד כדי צמיגות נמוכה הטממעת תערובת בינונית עוד 30 דקות דגירה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, החלף את המדיום עם מילטר אחד של אתנול אחד עד שלושה צמיגות נמוכה הטממעת תערובת בינונית במשך 30 דקות נוספות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, החלף את המדיום עם מיליליטר אחד של 100% צמיגות נמוכה הטבעה בינונית לילה, ואחריו הטבעה של המדגם ב 100% צמיגות נמוכה להטמיע תערובת במשך 24 שעות ב 60 מעלות צלזיוס.

לניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים שידור, למחרת, להשתמש microtome אולטרה כדי להשיג 90 ננומטר עבה חלקים ולצפות ברשת תחת מיקרוסקופ אלקטרונים שידור ב 200 קילו-וולט. לפני תחילת הכנת המדגם, נקי אינדיום בדיל אוקסיד מצופה כיסויי זכוכית עם תסיסה עדינה isopropanol במשך 30 עד 60 שניות. בסוף התסיסה, לנקז את האלכוהול העודף ולמקום את coverslips בסביבה ללא אבק.

כאשר הכיסויים יבשים, השתמש במעיל פלזמה כדי לזהור את הכיסויים למשך דקה אחת. לאחר מכן הכנס את הכיסויים למחזיק המצע והנח את מחזיק המצע בסירת הסכין. כדי להשיג דגימות לסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים, הכנס את בלוק הדגימה המוטבע למחזיק הדגימה של האולטרה-מיקרוטום.

ולהגדיר את המחזיק לתוך בלוק גיזום. השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך את שרף עודף סביב מיקום היעד, כך הפנים של הבלוק רוכש צורה טרפז או מלבני. הקצוות המובילים והנגררים צריכים להיות מקבילים לחלוטין זה לזה.

זה לא קל לרכוש מספר גדול של חלקים סידוריים. עם זאת, אתה צריך את הקצוות המובילים ואת הקצוות נגרר מקביל לחלוטין. לאחר מכן, הכנס את מחזיק הדגימה לזרוע האולטרה-מיקרוטום.

מניחים את סכין היהלום במחזיק הסכין וממלאים את סירת הסכינים במים מזוקקים מסוננים. לאחר מכן, לחץ בזהירות על ידית המחזיק כדי להתאים את מיקום המוביל כך שקצה הכיסויים יהיה קרוב לסכין. לאחר קבלת הדגימה, לעצור את תהליך ההקטעה, לאט לפתוח את בורג ההידוק של הצינור לנקז את סירת המים.

לאחר השלמת תהליך איסוף רצועת הכלים, הסר את המצע באמצעות נקודת האחיזה של התקן ההידוק וייבש את רצועת הכלים. השימוש בפלסמידים מתויגים גנטית המבטאים חלבונים מעניינים, מאפשר זיהוי של תאי היעד המעודפים לאחר הכתמת החלבונים המתויגים. לאחר מכן ניתן להשתמש במיקרוסקופ אלקטרונים אור מאכל כדי לדמיין עוד יותר את תרבות התא המסומן.

לדוגמה, הכתם הכהה שנוצר על ידי SCO1-APEX2 נצפה אך ורק בחלל המיטוכונדריאלי הבין-ממברנה ולא בחלל המטריצה של המיטוכונדריה. פלסמידים של קוד מפוספס עם פלסמידים של SCO1-APEX2 ו-HRP-KDEL מבטאים אות אלקטרונים צפוף מאוד במרחב המיטוכונדריאלי הבין-ממברני וברשת האנדופלסמית. עם זאת, אין כתמי רטיקוליום אנדופלזמי הוא ציין בתאים כי הם מגולפים עם SCO1-APEX2 בלבד.

להדמיה סדרתית על ידי סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים, סקירה כללית של תמונת המערך כולה נוצרת באמצעות גלאי אלקטרונים אחורי על פני שטח גדול. לאחר מכן, אזור העניין ממוקם במקטע הראשון ומופצת לכל המקטעים האחרים. לבסוף, אזור העניין המכיל חמישה תאי יעד הוא בתמונה עם חמישה ננומטר פיקסלים בתמונה.

ההגדלה חושפת מבנים תת-תאיים מפורטים כגון מנגנון גולגי, מיטוכונדריה ומרטיקוליום אנדפולסמי. הדמיה סדרתית מגלה בבירור כי מגעי ריקולום-מיטוכונדריה אנדופלזמית מתרחשים במישורי z שונים. אתה צריך הבנה טובה של איך לאתר מבנה יעד ספציפי באמצעות אור בקורלטיבי מיקרוסקופ אלקטרונים כדי לחקור את ההשפעות של שינוי זהות ספציפי.

טכניקות מכתים אלה בשילוב עם מיקרוסקופ אלקטרונים נפח יכול לשמש EM בקנה מידה גדול יותר כדי לחקור אינטראקציות הסלולר במיוחד eurovirus. זכור את glutaraldehyde, גם enteterocide ו TCH הם רעילים מאוד, כדי להיות בטוח ללבוש בגדים מגן ולעבוד ברדס אדים בעת שימוש בחומרים אלה.