Name: המשך הדגירה של האינטראקציה התחרותית בין vibrio פישרי מבודד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: חקור מנגנוני תחרות בין זני Vibrio fischeri בשיטת תרבית מעורבת. הפרוטוקול משתמש בפלסמידים יציבים עם גני עמידות לאנטיביוטיקה וחלבונים פלורסצנטיים להבחנה ויזואלית בין זני החיידקים השונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוני להודות לבודקים על המשוב המועיל שלהם. A.N.S. היתה נתמכת על ידי קרן גורדון ובטי מור באמצעות גרנט GBMF 255.03 לקרן המחקר למדעי החיים.

<ol><li>Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+competition%3A+surviving+and+thriving+in+the+microbial+jungle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 15-25 (2010).</li>
<li>Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+winnowing%3A+establishing+the+squid-Vibrio+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis.</a> Nature Reviews Microbiology. 2 (8), 632-642 (2004).</li>
<li>Dörr, N. C. D., Blockesh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+type+VI+secretion+system+facilitates+niche+domination%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Bacterial type VI secretion system facilitates niche domination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 8855-8857 (2018).</li>
<li>Maclntyre, D. L., Miyata, S. T., Kitaoka, M., Pukatzki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Vibrio+cholerae+type+VI+secretion+system+displays+antimicrobial+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The Vibrio cholerae type VI secretion system displays antimicrobial properties.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19520-19524 (2010).</li>
<li>Salomon, D., Gonzalez, H., Updegraff, B. L., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrio+parahaemolyticus+type+VI+secretion+system+1+is+activated+in+marine+conditions+to+target+bacteria%2C+and+is+differentially+regulated+from+system+2%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Vibrio parahaemolyticus type VI secretion system 1 is activated in marine conditions to target bacteria, and is differentially regulated from system 2.</a> PloS One. 8 (4), e61086(2013).</li>
<li>Sana, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+Typhimurium+utilizes+a+T6SS-mediated+antibacterial+weapon+to+establish+in+the+host+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Salmonella Typhimurium utilizes a T6SS-mediated antibacterial weapon to establish in the host gut.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), E5044-E5051 (2016).</li>
<li>Schwarz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burkholderia+type+VI+secretion+systems+have+distinct+roles+in+eukaryotic+and+bacterial+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Burkholderia type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions.</a> PLoS Pathogens. 6 (8), e1001068(2010).</li>
<li>Wenren, L. M., Sullivan, N. L., Cardarelli, L., Septer, A. N., Gibbs, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+independent+pathways+for+self-recognition+in+Proteus+mirabilis+are+linked+by+type+VI-dependent+export%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Two independent pathways for self-recognition in Proteus mirabilis are linked by type VI-dependent export.</a> MBio. 4 (4), (2013).</li>
<li>García-Bayona, L., Guo, M. S., Laub, M. T. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact-dependent+killing+by+Caulobacter+crescentus+via+cell+surface-associated%2C+glycine+zipper+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Contact-dependent killing by Caulobacter crescentus via cell surface-associated, glycine zipper proteins.</a> Elife. 6, 24869(2017).</li>
<li>Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifaceted+interfaces+of+bacterial+competition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bacteriology%22%5BJournal%5D)">Multifaceted interfaces of bacterial competition.</a> Journal of bacteriology. 198 (16), 2145-2155 (2016).</li>
<li>Cornforth, D. M., Foster, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotics+and+the+art+of+bacterial+war%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Antibiotics and the art of bacterial war.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 10827-10828 (2015).</li>
<li>Shank, E. A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+developments+in+microbial+interspecies+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">New developments in microbial interspecies signaling.</a> Current Opinion in Microbiology. 12 (2), 205-214 (2009).</li>
<li>Roelofs, K. G., Coyne, M. J., Gentyala, R. R., Chatzidaki-Livanis, M., Comstock, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteroidales+secreted+antimicrobial+proteins+target+surface+molecules+necessary+for+gut+colonization+and+mediate+competition+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Bacteroidales secreted antimicrobial proteins target surface molecules necessary for gut colonization and mediate competition in vivo.</a> MBio. 7 (4), e01055-e01016 (2016).</li>
<li>Dey, A., Vassallo, C. N., Conklin, A. C., Pathak, D. T., Troselj, V., Wall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sibling+rivalry+in+Myxococcus+xanthus+is+mediated+by+kin+recognition+and+a+polyploid+prophage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bacteriology%22%5BJournal%5D)">Sibling rivalry in Myxococcus xanthus is mediated by kin recognition and a polyploid prophage.</a> Journal of bacteriology. 198 (6), (2016).</li>
<li>Danka, E. S., Garcia, E. C., Cotter, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+CDI+systems+multicolored%2C+facultative%2C+helping+greenbeards%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Are CDI systems multicolored, facultative, helping greenbeards?</a> Trends in Microbiology. 25 (5), 391-401 (2017).</li>
<li>Willett, J. L., Ruhe, Z. C., Coulding, C. W., Low, D. A., Hayes, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact-dependent+growth+inhibition+%28CDI%29+and+CdiB%2FCdiA+two-partner+secretion+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Contact-dependent growth inhibition (CDI) and CdiB/CdiA two-partner secretion proteins.</a> Journal of molecular biology. 427 (23), 3754-3765 (2015).</li>
<li>Cianfanelli, F. R., Monlezun, L., Coulthurst, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aim%2C+load%2C+fire%3A+the+type+VI+secretion+system%2C+a+bacterial+nanoweapon%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Aim, load, fire: the type VI secretion system, a bacterial nanoweapon.</a> Trends in Microbiology. 24 (1), 51-62 (2016).</li>
<li>Joshi, A., Kostiuk, B., Rogers, A., Teschler, J., Pukatzki, S., Yildiz, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rules+of+engagement%3A+the+type+VI+secretion+system+in+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">Rules of engagement: the type VI secretion system in Vibrio cholerae.</a> Trends in microbiology. 25 (4), 267-279 (2017).</li>
<li>Speare, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+symbionts+use+a+type+VI+secretion+system+to+eliminate+competitors+in+their+natural+host%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Bacterial symbionts use a type VI secretion system to eliminate competitors in their natural host.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), E8528-E8537 (2018).</li>
<li>Shank, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+coculture+to+detect+chemically+mediated+interspecies+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).</li>
<li>Long, R. A., Rowley, D. C., Zamora, E., Liu, J., Bartlett, D. H., Azam, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+interactions+among+marine+bacteria+impede+the+proliferation+of+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Antagonistic interactions among marine bacteria impede the proliferation of Vibrio cholerae.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71 (12), 8531-8536 (2005).</li>
<li>Dunn, A. K., Millikan, D. S., Adin, D. M., Bose, J. L., Stabb, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+rfp-and+pES213-derived+tools+for+analyzing+symbiotic+Vibrio+fischeri+reveal+patterns+of+infection+and+lux+expression+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">New rfp-and pES213-derived tools for analyzing symbiotic Vibrio fischeri reveal patterns of infection and lux expression in situ.</a> Applied and Environmental Microbiology. 72 (1), 802-810 (2006).</li>
<li>Sana, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+second+type+VI+secretion+system+of+Pseudomonas+aeruginosa+strain+PAO1+is+regulated+by+quorum+sensing+and+Fur+and+modulates+internalization+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The second type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa strain PAO1 is regulated by quorum sensing and Fur and modulates internalization in epithelial cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 27095-27105 (2012).</li>
<li>Bachmann, V., Kostiuk, B., Unterweger, D., Diaz-Satizabal, L., Ogg, S., Pukatzki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+salts+modulate+the+mucin-activated+type+VI+secretion+system+of+pandemic+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS%22%5BJournal%5D)">Bile salts modulate the mucin-activated type VI secretion system of pandemic Vibrio cholerae.</a> PLoS. 9 (8), e0004031(2015).</li>
<li>Ishikawa, T., Rompikuntal, P. K., Lindmark, B., Milton, D. L., Wai, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quorum+sensing+regulation+of+the+two+hcp+alleles+in+Vibrio+cholerae+O1+strains%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Quorum sensing regulation of the two hcp alleles in Vibrio cholerae O1 strains.</a> PloS One. 4 (8), e6734(2009).</li>
<li>Ishikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathoadaptive+conditional+regulation+of+the+type+VI+secretion+system+in+Vibrio+cholerae+O1+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Pathoadaptive conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio cholerae O1 strains.</a> Infection and immunity. 80 (2), 575-584 (2012).</li>
<li>Pollack-Berti, A., Wollenberg, M. S., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+transformation+of+Vibrio+fischeri+requires+tfoX+and+tfoY%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Natural transformation of Vibrio fischeri requires tfoX and tfoY.</a> Environmental Microbiology. 12 (8), 2302-2311 (2010).</li>
<li>Meibom, K. L., Blockesh, M., Dolganov, N. A., Wu, C. Y., Schoolnik, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitin+induces+natural+competence+in+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae.</a> Science. 310 (5755), 1824-1827 (2005).</li>
<li>Borgeaud, S., Metzger, L. C., Scrignari, T., Blockesh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+type+VI+secretion+system+of+Vibrio+cholerae+fosters+horizontal+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The type VI secretion system of Vibrio cholerae fosters horizontal gene transfer.</a> Science. 347 (6217), 63-67 (2015).</li>
<li>Townsley, L., Mangus, M. P. S., Mehic, S., Yildiz, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+Vibrio+cholerae+to+low-temperature+shift%3A+CpsV+regulates+type+VI+secretion%2C+biofilm+formation%2C+and+association+with+zooplankton%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Response of Vibrio cholerae to low-temperature shift: CpsV regulates type VI secretion, biofilm formation, and association with zooplankton.</a> Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 00807-00816 (2016).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+and+conditional+regulation+of+the+type+VI+secretion+system+in+Vibrio+fluvialis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">Functional characterization and conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio fluvialis.</a> Frontiers in microbiology. 8, 528(2017).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

שיטת הדגירה שתוארה לעיל מספקת שיטה רבת-עוצמה לגילוי תחרות בין-חיידקית. גישה זו אפשרה לזיהוי של התחרות התוך ספציפי בין V. פישרי מבודד ואפיון של מנגנון תחרותי19. למרות השיטה שתוארה היה אופטימיזציה עבור החיידק הימי V. פישרי, זה יכול להיות שונה בקלות כדי להכיל מינים חיידקיים אחרים, כולל מבודד קליני וסביבתי. חשוב לציין כי מנגנונים תחרותיים לעתים קרובות מוסדר מותנה5,6,23,<sup class=...

כתב יד זה מתאר שיטה מבוססת-תרבות כדי לקבוע אם שני מבודד חיידקי מסוגלים לאינטראקציות תחרותיות. כאשר לומדים אוכלוסיות מעורבות, חשוב להעריך את המידה שבה החיידק מבודד את האינטראקציה, במיוחד אם מבודד מתחרים ישירות באמצעות מנגנוני הפרעה. תחרות ההפרעות מתייחסת לאינטראקציות שבהן אוכלוסיה אחת מעכבת באופן ישיר את הצמיחה או הורגת אוכלוסיית מתחרה1. אינטראקציות אלה חשובות לזיהוי מכיוון שהן יכולות להיות בעלת השפעה מעמיקה על מבנה הקהילה ותפקודו של מיקרוביאלית2,3.
מנגנונים לתחרות מיקרוביאלית התגלו באופן נרחב בתוך גנום של חיידקים מסביבות מגוונות, כולל שני מארחים הקשורים וחיידקים חיים חופשיים4,5,6,7, 8,9. מגוון אסטרטגיות תחרות תוארו10,11 כולל מנגנונים המפזרים, כגון כימיקלים בקטרידקים1,12 ו מופרש פפטידים מיקרוביאלית13 , כמו גם מנגנונים תלויי-קשר המחייבים יצירת קשר עם תא תא להעברת מעכבות אפקטור לתאי יעד9,14,15,16,17 ,בן 18
למרות שcoincubations המבוסס על תרבות משתמשים בדרך כלל במיקרוביולוגיה5,8,19, כתב היד הזה מתאר כיצד להשתמש באפשרות לאפיין את מנגנון התחרות, כמו גם הצעות להתאמת הפרוטוקול לשימוש עם מינים חיידקיים אחרים. יתרה מזאת, שיטה זו מתארת גישות מרובות לניתוח ולהצגת הנתונים כדי לענות על שאלות שונות אודות אופי האינטראקציות התחרותיות. למרות הטכניקות המתוארות כאן היו בשימוש בעבר כדי לזהות את מנגנון ההרג הבינקטקטריאלי בבסיס התחרות הפנים מסוים בין זנים שיתופי של חיידקים vibrio פישרי מבודדים19, הם מתאימים מינים חיידקיים רבים, כולל מבודד סביבתי ופתוגנים אנושיים, ויכולים להיות מנוצלים להערכת מנגנונים תחרותיים תלויי-מגע ומפזרים. שלבים בפרוטוקול עשויים לדרוש אופטימיזציה של מינים חיידקיים אחרים. בהינתן כי מערכות מודל יותר מרחיבים את המחקרים שלהם מעבר לשימוש של אורגניזמים איזוגניים לכלול גנוטיפים שונים10,16,20,21, שיטה זו תהיה משאב חשוב לחוקרים המבקשים להבין כיצד התחרות משפיעה על מערכות מרובות זנים או רב מינים.

<table><tbody><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל</td><td>פישר</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; פיפטה</td><td></td><td></td><td></td>רב-ערוצית</tr><tr><td>L 100 &mu; פיפטה</td><td></td><td></td><td></td>רב-ערוצית</tr><tr><td>L 300 &mu; L פיפטה</td><td></td><td></td><td></td>רב-ערוצית</tr><tr><td>10 &mu; L פיפטה</td><td></td><td></td><td></td>חד ערוצית</tr><tr><td>20 &mu; L פיפטה</td><td></td><td></td><td></td>חד ערוצית</tr><tr><td>200 &mu; L פיפטה</td><td></td><td></td><td></td>חד</tr><tr><td>ערוצית 1,000 &mu; צלחות L פיפטה</td><td></td><td></td><td></td>חד ערוץ</tr><tr><td>24 בארות</td><td>פישר</td><td>07-200-84</td><td>סטרילי עם מכסה</td></tr><tr><td>96 בארות</td><td>צלחות VWR</td><td>10062-900</td><td>סטרילי עם מכסה</td></tr><tr><td>מחשבון</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>כלורמפניקול</td><td>סיגמא</td><td>C0378</td><td>מלאי (20 מ"ג/מ"ל באתנול); ריכוז סופי במדיה (2 &mu; g/mL LBS)</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ ניתוח פלואורסצנטי עם מצלמה ותוכנת</td><td></td><td></td><td></td>הדמיה</tr><tr><td>מלקחיים</td><td>פישר</td><td>08-880</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin Sulfate</td><td>Fisher</td><td>BP906-5</td><td>מלאי (100 מ"ג/מ"ל במים, עיקור מסנן); ריכוז סופי במדיה (1 &mu; גרם/מ"ל ליברות)</td></tr><tr><td>ממברנת ניטרוצלולוזה (FS MCE, 25 מ"מ, NS)</td><td>פישר</td><td>SA1J788H5</td><td>0.22 &mu; m קרום ניטרוצלולוזה (pk של 100)</td></tr> <tr><td>צלחות פטרי</td><td>פישר</td><td>FB0875713</td><td>סטרילי עם מכסה</td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>קובטות חצי מיקרו</td><td>VWR</td><td>97000-586</td><td></td></tr><tr><td>TipOne 0.1-10 &mu; L מערכת המתנע</td><td>USA Scientific</td><td>1111-3500</td><td>10 מתלים</td></tr><tr><td>TipOne 200 &mu; מערכת המתנע L</td><td>USA Scientific</td><td>1111-500</td><td>10 מתלים</td></tr><tr><td>TipOne 1000 &mu; L starter system</td><td>USA Scientific</td><td>1111-2520</td><td>10 מתלים</td></tr><tr><td>מערבולת</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td>הערות</td></tr><tr><td>LBS מדיה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris Buffer (pH ~ 7.5)</td><td></td><td></td><td>50 מ"ל 1 מ"ל מאגר מלאי (62 מ"ל HCl, 938 מ"ל DI מים, 121 גרם בסיס Trizma)</td></tr><tr><td>Agar Technical</td><td>Fisher</td><td>DF0812-17-9</td><td>15 גרם (הוסף רק לצלחות)</td></tr><tr><td>DI מים</td><td></td><td></td><td>950 מ"ל</td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>פישר</td><td>S640-3</td><td>20 גרם</td></tr><tr><td>טריפטון</td><td>פישר</td><td>BP97265</td><td>10 גרם</td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>פישר</td><td>BP9727-2</td><td>5 גרם</td></tr></tbody></table>

המשך הדגירה של האינטראקציה התחרותית בין vibrio פישרי מבודד

Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates

כתב יד זה מתאר את היסוד המבוסס על תרבות, הדגירה לגילוי ואפיון של אינטראקציות תחרותיות בין שתי אוכלוסיות בקטריאלי. שיטה זו מעסיקה פלמידים יציבים המאפשרים לכל אוכלוסיה להיות מתויג באופן מובהק עם יכולות עמידות לאנטיביוטיקה ברורים וחלבונים פלורסנט לבחירה ואפליה חזותית של כל אוכלוסיה, בהתאמה. כאן, אנו מתארים את ההכנה ואת הדגירה של זנים vibrio פישרי מתחרה, הדמיה מיקרוסקופית פלואורסצנטית, וניתוח נתונים כמותיים. גישה זו פשוטה, התשואות תוצאות מהירות, וניתן להשתמש בה כדי לקבוע אם אוכלוסיה אחת הורגת או מעכבת את התפתחותם של אוכלוסיה אחרת, ואם התחרות מתווכת באמצעות מולקולה מפועלת או מחייבת מגע ישיר לתא הנייד. מכיוון שכל אוכלוסיית חיידקים מבטאת חלבון פלורסנט שונה, האבחנה מאפשרת אפליה מרחבית של אוכלוסיות מתחרות בתוך מושבה מעורבת. למרות השיטות המתוארות מתבצעות עם חיידק סימביוטי V. פישרי באמצעות התנאים אופטימיזציה עבור מין זה, הפרוטוקול יכול להיות מותאם לבודד בקטריאלי ביותר הניתנים לשימוש.

על מנת להעריך את האינטראקציות התחרותיות בין אוכלוסיות בקטריאליות, פרוטוקול שיטת הדגירה פותח וממוטב עבור V. פישרי. שיטה זו משתמשת פלמידים יציבים לקודד גנים עמידות לאנטיביוטיקה וחלבונים פלורסנט, המאפשר בחירה דיפרנציאלית ואפליה חזותית של כל זן. על-ידי ניתוח הנתונים שנאספו מתוך שיטת הדגירה, ניתן לזהות את התוצאה התחרותית של אינטראקציה ומנגנון האינטראקציה. כדוגמה, הניסויים הבאים בוצעו באמצעות V. פישרי בבודד. זנים מודדתיים המתעמדים אחד משני פלמיונים יציבים: pVSV102 ביטוי התנגדו...

חיידקים לקודד מנגנונים שונים לעוסקים בתחרות הבינחיידקית. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המבוסס על תרבות לאפיון אינטראקציות תחרותיות בין מבודד חיידקי וכיצד הם משפיעים על המבנה המרחבי של אוכלוסיה מעורבת.

This manuscript describes a culture-based, coincubation assay for detecting and characterizing competitive interactions between two bacterial populations. ...

הפרוטוקול שלנו מספק גישה פשוטה אך איתנה לזיהוי ואפיון מנגנונים תחרותיים בין זנים שונים של חיידקי Vibrio fischeri. שיטה זו משתמשת בפלסמידים יציבים המקודדים גנים שונים של עמידות לאנטיביוטיקה וחלבונים פלואורסצנטיים המאפשרים בחירה דיפרנציאלית ואפליה חזותית של כל זן חיידקי בתרבות מעורבת. כדי להתחיל, להשתמש קיסם סטרילי כדי לגרד את התאים מצלחת אגר בגודל של גרגר אורז.תן שימוש חוזר בתאים בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר המכיל מיליליטר אחד של מרק LBS. כדי לשבור את גושי התאים, לחץ עליהם לצד הצינור ולאחר מכן פיפטה למעלה ולמטה במרץ. סגור את הצינור והמערבולת למשך דקה עד שתי שניות וחזור על הפעולה אם גושי התאים עדיין גלויים עד שהדגימה אחידה מבחינה חזותית.חזור על שלבי הכנה אלה מגרד תאים למערבולת עבור כל הדגימות. למדוד ולתזמן את הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר עבור כל הדגימות. כדי להשיג מדידת OD מדויקת, לדלל את הדגימות עד פי 10 באמצעות מרק LBS.לאחר מכן לנרמל כל מדגם OD 600 הרצוי. כדי לערבב את זן הייחוס ואת זן המתחרה ביחס של אחד לאחד, הוסף 100 מיקרוליטרים של כל זן מנורמל ל- OD 1.0 לצינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר ומערבולת למשך דקה עד שתי שניות. כפקד, מערבבים את זן הייחוס עם גרסה מתויגת באופן דיפרנציאלי של עצמו ומערבולת גם כן.זה קריטי כדי להשיג את יחס ההתחלה הנכון כפי שהוא יכול לשנות במידה ניכרת את התוצאה של הניסוי. כדי להבטיח הצלחה, צעד זה עשוי לדרוש אופטימיזציה עבור מין חיידקי נתון. לאחר חזרה על שלב זה עבור כל שכפול ביולוגי, צריכים להיות ארבעה שכפולים ביולוגיים עם זנים התייחסות מתויגים באופן דיפרנציאלי כמו פקדים וארבעה שכפולים ביולוגיים עם התייחסות מתויגת דיפרנציאלית וזנים מתחרים.כדי ליצור כתמי תרבות שישמשו למיקרוסקופיה פלואורסצנטית לאחר הדגירה, הוסיפו 10 מיקרוליטרים של כל פקד ותערובת ניסיונית על צלחת פטרי המכילה אגר LBS. לאחר שהנקודות התייבשו לחלוטין על הספסל, הדגירה את הצלחות ב 24 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. כדי להפוך כתמי תרבות שישמש לכימות המושבה להרכיב יחידות עבור כל זן בסוף הניסוי, להוסיף 10 microliters של כל שליטה תערובות ניסיוני לתוך 24 צלחות גם המכיל מיליליטר אחד של אגר LBS לגם.לאחר שהנקודות התייבשו לחלוטין, הדגירה את הצלחות ב 24 מעלות צלזיוס במשך חמש שעות. כדי לבצע דילול סדרתי של תערובות מטבע התחלתיות, סובב צלחת 96 בארות ב- 90 מעלות כך שיהיו שמונה עמודות ו- 12 שורות. סמן כל שורה בתווית עם מזהה המתח, מספר השכפול והשעה המתחילה באפס t.סמן את צלחות אגר LBS בתוספת אנטיביוטיקה המתאימה שבו לזהות את סדרת דילול תוך הקפדה לזהות איזה זן כל צלחת אנטיביוטית בוחרת. עם פיפטה מרובת ערוצים, הוסיפו 180 מיקרוליטרים של מרק LBS לכל באר והשאירו את העמודה הראשונה ריקה לתערובת המטבעות הלא מזוהה. באמצעות פיפטה ערוץ יחיד 200 מיקרוליטר, להעביר 100 microliters של תערובת coincubation מן הצינור לתוך הטוב הראשון של העמודה הראשונה, ולאחר מכן להשליך את הקצה ולחזור על כל תערובות מטבע.עם פיפטה מרובת ערוצים, העבר 20 מיקרוליטרים מעמודה אחת לעמודה 2 ו- pipette למעלה ולמטה כדי לערבב. השלך את העצות וחזור על כל עמודה תוך שמירה על עקביות עם מספר הצינורות למעלה ולמטה עבור כל דילול. עד הסוף, כל שורה תכיל דילול סדרתי של התערובת הראשונית פי 10.השתמש פיפטה רב ערוצי מצויד שמונה טיפים כדי לשאיף חמישה microliters מכל באר בסדרת דילול נקודה על צלחת אגר LBS בתוספת Kanamycin שבוחר עבור זן הייחוס. חזור על שלב זה כדי לבחור עבור המתח המתחרה איתור על צלחת משלימה Chloramphenicol. לאחר שהנקודות התייבשו לחלוטין, מניחים את הצלחות באינקובטור ב 24 מעלות צלזיוס.לאחר כתמי המטבע ו -24 צלחות באר כבר דגירה במשך חמש שעות ב 24 מעלות צלזיוס, להוסיף מיליליטר אחד של מרק LBS לכל באר. התן מחדש על-ידי צינור למעלה ולמטה עד שכל התאים יתווספו מחדש בהתאם למרץ שבו התאים יתווספו מחדש על-פני כל השכפולים. לאחר כל נקודה coincubation הוא resuspended, להכין צלחת 96 גם עבור דילול סדרתי צלחות אגר LBS עם אנטיביוטיקה המתאימה שבו לזהות את הדילול באותו אופן כמו שנעשה בעבר.כדי להשלים את הדילול הסדרתי עבור מדידות t סופיות ב 24 צלחות באר, לבצע שלבים המשמשים לדילול סדרתי של inoculum ההתחלה ולמקום כל דילול על צלחות אגר LBS כפי שנעשה בעבר. המשך בהדמיית כתמי המטבע על לוחות פטרי וניתוח נתונים כמתואר בכתב היד. בטיפול הניסיוני, זן הייחוס והמתחרה נמצאים בשיעור של 0.5 בתחילת הניסוי ובסוףו בהתאם לטיפול הבקרה.ערכי יומן RCI לא היו שונים סטטיסטית מאפס לטיפול הבקרה או כאשר זן הייחוס היה דגירה עם זן מתחרה אחד. נתונים אלה מצביעים על כך שלא הייתה תחרות בין זן הייחוס למתח המתחרה. לעומת זאת, כאשר זן הייחוס היה דגירה עם זן המתחרה 2, זן הייחוס ירד משיעור של 0.5 בהתחלה לחלק פחות מ 0.01 בסוף הניסוי.יתר על כן, ערכי RCI יומן היו גדולים משמעותית מאפס כאשר זן הייחוס היה דגירה עם זן מתחרה 2. יחד, נתונים אלה מצביעים על כך ששיעור זן הייחוס ירד בנוכחות זן מתחרה שני המצביע על תחרות בין הזנים. כאשר זן הייחוס היה דגירה עם זן מתחרה אחד, CFUs של שני הזנים גדל במהלך חמש שעות ולא היו שונים באופן משמעותי רומז כי לא התרחשה תחרות.כמו כן, נצפתה התאוששות של כ-3200%, שלא הייתה שונה סטטיסטית מהבקרה. עם זאת, כאשר זן הייחוס היה דגירה עם זן המתחרה 2, CFUs זן התייחסות היו נמוכים באופן משמעותי מאשר זן שני CFUs בפקד בחמש שעות. כמו כן, כ-4% התאוששות נצפתה נמוכה משמעותית מהבקרה.בסך הכל, נתונים אלה מצביעים על כך שזן 2 החוצה התחרה זן הייחוס על ידי הריגת התאים שלה. הצעד החשוב ביותר בהליך זה הוא השגת יחס ההתחלה הנכון כפי שהוא יכול להשפיע באופן משמעותי על התוצאות.

coincubation-assay-for-quantifying-competitive-interactions-between

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מקור: Speare, L., et al. בדיקת חממת מטבעות לכימות אינטראקציות תחרותיות בין מבודדי Vibrio fischeri . J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים בדיקת דגירה משותפת המשמשת לחקר האופן שבו זני חיידקים מתחרים בסביבה משותפת. הוא מיושם באופן נרחב במיקרוביולוגיה כדי לזהות מנגנונים, כגון הרג תלוי מגע או הרג שאינו תלוי במגע, המניעים אינטראקציות אלה.

בדיקת חממת מטבעות לחקר אינטראקציות תחרותיות בין זני חיידקים

מקור: ברומפילד, ק. ד. ואחרים. טכניקות מעבדה המשמשות לשימור והבחנה בין ביוטיפים של ויבריו כולרה לבידוד קליני וסביבתי. J. Vis. Exp. (2017)סרטון זה מדגים מבחן אגר רך המשתמש בכלוריד טריפנילטטרזוליום להערכת והשוואת תנועתיות זני ויבריו כולרה על ידי המחשת פעילות מטבולית דרך יצירת אזור אדום סביב תאים נודדים באופן פעיל.

מבחן תנועתיות להשוואת זני ויבריו כולרה באמצעות טריפנילטרזוליום כלוריד

מקור: ברומפילד, ק. ד. ואחרים, טכניקות מעבדה המשמשות לשימור והבחנה בין ביוטיפים של ויבריו כולרה לבידוד קליני וסביבתי. J. Vis. Exp. (2017).הסרטון הזה מדגים את מבחן ווגס-פרוסקאואר (VP) להבחנה בין שלושה ביוטיפים של ויבריו כולרה: קלאסי, אל טור מסוג פראי, וגרסה של אל טור. כל תרבית מחוננת לתוך מדיום המכיל גלוקוז, מודגרת ומטופלת ב-α-נפתול ואשלגן הידרוקסיד כדי לזהות נוכחות אצטואין. צבע ורוד-אדום, המצביע על תגובת VP חיובית, נצפה רק בביוטיפ El Tor מסוג פראי, מה שמבדיל אותו מהסוגים הקלאסיים והווריאנטים.

מבחן ווגס-פרוסקאואר להבדלת ביוטיפים של ויבריו כולרה

מקור: נג, ד. ואחרים. כימות קולוניזציה ושלשול של ויבריו כולרה במודל דגי זברה בוגרים. J. Vis. Exp. (2018)הסרטון הזה מדגים פרוטוקול לכימות העומס החיידקי במעיים בדגי זברה בוגרים שנדבקו בזן עמיד לאנטיביוטיקה של Vibrio cholerae. לאחר המתת חסד ונתיחה, מערכת העיכול מבודדת, מתאחדת עם חרוזי זכוכית, ומעובדת לשחרור החיידקים. ההומוגנט המתקבל מצופה על מדיום סלקטיבי, ומושבות בצבע כחול המבטאות β-גלקטוזידאז נספרות כדי להעריך את נטל החיידקים.

כימות עומס חיידקים במעי בדגי זברה הנגועים ב-Vibrio cholerae

סרטון זה מדגים שיטה מבוססת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית לחקר תחרות חיידקים ברמת התא הבודד. שיטה זו מספקת תובנות לגבי המבנה והתפקוד של קהילות חיידקים.

בדיקת דגירה משותפת של חיידקים: טכניקה מבוססת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לדמיין תחרות חיידקית תוך ספציפית ברמת התא הבודד

אנו מתארים assay איכותי לפקח תחרות חיידקים מתווכת על...

Assay חזותי לפקח תחרות קטריאלי T6SS בתיווך

התקשרות חיידקית לתאי מארח היא שלב מפתח במהלך קולוניזציה וזיהום של המארח. פרוטוקול זה מתאר את הייצור של הידבקויות רקומביננטיות מצומדות פולימר כחומרים ביומימטיים המאפשרים ניתוח של תרומתם של הידבקויות בודדות לתהליכים אלה, ללא תלות בגורמים חיידקיים אחרים.

חומרי Biomimetic לאפיין אינטראקציות חיידקים-מארח

איתור ובידוד של מיני ויבריו רלוונטיים מבחינה קלינית דורשים אמצעי תרבית סלקטיביים ודיפרנציאליים. מחקר זה העריך את יכולתו של מדיום כרומוגני חדש לזהות ולזהות V. parahaemolyticus ומינים קשורים אחרים. נמצא כי למדיום החדש יש רגישות וסגוליות טובות יותר מהמדיום הקונבנציונלי.

פיתוח בינוני אגר chromogenic רגיש וספציפי יותר לצורך זיהוי של<em&gt; Parahaemolyticus Vibrio</em&gt; ו אחר<em&gt; Vibrio</em&gt; מינים

כתב יד זה מתאר ראוי Vibrio cholerae טכניקות תחזוקה בנוסף סדרה של מבחני ביוכימי, מנוצל קולקטיבית עבור הבחנה מהירה ואמינה בין קליני וסביבתי V. ביו-טיפוסים של כולרה במעבדה.

טכניקות מעבדה המשמשות לשמירה על ביו-טיפוסים של<em&gt; ויבריו כולרה</em&gt; בידוד קליני ואיכותי

כתב יד זה מתאר שיטה לשימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית חד-תאית כדי לדמיין ולתמת תחרות חיידקים בקוקולטורה.

כימות של תחרות בין-בקטריאלית באמצעות הדמיית פלואורסצנטיות חד-תאית

חקור מנגנוני תחרות בין זני Vibrio fischeri בשיטת תרבית מעורבת. הפרוטוקול משתמש בפלסמידים יציבים עם גני עמידות לאנטיביוטיקה וחלבונים פלורסצנטיים להבחנה ויזואלית בין זני החיידקים השונים.

המשך הדגירה של האינטראקציה התחרותית בין vibrio פישרי מבודד

גלה סרטונים נוספים