Name: שימוש באלמנט Alu המכיל מיני-גנים לניתוח Rnas מעגלית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: למד שיטה ליצירת RNA מעגלי באמצעות מיני-גנים המכילים אלמנטים Alu. הפרוטוקול משלב שיבוט, טרנספקציה ו-RT-PCR לניתוח תפקוד וקשר למחלות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי משרד ההגנה משרד הביטחון מענק AZ180075. סטפן סטאם, תודה לז של ז'קלין נונן אנה פאולוצ'ין נתמכת על ידי ה-DAAD, התוכנית האקדמית הגרמנית, ג'סטין R. Welden היה מקבל את הפרס של אוניברסיטת קנטקי מקס סטקלר.

<ol><li>Jeck, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNAs+are+abundant%2C+conserved%2C+and+associated+with+ALU+repeats%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats.</a> RNA. 19 (2), 141-157 (2013).</li>
<li>Zhang, X. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+sequence-mediated+exon+circularization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Complementary sequence-mediated exon circularization.</a> Cell. 159 (1), 134-147 (2014).</li>
<li>Deininger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alu+elements%3A+know+the+SINEs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Alu elements: know the SINEs.</a> Genome Biology. 12 (12), 236(2011).</li>
<li>Bazak, L., Levanon, E. Y., Eisenberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+Alu+editability%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of Alu editability.</a> Nucleic Acids Research. 42 (11), 6876-6884 (2014).</li>
<li>Levanon, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+abundant+A-to-I+editing+sites+in+the+human+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of abundant A-to-I editing sites in the human transcriptome.</a> Nature Biotechnology. 22 (8), 1001-1005 (2004).</li>
<li>Hansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+RNA+circles+function+as+efficient+microRNA+sponges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges.</a> Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).</li>
<li>Kelly, S., Greenman, C., Cook, P. R., Papantonis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon+Skipping+Is+Correlated+with+Exon+Circularization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Exon Skipping Is Correlated with Exon Circularization.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (15), 2414-2417 (2015).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon-intron+circular+RNAs+regulate+transcription+in+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+translation+of+circular+RNAs+driven+by+N%286%29-methyladenosine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Extensive translation of circular RNAs driven by N(6)-methyladenosine.</a> Cell Research. 27 (6), 626-641 (2017).</li>
<li>Abe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rolling+Circle+Translation+of+Circular+RNA+in+Living+Human+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Rolling Circle Translation of Circular RNA in Living Human Cells.</a> Scientific Reports. 5, 16435(2015).</li>
<li>Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type+specific+features+of+circular+RNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Cell-type specific features of circular RNA expression.</a> PLOS Genetics. 9 (9), 1003777(2013).</li>
<li>Ottesen, E. W., Luo, D., Seo, J., Singh, N. N., Singh, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Survival+Motor+Neuron+genes+generate+a+vast+repertoire+of+circular+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Human Survival Motor Neuron genes generate a vast repertoire of circular RNAs.</a> Nucleic Acids Research. 47 (6), 2884-2905 (2019).</li>
<li>Stoss, O., Stoilov, P., Hartmann, A. M., Nayler, O., Stamm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vivo+minigene+approach+to+analyze+tissue-specific+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Protocols%22%5BJournal%5D)">The in vivo minigene approach to analyze tissue-specific splicing.</a> Brain Research Protocols. 4, 383-394 (1999).</li>
<li>Mardon, H. J., Sebastio, G., Baralle, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+exon+sequences+in+alternative+splicing+of+the+human+fibronectin+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A role for exon sequences in alternative splicing of the human fibronectin gene.</a> Nucleic Acids Research. 15, 7725-7733 (1987).</li>
<li>Gaildrat, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+splicing+reporter+minigene+assay+to+evaluate+the+effect+on+splicing+of+unclassified+genetic+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Use of splicing reporter minigene assay to evaluate the effect on splicing of unclassified genetic variants.</a> Methods in Molecular Biology. 653, 249-257 (2010).</li>
<li>Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+minigene+systems+to+dissect+alternative+splicing+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements.</a> Methods. 37 (4), 331-340 (2005).</li>
<li>Baralle, D., Baralle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+in+action%3A+assessing+disease+causing+sequence+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Splicing in action: assessing disease causing sequence changes.</a> Journal of Medical Genetics. 42 (10), 737-748 (2005).</li>
<li>Percifield, R., Murphy, D., Stoilov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medium+throughput+analysis+of+alternative+splicing+by+fluorescently+labeled+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Medium throughput analysis of alternative splicing by fluorescently labeled RT-PCR.</a> Methods in Molecular Biology. 1126, 299-313 (2014).</li>
<li>Stoilov, P., Lin, C. H., Damoiseaux, R., Nikolic, J., Black, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+screening+strategy+identifies+cardiotonic+steroids+as+alternative+splicing+modulators%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A high-throughput screening strategy identifies cardiotonic steroids as alternative splicing modulators.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (32), 11218-11223 (2008).</li>
<li>Shen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrvinium+pamoate+changes+alternative+splicing+of+the+serotonin+receptor+2C+by+influencing+its+RNA+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Pyrvinium pamoate changes alternative splicing of the serotonin receptor 2C by influencing its RNA structure.</a> Nucleic Acids Research. 41 (6), 3819-3832 (2013).</li>
<li>Noto, J. J., Schmidt, C. A., Matera, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+and+expressing+circular+RNAs+via+tRNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Engineering and expressing circular RNAs via tRNA splicing.</a> RNA Biology. , 1-7 (2017).</li>
<li>Schmidt, C. A., Noto, J. J., Filonov, G. S., Matera, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+Expressing+and+Imaging+Abundant%2C+Stable%2C+Circular+RNAs+In+Vivo+Using+tRNA+Splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">A Method for Expressing and Imaging Abundant, Stable, Circular RNAs In Vivo Using tRNA Splicing.</a> Methods in Enzymology. 572, 215-236 (2016).</li>
<li>Welden, J. R., van Doorn, J., Nelson, P. T., Stamm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+MAPT+locus+generates+circular+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+Basis+of+Disease%22%5BJournal%5D)">The human MAPT locus generates circular RNAs.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. , 2753-2760 (2018).</li>
<li>Casper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+UCSC+Genome+Browser+database%3A+2018+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The UCSC Genome Browser database: 2018 update.</a> Nucleic Acids Research. 46, 762-769 (2018).</li>
<li>Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+plasmid+vectors+expressing+FLAG-tagged+proteins+under+the+regulation+of+human+elongation+factor-1alpha+promoter+using+Gibson+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Generation of plasmid vectors expressing FLAG-tagged proteins under the regulation of human elongation factor-1alpha promoter using Gibson assembly.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+strategy+to+engineer+DNA+polymerases+for+enhanced+processivity+and+improved+performance+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A novel strategy to engineer DNA polymerases for enhanced processivity and improved performance in vitro.</a> Nucleic Acids Research. 32 (3), 1197-1207 (2004).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Conn, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+binding+protein+quaking+regulates+formation+of+circRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The RNA binding protein quaking regulates formation of circRNAs.</a> Cell. 160 (6), 1125-1134 (2015).</li>
<li>Jeck, W. R., Sharpless, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+and+characterizing+circular+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Detecting and characterizing circular RNAs.</a> Nature Biotechnology. 32 (5), 453-461 (2014).</li>
<li>Pamudurti, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+of+CircRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Translation of CircRNAs.</a> Molecular Cell. 66 (1), 9-21 (2017).</li>
<li>Kramer, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+control+of+Drosophila+circular+RNA+expression+by+intronic+repeats%2C+hnRNPs%2C+and+SR+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Combinatorial control of Drosophila circular RNA expression by intronic repeats, hnRNPs, and SR proteins.</a> Genes & Development. 29 (20), 2168-2182 (2015).</li>
<li>Starke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon+circularization+requires+canonical+splice+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Exon circularization requires canonical splice signals.</a> Cell Reports. 10 (1), 103-111 (2015).</li>
<li>Suzuki, H., Tsukahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+view+of+pre-mRNA+splicing+from+RNase+R+resistant+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">A view of pre-mRNA splicing from RNase R resistant RNAs.</a> International Journal of Molecular Sciences. 15 (6), 9331-9342 (2014).</li>
<li>Zhang, X. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+alternative+back-splicing+and+alternative+splicing+landscape+of+circular+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Diverse alternative back-splicing and alternative splicing landscape of circular RNAs.</a> Genome Research. 26 (9), 1277-1287 (2016).</li>
<li>Liang, D., Wilusz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+intronic+repeat+sequences+facilitate+circular+RNA+production%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Short intronic repeat sequences facilitate circular RNA production.</a> Genes & Development. 28 (20), 2233-2247 (2014).</li>
<li>Wang, Y., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+in+physiology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tau in physiology and pathology.</a> Nature Reviews Neuroscience. 17 (1), 5-21 (2016).</li>
<li>Fejes-Toth, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-transcriptional+processing+generates+a+diversity+of+5%27-modified+long+and+short+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Post-transcriptional processing generates a diversity of 5'-modified long and short RNAs.</a> Nature. 457 (7232), 1028-1032 (2009).</li>
<li>Gao, Q. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+regulation+of+tau+exon+10%2C+whose+missplicing+causes+frontotemporal+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Complex regulation of tau exon 10, whose missplicing causes frontotemporal dementia.</a> Journal of Neurochemistry. 74 (2), 490-500 (2000).</li>
<li>Hartmann, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+alternative+splicing+of+human+tau+exon+10+by+phosphorylation+of+splicing+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regulation of alternative splicing of human tau exon 10 by phosphorylation of splicing factors.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 18 (1), 80-90 (2001).</li>
<li>Wang, Y., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+backsplicing+produces+translatable+circular+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Efficient backsplicing produces translatable circular mRNAs.</a> RNA. 21 (2), 172-179 (2015).</li>
<li>Yang, Y., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+GFP-Based+Reporter+to+Study+Back+Splicing+and+Translation+of+Circular+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Constructing GFP-Based Reporter to Study Back Splicing and Translation of Circular RNA.</a> Methods in Molecular Biology. 1724, 107-118 (2018).</li>
<li>Zheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNA+profiling+reveals+an+abundant+circHIPK3+that+regulates+cell+growth+by+sponging+multiple+miRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs.</a> Nature Communications. 7, 11215(2016).</li>
<li>Jia, W., Xu, B., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNA+expression+profiles+of+mouse+ovaries+during+postnatal+development+and+the+function+of+circular+RNA+epidermal+growth+factor+receptor+in+granulosa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolism%22%5BJournal%5D)">Circular RNA expression profiles of mouse ovaries during postnatal development and the function of circular RNA epidermal growth factor receptor in granulosa cells.</a> Metabolism. 85, 192-204 (2018).</li>
<li>Liang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Output+of+Protein-Coding+Genes+Shifts+to+Circular+RNAs+When+the+Pre-mRNA+Processing+Machinery+Is+Limiting%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The Output of Protein-Coding Genes Shifts to Circular RNAs When the Pre-mRNA Processing Machinery Is Limiting.</a> Molecular Cell. 68 (5), 940-954 (2017).</li>
<li>Legnini, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circ-ZNF609+Is+a+Circular+RNA+that+Can+Be+Translated+and+Functions+in+Myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis.</a> Molecular Cell. 66 (1), 22-37 (2017).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+circRNA+Biogenesis+and+Function+with+NF90%2FNF110+in+Viral+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Coordinated circRNA Biogenesis and Function with NF90/NF110 in Viral Infection.</a> Molecular Cell. 67 (2), 214-227 (2017).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Biogenesis+of+Nascent+Circular+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The Biogenesis of Nascent Circular RNAs.</a> Cell Reports. 15 (3), 611-624 (2016).</li>
</ol>

. אין מה לגלות

באופן כללי, RNAs מעגלית נמוך1שופע, אשר מסבך את המחקר של התפקוד שלהם ואת המבנה. בדומה RNAs ליניארי13, השימוש של מיניגנים הכתב מאפשר זיהוי של העמים וגורמים טרנס משחק המסדירים את היווצרות rnas מעגלית. לפיכך, גישה זו יוצרת השערות שניתן לבחון עוד יותר באמצעות הגנים האנדוגניים.
הצעד הקריטי ביותר הוא העיצוב של הגן של העיתונאי. ההרכבה האנזימטית של שברי הדנ א ("שיבוט גיבסון"27) מקלה על עיצוב זה, שכן היא מאפשרת בנייה של גנים כתבת גד...

RNAs מעגלית RNAs מעגלית (circRNAs) הם סגורים בודד שנתקע יחיד RNAs אשר מבוטא ברוב האורגניזמים. הם מופקים על ידי הצטרפות במטה 5 ' אחוי אתר לאתר במעלה 3 ' אחוי, תהליך הנקרא שחבור חזרה (איור 1א)1. רצפים של pre-mRNA כי התערוכה בסיס משלימה קצר כמו 30-40 nt להביא החזרה האתר ליישור הנכון עבור מערך circRNA2. בבני אדם, Alu אלמנטס1, המייצג כ -11% של הגנום3, טופס נרחב כפול תקוע מבנים RNA ב pre-mrna בשל העצמיות העצמית שלהם4,5 ובכך לקדם את היווצרות circrnas1.
כיום תוארו שלוש פונקציות עיקריות של circRNAs. חלק מהמעגלי האיגוד מסוג circRNAs (miRNAs) ובאמצעות קיבוע על לפעול כמו ספוגים Mirnas6. באמצעות תחרות עם שחבור ליניארי7 או אפנון של פעילות שעתוק8, היתה מעורב ביניהם מעורבים. לבסוף, מכילים circrnas מסגרות קריאה פתוחות קצרות והוכחת מחקרים עקרוניים מראים כי ניתן לתרגמו9,10. עם זאת, התפקוד של רוב הcircrnas נשאר באופן חידתי. רוב RNAs מעגלית זוהו באמצעות שיטות רצף הדור הבא11. ניתוחים מפורטים של גנים בודדים באמצעות ממוקדות RT-PCR גישות לגלות כי מספר גדול של RNAs מעגלית נשאר להתגלות12.
שימוש בגנים של כתבת לניתוח עיבוד טרום-mRNA ניתוח mRNA נגזר המבנה כתב DNA בנייה לתוך תאים היא שיטה מבוססת היטב כדי ללמוד אלטרנטיבה טרום mRNA שחבור, אשר ניתן להחיל על RNAs מעגלית. באופן כללי, האקסוקה החלופית, האינטרוטונים המקיפים אותה, והרחבות הקונסטיטוטיביות מושוכגות לתוך וקטור ביטוי של איקריוטית. לעתים קרובות, האינטרונים מקוצרים. המבנים מנותחים לתאי איקריוטית ומנותח בדרך כלל על ידי RT-PCR13,14. גישה זו הייתה בשימוש נרחב כדי למפות את האזורים הרגולטורים וגורמי משחק בניסויים שיתוף פעולה13,15,16,17,18. בנוסף, הדור של ביטוי חלבון מיני גנים מותר להקרנה של חומרים המשנים שחבור חלופיים19,20.
השיטה הוחלה על RNAs מעגלית. כיום, לפחות 12 מיניגנים לאחור תוארו בספרות ומסוכמים בטבלה 1. למעט מערכת trna ביטוי מבוסס21,22, הם כולם תלויים פולימראז השני היזמים. כאן, אנו מתארים שיטה ליצור מיני העיתונאי האנושי כדי לקבוע את הגורמים העמים והטרנס משחק מעורב בדור של RNAs מעגלית. מבט כולל על השיטה באמצעות רצפים של העיתונאי שפורסם גן23 מוצג באיור 1.

<table><tbody><tr><td>(PEI) Hydrochloride</td><td>Polysciences</td><td>24765-1</td><td></td></tr><tr><td>כלי בונה</td><td>NEB</td><td></td><td><a href="https://nebuilder.neb.com/#!/" target="_blank">https://nebuilder.neb.com/#!/</a></td></tr><tr><td>Dark Reader Transilluminator.</td>ערכת הרכבה DNA אנזימטי <td>של קלייר מחקר</td><td></td><td></td></tr> כימי <tr><td></td><td>NEB</td><td>E2621S</td><td></td></tr><tr><td>ערכת ניקוי ג'ל ו-PCR</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>גליקו כחול</td><td>תרמו פישר</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1 אתר שיבוט</td><td>אתר</td><td></td> <td>שיבוט<a href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf" target="_blank">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf</a></td></tr><tr><td>Polymerase 1</td><td>NEB</td><td>M0491L</td><td>Q5 DNA פולימראז</td></tr><tr><td>פולימראז 2</td><td>Biorad</td><td>1725310</td><td>פולימראז לטווח ארוך (NEB), iproof (BioRad)</td></tr><tr><td>פולימראז 2</td><td>Qiagen</td><td>206402</td><td>ערכת פולימראז לטווח ארוך Qiagen</td></tr><tr><td>Reverse Transcriptase</td><td>Thermo Fisher</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בידוד RNA</td><td>Life Technologies</td><td>12183025</td><td>Ambion by Life Technologies</td></tr><tr><td>RNAse R</td><td>Lucigen</td><td>RNR07250</td><td>Epicenter/Lucigen</td></tr><tr><td>תאים מוכשרים יציבים</td><td>NEB</td><td>C3040H</td><td>NEB תאים יציבים</td></tr><tr><td>שיבוט סטנדרטיים</td><td>NEB</td><td>C2988J</td><td>NEB5-alpha</td></tr><tr><td>כלי אינטרנט מוכשר לעיצוב פריימרים</td><td>NEB</td><td></td><td><a href="https://nebuilder.neb.com/#!/" target="_blank">https://nebuilder.neb.com/#!/</a></td></tr><tr><td>חישובי טמפרטורה מבוססי אינטרנט</td><td>NEB</td><td></td><td><a href="https://tmcalculator.neb.com/#!/main" target="_blank">https://tmcalculator.neb.com/#!/main</a></td></tr></tbody></table>

שימוש באלמנט alu המכיל מיני-גנים לניתוח rnas מעגלית

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

בנוסף mrnas ליניארי, הרבה גנים איקריוטית ליצור rnas מעגלית. מרבית ה-RNAs המעגלי מופקים על-ידי הצטרפות לאתר של 5 ' אחוי עם אתר אחוי במעלה 3 ' בתוך מקדם-mRNA, תהליך הנקרא שחבור חזרה. מעגליות זה עשוי לסייע על ידי מבנים משניים ב-pre-mRNA המביאים את האחוטים לקרבת מקומות. בגנים האנושיים, alu אלמנטס נחשבים לקידום אלה מבנים RNA משני, כמו alu אלמנטס הם שופע בסיס התצוגה משלימה אחד עם השני כאשר נוכח הכיוונים הנגדיים ב pre-mrna. כאן, אנו מתארים את הדור ואת הניתוח של גדול, Alu אלמנט המכיל גנים עיתונאי היוצרים rnas מעגלית. באמצעות אופטימיזציה של פרוטוקולי שיבוט, גנים עיתונאי עם עד 20 kb אורך להוסיף ניתן ליצור. הניתוח שלהם בניסויים מאפשר זיהוי של גורמי רגולציה. כך, שיטה זו יכולה לזהות רצפי RNA ורכיבים סלולריים המעורבים במערך RNA מעגלי.

גנים עיתונאי לאפשר נחישות של גורמים הרגולציה המשפיעים על היווצרות RNA מעגלי. עם זאת, גנים כתבת אלה הם גדולים ומכילים אלמנטים חוזרים כי לעתים קרובות לעשות בנייה DNA לא יציב. בשל גודלם הגדול, לעתים קרובות יש צורך למחוק חלקים של introns, אשר מושגת על ידי הגברה של חתיכות גנומית המכילה exons וחלקים קטנים האגפים. אלה יצירות DNA התאספו באמצעות אנזימטי, המאפשר בנייה ללא אנזימים הגבלה.
הדוגמה של RNA מעגלי שנוצר מתוך מיקרוכדורית טאו החלבון המשויך (MAPT) מראה יישום של הגישה minigene לנתח RNAs מעגלית. הטא...

אנחנו לשכפל ולנתח גנים עיתונאי יצירת RNAs מעגלית. גנים כתבת אלה גדולים יותר מאשר בנייה כדי לנתח שחבור ליניארי ולהכיל Alu אלמנטס. כדי לחקור את RNAs מעגלית, המבנים הם מנותחים לתוך תאים וכתוצאה מכך RNA מנותח באמצעות RT-PCR לאחר הסרת RNA ליניארי.

שימוש באלמנט Alu המכיל מיני-גנים לניתוח Rnas מעגלית

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

פרוטוקול זה הוא משמעותי מכיוון שהוא מאפשר למשתמש ליצור מערכת ביטוי גנומי שיכולה לעבור ש splicing חלופי במקרה זה טופס RNAs מעגלי שניתן לבדוק עבור הפונקציה שלהם שיוך המחלה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא תסלול את הדרך לאחרים להשתמש בפרוטוקול זה בביולוגיה מולקולרית ובשכפול כאשר לומדים ש splicing חלופי בהיווצרות RNA מעגלית ותפקוד. העצה שלי למישהו מנסה טכניקה זו בפעם הראשונה יהיה לייעל את תנאי PCR.הפעל מעברי צבע או בצע PCR טאצ'דאון עם טמפרטורות חישול שונות ושהיות הרחבה. בדרך כלל שברים ארוכים יותר מעל שישה KB יאריכו KB אחד לכל מחזור ויהיה צורך לבדוק טמפרטורות חישול שונות להגברה הטובה ביותר. הדגמה של שיטה זו היא קריטית כי זה ייתן למשתמשים ייצוג חזותי טוב יותר של ההיבטים הקשים יותר של ההליך במיוחד הדור של פריימרים.כדי להתחיל בהליך זה, לטעון את דפדפן הגנום UCSC ולהשתמש בו כדי לזהות אלמנטים חוזרים ונשנים הדרושים להיווצרות RNA מעגלית ולשלב אותם לתוך המבנים. חשוב לציין, פריימרים להגברה צריכים להיות מחוץ ליסודות החוזרים על עצמם. הדבק את רצף ה- RNA המעגלי בחיפוש BLAT האנושי ובחר את האורגניזם הנכון.שלח את הרצף, עבור לתצוגת הדפדפן והגדל את 1.5 תזמנות הזמן או לפי הצורך. לאחר מכן, עכבר מעל האלמנטים החוזרים על עצמם כדי לזהות את תת-הטיפוס שלהם בחלון צף. אלמנטים אלו נמצאים בקו סינוס.השתמש בלחצן רצ

use-of-alu-element-containing-minigenes-to-analyze-circular-rnas

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

ליניארי הגברה בתיווך (לאם)-PCR היא שיטה שפותחה כדי לזהות את העמדות של שילוב וקטורים ויראליים בגנום המדויקות. הטכניקה התפתחה להיות השיטה מעולה ללמוד דינמיקה משובט בחולי ריפוי גנטי, בטיחות ביולוגית של טכנולוגיות חדישות וקטורית, גיוון תא T, מודלים תא גזע סרטני, וכו '...

ליניארי ההגברה המתווכת PCR - לוקליזציה של אלמנטים גנטיים ואפיון ידוע האיגוף DNA

סרטון זה מציג את השלבים הבסיסיים לביצוע ניתוח טרנסקריפטום שלם על דגימות חוט שדרה עוברי של אפרוח מנותח לאחר טרנספקציה עם אלקטרופורציה בביצית.

RNA-Seq ניתוח של ביטוי הגנים בדיפרנציאל חוט השדרה Electroporated אפרוח עוברי

מאמר זה מציג שיטה רגישה הנקראת Circle-Seq לטיהור DNA מעגלי חוץ-כרומוזומלי (eccDNA). השיטה כוללת טיהור עמודות, הסרת ה-DNA הכרומוזומלי הליניארי שנותר, הגברת מעגל מתגלגל ורצף תפוקה גבוהה. Circle-Seq ישים לסינון בקנה מידה גנומי של eccDNA איקריוטי ולחקר חוסר יציבות הגנום ושונות במספר העתק.

טיהור הגנום כולו של DNA המעגל extrachromosomal מתאי איקריוטיים

שני שונים 3' מהירה הגברה של הקצוות cDNA (3' מירוץ) פרוטוקולים שתואר כאן הופכים את השימוש של שני polymerases דנ א שונים כדי למפות רצפים הכוללים קטע של מסגרת קריאה פתוחה (ORF) על stop codon, את כולה 3' UTR של תעתיק באמצעות ה-RNA להשיג שורות תאים סרטן שונים.

התאמת 3' הגברה מהירה של CDNA מסתיים למפות תעתיקים של סרטן

הדור הבא רצפי (הגדרות) הוא כלי רב עוצמה עבור אפיון גנומית זה מוגבל על ידי שיעור שגיאה גבוהה של פלטפורמת (~0.5–2.0%). אנו מתארים את השיטות שלנו של רצף שגיאות המאפשרים לנו במחלקותיכם שיעור שגיאה המיתרים, לזהות מוטציות ב- variant אלל שברים כמו שנדיר למצוא 0.0001.

אירוע נדיר איתור שגיאות DNA ו RNA רצף

הזיהוי של האינטראקציות פיזי בין גנים לבין אלמנטים התקינה הוא מאתגר אבל כבר בהנחייתם של כרומוזום קונפורמציה ללכידת שיטות. שינוי זה בפרוטוקול 4C-seq מפחית את הסיכון של ה-PCR הטיה על-ידי צמצום יתר הגברה של תבניות ה-PCR ומגדיל את mappability את הקריאות על-ידי שילוב צעד תקציר של אנזים הגבלה תוספת.

זיהוי תפוקה גבוהה של ג'ין רצפים תקינה באמצעות רצף הדור הבא של כרומוזום מעגלי קונפורמציה ללכוד (4C-seq)

RNAs מעגלית (circRNAs) הם RNAs שאינם מצפינה לקידוד שעשויים להיות בעלי תפקידים ברגולציה ובניהול אינטראקציות מדיה בין חלבונים. בעקבות הערכה של פרמטרים שונים לבניית ספריות רצף circRNA, פרוטוקול הושלם באמצעות הכנה נטוש הכולל הספריה RNA עם RNase R טרום טיפול והוא מוצג כאן.

זיהוי של RNAs מעגלית באמצעות רצפי RNA

פרוטוקול זה מציג כלי מהיר ושימושי להערכת תפקידו של חלבון עם פונקציה לא אופיינית בוויסות חיבור חלופי לאחר טיפול כימותרפי.

שימוש בכלי המיני-דג'ן E1A לחקר שינויי ההסתבכות של mRNA

ריצוף RNA לכימות מוחלט (AQRNA-seq) היא טכנולוגיה שפותחה כדי לכמת את הנוף של כל הרנ"א הקטן בתערובות ביולוגיות. כאן, הן שלבי הכנת הספרייה והן שלבי עיבוד הנתונים של AQRNA-seq מודגמים, המכמתים שינויים במאגר RNA העברה (tRNA) ב- Mycobacterium bovis BCG במהלך תרדמה הנגרמת מרעב.

AQRNA-seq לכימות רנ"א קטן

ננו-מכונות מבוססות DNAzyme יכולות לשמש לזיהוי סלקטיבי ורגיש ביותר של חומצות גרעין. מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט לתכנון ננו-מכונות מבוססות DNAzyme עם ליבה של 10-23 המשתמשות בתוכנה חופשית ויישומן בזיהוי מקטע וירוס אפשטיין-בר כדוגמה.

DNAzyme 10-23 - ננו-מכונות מבוססות לזיהוי חומצות גרעין

למד שיטה ליצירת RNA מעגלי באמצעות מיני-גנים המכילים אלמנטים Alu. הפרוטוקול משלב שיבוט, טרנספקציה ו-RT-PCR לניתוח תפקוד וקשר למחלות.

שימוש באלמנט Alu המכיל מיני-גנים לניתוח Rnas מעגלית

גלה סרטונים נוספים