Name: הוספת תוויות של כלי דם במוח Teleost ואת בלוטת היותרת שימוש בפרזיה לב עם DiI-fixative (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-13T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: למדו פרזיה לבית עם DiI-fixative לתיוג כלי דם במוח ובלוטת היותרת של דגי Teleost. שיטה זו, המבוססת על מודל Oryzias latipes, מאפשרת חקר אנטומיה וסקולרית וקשרים בין תאים עצביים או אנדוקריניים לכלי דם ביעילות ובמהירות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד ר שינג קאנדה להדגמה של מיזוג לב עם פתרון מתואם במיאקה, גברת לאורדז קארב ג'י טאן לקבלת עזרה בנוגע לטיפול בצדקה, ומר אנתוני פלטייר לאיורים. עבודה זו ממומנת על ידי NMBU ועל ידי מועצת המחקר של נורבגיה, גרנט מספר 248828 (התוכנית הדיגיטלית נורווגיה).

כל הטיפול בבעלי חיים התבצע על פי המלצות הטיפול והרווחה של בעלי חיים מחקריים באוניברסיטה הנורבגית למדעי החיים, ותחת פיקוחו של חוקרים מוסמכים.
1. הכנת המכשירים והפתרונות
<ol><li>להכין פתרון מלאי DiI המסת 5 מ"ג של קריסטל DiI ב 1.5 mL שפופרת פלסטיק עם 1 מ ל של 96% אטוח. מערבולת עבור 30 ולהמשיך לכסות באמצעות רדיד אלומיניום. הערה: פתרון המניה DiI ניתן לשימור בחשיכה ב-20 ° c במשך מספר חודשים.</li>
	<li>הכן את מחזיק הדגים (איור 1א) על-ידי גזירה של פוליסטירן לאורך של 5 ס מ, רוחב 3 ס"מ, ו-2 ס מ עובי, ומדביק אותו לצלחת פלסטיק בקוטר 9 ס מ. הפוך חור בצורת סירה בגודל 3 ס מ עם להב אזמל בפוליסטירן.</li>
	<li>הכן מערכת מבשם (איור 2) על-ידי הוספת צינורית פלסטיק באורך 30-50 ס מ בקצה המחט.</li>
	<li>הכינו 40 mL של טרי 4% הפתרון פאראפורמלדהיד (בתחתית) על ידי דילול 10 מ ל של 16% בתחתית עם 30 מ ל של פוספט באגירה תמיסת מלח (PBS) בצינור פלסטיק 50 mL.</li>
	<li>הכינו 10 מ ל של פתרון fixative/DiI על ידי דילול 1 מ ל של פתרון מלאי DiI ב 9 מ ל של טרי מוכן 4% כלטין בצינור פלסטיק 10 mL. . שמור באפלה עד השימוש הערה: גבישים DiI כי הם לא מומס ניתן לשמור בצינור פתרון המניה, אתנול חדש ניתן להוסיף כדי להכין פתרון מלאי חדש DiI (ראה שלב 1.1).</li>
	<li>
להכין 50 mL של tricaine (MS-222) מניות.
	<ol>
<li>התמוססות 200 מ"ג של אבקת Tricaine ב 48 מ ל של H2O. Add 2 mL של 1 M בסיס טריס (pH 9). התאם ל-pH 7 עם HCl 1 M וחנות ב-20 ° c.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לדלל 5 מ ל של מלאי Tricaine ב 50 mL של מים נקיים בזכוכית קטנה.</li>
	<li>הכינו מספר ברטט זכוכית בגודל 5 ס מ (איור 2) על ידי מתיחת נימי זכוכית עם פולר פיפטה בעקבות הוראות היצרן.</li>
</ol>2. חיתוך ופרזיה
הערה: למעלה הוא תרכובת הפכפכה רעילה, ולכן יש לבצע את הניתוח והפרזיה במכסה המנוע או בחדר מאוורר, והמשתמש חייב לענוד מסכת גז.
<ol><li>הכינו את כלי החיתוך, כולל מספריים קטנים, ומלקחיים חזקים וחד אחד לפני הניתוח.</li>
	<li>מלאו את המזרק בתמיסה המוכנה של הלגון/DiI על-ידי הצבתו בשפופרת 50 mL ורישום למעלה. ואז הניחו את המחט בצינורית בקצה המזרק (איור 2).</li>
	<li>לתקן את המזרק על הספסל באמצעות כמה פיסות קלטת להציב בכיוונים שונים, להתאים את המיקום של המיקרוסקופ ואת המושב כדי לקבל עמדה טובה לניתוח ולחיצה על המזרק בוכנה (איור 1B). הערה: בפרוטוקול זה, המרפק משמש כדי להקיש את המזרק בוכנה, אבל אפשרויות אחרות ניתן להשתמש, למשל, סיוע מאדם אחר.</li>
	<li>המתת חסד הדג עם מנת יתר של tricaine ידי הצבת הדג בפתרון הכין בשלב 1.7. לחכות 30 s ולבדוק את הרפלקסים של הדג על ידי לתפוס את הפין שלה caudal עם מלקחיים. ניתן להשתמש בדגים כאשר הוא מפסיק להגיב לגירויים.</li>
	<li>מניחים את הדג במחזיק הדג עם הבטן שלו מול ולהצמיד מחט אחת לתוך הקצה של הראש ועוד אחד מעל הזנב כדי לשמור את הדג במקום.</li>
	<li>פתח את הבטן הקדמית עם המספריים על ידי גזירה אופקית של שכבת העור השטחית.</li>
	<li>באמצעות מלקחיים, להסיר את העור מעל הלב עד הגישה ברורה אל החדר ואת הריוסוס בולבוס מסופק (איור 3).</li>
	<li>הוסיפו פיפטה מזכוכית בקצות הקפילר ושוברים את סוף קצהו של פיפטה הזכוכית. הערה: החור של קצה שבור צריך להיות גדול מספיק כדי לאפשר את הנוזל החוצה, אבל עדיין קטן מספיק כדי להיכנס בקלות את הרקמה. ניתן להשתמש בצנרת הזכוכית אם לא נשברה או סתומה.</li>
	<li>הביאו את פיפטה הזכוכית קרוב לחדר והוסיפו לחץ למזרק בוכנה עם המרפק כדי לאלץ את הנוזל לצאת.</li>
	<li>הצמד את חדר הלב עם הצנרת זכוכית תוך הוספת לחץ על המזרק.</li>
	<li>מיד לאחר מכן, נקב venosus סינוס עם מלקחיים כדי לאפשר לדם לעזוב את זרימת הדם. הערה: חדר הלב הופך להיות שברירי יותר בגלל הקיבעון. זה גם הופך להיות פחות אדום כמו הדם הוא מדולל עם פתרון fixative עצמי/DiI.</li>
	<li>מחדר החדר, התאימו את זווית הפיפטה של הזכוכית כדי למצוא את הכניסה של הריוסוס הבולבוס. הביאו את הפיפטה שנפתח בתוך הריויוסוס, כמוצג באיור 2, והוסיפו עוד לחץ למזרק. הערה: הריוסוס הבולבוס הוא שקוף והרקמה גמישה. בעת החלפת דם עם DiI/fixative, הצנרת זכוכית בתוך הלב צריך להיות גלוי יותר על ידי הוספת לחץ, הגודל של בולבוס הריוסוס צריך להתרחב. שלב זה חיוני כדי לוודא כי הלחץ מספיק שימש כדי להחליף את כל הדם עם פתרון fixative/DiI, וכי כל כלי הדם הושגו. לעתים קרובות כאשר מוצלחת, הלבלבין הכפילה מעוררת התכווצויות שרירים הדג יהיה לנוע.</li>
	<li>להמשיך להוסיף לחץ על המזרק עבור 30-60 s עדיין שמירה על הצנרת זכוכית בתוך הריוסוס בולבוס.</li>
	<li>הסירו את הפיפטה מזכוכית. ואת המחטים מהדגים</li>
	<li>מנתחים את המוח ואת בלוטת ההיפופיזה, ורקמות הדגירה ב-4% בכיוון השני ב PBS עבור 2 h בחושך בטמפרטורת החדר. הערה: ניתוח מוחי ובלוטת יותרת המוח בעבר תואר בפירוט בשתי דרכים שונות מאת פונטיין ואח '26 ואגר-Wick ואח '27. בגלל הקיבעון, הרקמה הופכת קשה למדי והקשר שברירי בין המוח לבלוטת יותרת ההיפופיזה עלול להישבר. לאחר הניתוח ניתן גם לבצע עיבוד קיבעון לילה ב -4 ° c.</li>
	<li>שטפו את הרקמה פעמיים ב-PBS במשך 10 דקות לפני ההכנה להדמיה. הערה: לאחר מכן ניתן לטעון את הרקמה בין שקופית לכריכה כיסוי עם מרווחים בין ובין הרכבה בינונית לדימות ממוקד (ראה איור 4), או שנות מנות עם הרטט כמתואר בפירוט בפונטיין ואח '26 לפני ההרכבה בין שקופית ושובר כיסוי לדימות עם stereomicroscope (ראה איור 4).</li>
</ol>

<ol><li>Nishida, N., Yano, H., Nishida, T., Kamura, T., Kojiro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Vascular+Health+and+Risk+Management%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in cancer.</a> Vascular Health and Risk Management. 2 (3), 213-219 (2006).</li>
<li>Simon, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+morphogenesis+and+the+formation+of+vascular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Vascular morphogenesis and the formation of vascular networks.</a> Developmental Cell. 6 (4), 479-482 (2004).</li>
<li>Magistretti, P. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMagistretti%2C+PJ+%22Brain+energy+metabolism+in+Fundamental+neuroscience%22">Brain energy metabolism in Fundamental neuroscience</a>. Zigmond, M., et al. , Academic Press. 389-413 (1999).</li>
<li>Weltzien, F. A., Andersson, E., Andersen, O., Shalchian-Tabrizi, K., Norberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain-pituitary-gonad+axis+in+male+teleosts%2C+with+special+emphasis+on+flatfish+%28Pleuronectiformes%29%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+-+Part+A%3A+Molecular+%26+Integrative+Physiology%22%5BJournal%5D)">The brain-pituitary-gonad axis in male teleosts, with special emphasis on flatfish (Pleuronectiformes).</a> Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Molecular & Integrative Physiology. 137 (3), 447-477 (2004).</li>
<li>Ooi, G. T., Tawadros, N., Escalona, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pituitary+cell+lines+and+their+endocrine+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Pituitary cell lines and their endocrine applications.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 228 (1-2), 1-21 (2004).</li>
<li>Knigge, K. M., Scott, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+the+median+eminence%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Structure and function of the median eminence.</a> American Journal of Anatomy. 129 (2), 223-243 (1970).</li>
<li>Ball, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothalamic+control+of+the+pars+distalis+in+fishes%2C+amphibians%2C+and+reptiles%5BTitle%5D)+AND+%22General+Comparative+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Hypothalamic control of the pars distalis in fishes, amphibians, and reptiles.</a> General Comparative Endocrinology. 44 (2), 135-170 (1981).</li>
<li>Knowles, F., Vollrath, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+contacts+between+neurosecretory+fibres+and+pituicytes+in+the+pituitary+of+the+eel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synaptic contacts between neurosecretory fibres and pituicytes in the pituitary of the eel.</a> Nature. 206 (4989), 1168(1965).</li>
<li>Knowles, F., Vollrath, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosecretory+innervation+of+the+pituitary+of+the+eels+Anguilla+and+Conger+I.+The+structure+and+ultrastructure+of+the+neuro-intermediate+lobe+under+normal+and+experimental+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Neurosecretory innervation of the pituitary of the eels Anguilla and Conger I. The structure and ultrastructure of the neuro-intermediate lobe under normal and experimental conditions.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 250 (768), 311-327 (1966).</li>
<li>Golan, M., Zelinger, E., Zohar, Y., Levavi-Sivan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+GnRH-Gonadotrope-Vasculature+Reveals+a+Dual+Mode+of+Gonadotropin+Regulation+in+Fish%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Architecture of GnRH-Gonadotrope-Vasculature Reveals a Dual Mode of Gonadotropin Regulation in Fish.</a> Endocrinology. 156 (11), 4163-4173 (2015).</li>
<li>Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vascular+anatomy+of+the+developing+zebrafish%3A+an+atlas+of+embryonic+and+early+larval+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development.</a> Developmental Biology. 230 (2), 278-301 (2001).</li>
<li>Cha, Y. R., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+experimental+analysis+of+blood+vessel+formation+using+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+C%3A+Embryo+Today%22%5BJournal%5D)">Visualization and experimental analysis of blood vessel formation using transgenic zebrafish.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 81 (4), 286-296 (2007).</li>
<li>Kamei, M., Isogai, S., Pan, W., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+blood+vessels+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging blood vessels in the zebrafish.</a> Methods Cell Biology. 100, 27-54 (2010).</li>
<li>Wu, E. S., Jacobson, K., Papahadjopoulos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+Diffusion+in+Phospholipid+Multibilayers+Measured+by+Fluorescence+Recovery+after+Photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Lateral Diffusion in Phospholipid Multibilayers Measured by Fluorescence Recovery after Photobleaching.</a> Biochemistry. 16 (17), 3936-3941 (1977).</li>
<li>Schlessinger, J., Axelrod, D., Koppel, D. E., Webb, W. W., Elson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+Transport+of+a+Lipid+Probe+and+Labeled+Proteins+on+a+Cell-Membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lateral Transport of a Lipid Probe and Labeled Proteins on a Cell-Membrane.</a> Science. 195 (4275), 307-309 (1977).</li>
<li>Johnson, M., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+Diffusion+in+Plasma-Membrane+of+Mouse+Egg+Is+Restricted+after+Fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lateral Diffusion in Plasma-Membrane of Mouse Egg Is Restricted after Fertilization.</a> Nature. 272 (5652), 448-450 (1978).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbocyanine+Dye+Orientation+in+Red-Cell+Membrane+Studied+by+Microscopic+Fluorescence+Polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Carbocyanine Dye Orientation in Red-Cell Membrane Studied by Microscopic Fluorescence Polarization.</a> Biophysical Journal. 26 (3), 557-573 (1979).</li>
<li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Carbocyanine+Dyes+Allow+Living+Neurons+of+Identified+Origin+to+Be+Studied+in+Long-Term+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Carbocyanine Dyes Allow Living Neurons of Identified Origin to Be Studied in Long-Term Cultures.</a> Journal of Cell Biology. 103 (1), 171-187 (1986).</li>
<li>Godement, P., Vanselow, J., Thanos, S., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+in+developing+visual+systems+with+a+new+method+of+staining+neurones+and+their+processes+in+fixed+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A study in developing visual systems with a new method of staining neurones and their processes in fixed tissue.</a> Development. 101 (4), 697-713 (1987).</li>
<li>Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde+Fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde Fixation.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).</li>
<li>Puchtler, H., Meloan, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+Chemistry+of+Formaldehyde+Fixation+and+Its+Effects+on+Immunohistochemical+Reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">On the Chemistry of Formaldehyde Fixation and Its Effects on Immunohistochemical Reactions.</a> Histochemistry. 82 (3), 201-204 (1985).</li>
<li>Hoetelmans, R. W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+acetone%2C+methanol%2C+or+paraformaldehyde+on+cellular+structure%2C+visualized+by+reflection+contrast+microscopy+and+transmission+and+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Immunohistochemistry+%26+Molecular+Morphology%22%5BJournal%5D)">Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy.</a> Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).</li>
<li>Hobro, A. J., Smith, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+fixation+methods%3A+Spatial+and+compositional+cellular+changes+observed+by+Raman+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Vibrational+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging.</a> Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).</li>
<li>Li, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+labeling+and+visualization+of+blood+vessels+with+lipophilic+carbocyanine+dye+DiI%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI.</a> Nature Protocols. 3 (11), 1703-1708 (2008).</li>
<li>Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medaka--a+model+organism+from+the+far+East%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Genetic%22%5BJournal%5D)">Medaka--a model organism from the far East.</a> Nature Review Genetic. 3 (1), 53-64 (2002).</li>
<li>Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Healthy+Brain-pituitary+Slices+for+Electrophysiological+Investigations+of+Pituitary+Cells+in+Teleost+Fish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments%22%5BJournal%5D)">Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish.</a> Journal of Visual Experiments. (138), 57790(2018).</li>
<li>Ager-Wick, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+a+High-quality+Primary+Cell+Culture+from+Fish+Pituitaries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries.</a> Journal of Visual Experiments. (138), 58159(2018).</li>
<li>Hildahl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+tracing+of+luteinizing+hormone+beta-subunit+gene+expression+using+green+fluorescent+protein+transgenic+medaka+%28Oryzias+latipes%29+reveals+a+putative+novel+developmental+function%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Developmental tracing of luteinizing hormone beta-subunit gene expression using green fluorescent protein transgenic medaka (Oryzias latipes) reveals a putative novel developmental function.</a> Developmental Dynamics. 241 (11), 1665-1677 (2012).</li>
<li>Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-level+3D+visualization+API+for+Java+and+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ.</a> BMC Bioinformatics. 11, 274(2010).</li>
<li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dil+and+diO%3A+versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends Neurosciences. 12 (9), 333-335 (1989).</li>
<li>Fontaine, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+Neurons+Controlling+Anterior+Pituitary+Functions%3A+Anatomy+and+Ontogenesis+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic Neurons Controlling Anterior Pituitary Functions: Anatomy and Ontogenesis in Zebrafish.</a> Endocrinology. 156 (8), 2934-2948 (2015).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף

הפרזיה לב עם DiI בעבר השתמשו כדי לתייג כלי דם במספר מיני דגם24, כולל teleost דגים13.
כפי dii מועברת ישירות קרום התא אנדותל על ידי זלוף ב vasculature ניתן להגדיל את היחס אות אל הרעש על ידי הגברת ריכוז dii בפתרון הקבע. בנוסף, fluorophore מספק מכתים אינטנסיבי כאשר מתרגש עם הלבנת מינימלי המאפשר פליטה יחסית ארוכת טווח18,30. כמו כן, התיוג יכול להישאר במשך מספר ימים ולשמש בשילוב עם טכ...

כלי הדם משחקים חלק חיוני של הגוף בעלי החוליות כפי שהם מספקים את החומרים המזינים הדרושים, חמצן ואותות הורמונליים לכל האיברים. גם, מאז התגלית של המעורבות שלהם בפיתוח סרטן1, הם קיבלו הרבה תשומת לב במחקר קליני. למרות שמספר פרסומים חקרו את המנגנונים המאפשרים צמיחה של כלי דם ומורפולגנזה, ומספר רב של גנים חשובים להיווצרות שלהם זוהו2, הרבה נשאר להבין בקשר לאינטראקציה בין תאים או רקמות לדם מחזורי.
, ויזואליזציה של דם ובלוטת יותרת המוח. זה חשוב נוירונים במוח דורשים אספקת גבוהה של חמצן וגלוקוז3, ואת בלוטת ההיפופיזה מכיל עד שמונה סוגי תאים חשובים הורמון מייצר המשתמשות זרימת הדם כדי לקבל אות מהמוח ולשלוח הורמונים שלהם שונים איברים היקפיים4,5. בעוד ביונקים, מערכת הפורטל בבסיס של ההיפותלמוס בשם הוד רוממותו, מקשרת את המוח ואת בלוטת ההיפופיזה6, כגון גשר דם ברור לא תוארה ב teleost דגים. אכן, ב teleosts, preoptico-הנוירונים היפוטתלמי ישירות פרויקט אקסונים שלהם לתוך pars נרבוזה של בלוטת יותרת7 ובעיקר innervate סוגי תאים האנדוקרינית שונים ישירות8,9. עם זאת, כמה נוירונים אלה יש קצות העצבים שלהם ממוקם בחלל extravascular, בקרבת מקום נימים בדם10. לכן, ההבדל בין הדגים teleost ויונקים הוא לא כל כך ברור, ואת הקשר בין הדם ובדיקת המוח ואת התאים בלוטת ההיפופיזה דורש חקירה גדולה יותר של הדגים teleost.
Zebrafish יש, בהיבטים רבים, מערכת כלי דם המקבילה מבחינה אנטומית ופונקציונלית למינים אחרים בעלי חוליות11. זה הפך למודל בעלי חוליות רב עוצמה עבור מחקר לב וכלי דם בעיקר בזכות הפיתוח של קווים טרנסגניים מספר שבו מרכיבים של מערכת כלי הדם מסומנים עם חלבונים כתבת פלורסנט12. עם זאת, אנטומיה מדויקת של מערכת הדם עשויה להשתנות בין מינים, או אפילו בין שני אנשים השייכים לאותו מינים. לכן, הדמיה של כלי הדם עשויה להיות בעלת עניין רב גם במינים אחרים של teleost שבהם כלים טרנסגנזה אינם קיימים.
מספר טכניקות תוארו לתייג כלי דם בשני היונקים והטלאוסטים. אלה כוללים היברידיזציה באתרו עבור גנים ספציפיים ואסילטורה, כתמים הזרחן אלקליין, microangiography, וזריקות צבע (עבור סקירה ראה13). ליפולי פלורסנט indocarbocyanine צבען (dii) השתמשו לראשונה כדי ללמוד ממברנה לאורך ניידות לרוחב כפי שהוא נשמר bilayers ליפיד והוא יכול להעביר דרך זה14,15,16. ואכן, מולקולה של DiI מורכבת משתי שרשראות פחמנים וכרומואופהורס. בעוד שרשראות פחממים לשלב את קרום התא bilayer השומנים של התאים במגע עם זה, ראשון להישאר על פני השטח שלה17. פעם אחת בקרום, מולקולות DiI לפזר בתוך השומנים bilayer שעוזר להכתים מבנים ממברנה כי הם לא במגע ישיר עם פתרון DiI. הזרקת פתרון DiI דרך הפרזיה לב, ולכן מתייג את כל תאי האנדותל במגע עם התרכובת המאפשרת תיוג ישיר של כלי הדם. היום DiI משמש גם למטרות כתמים אחרים, כגון הדמיה מולקולה אחת, מיפוי הגורל, ומעקב עצבי. מעניין, מספר fluorophores קיים (עם אורכי גל שונים של פליטה) המאפשר את השילוב עם תוויות פלורסנט אחרות, ואת התאגדות, כמו גם את הדיפוזיה לרוחב של DiI יכול להתרחש הן לחיות וקבוע רקמות18, . בן 19
פורמלדהיד, התגלה על ידי פרדיננד בלום ב-1893, שימש באופן נרחב ליום הנוכחי ככימיקל המועדף לקיבוע רקמות20,21. הוא מראה ספציפיות למרבית היעדים הסלולאריים ומשמר את המבנה התאי22,23. הוא גם שומר על תכונות פלורסנט של רוב fluorophores, ובכך ניתן להשתמש כדי לקבוע בעלי חיים טרנסגניים שבהם תאים ממוקדות לבטא העיתונאי פלורסנט חלבונים.
בכתב יד זה, פרוטוקול קודם שפותח כדי לתייג כלי דם בדגמי יונקים קטנים וניסיוניים24 הותאם לשימוש בדגים. ההליך כולו לוקח רק כמה שעות לבצע. זה מדגים כיצד לעשות פתרון קבע של פורמלדהיד המכיל dii בלב הדג כדי לתייג ישירות את כל כלי הדם במוח ואת בלוטת ההיפופיזה של הדג המודל הצדקה. מאקה הוא דג מים מתוקים קטן יליד אסיה, שנמצא בעיקר ביפן. זה אורגניזם מודל מחקר עם חבילה של כלים מולקולריים וגנטיים זמינים25. לכן, זיהוי כלי הדם במין זה כמו גם באחרים יאפשר לשפר את ההבנה שלנו על איך המוח ואת התאים בבלוטת ההיפופיזה אינטראקציה עם דם ובלוטת הדם ברקמה שלמה או פרוסות רקמה עבה.

<table><tbody><tr><td>16% פרפורמלדהיד</td><td>אלקטרונים מיקרוסקופיה מדעי</td><td>RT 15711</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל מזרק PP/PE ללא מחט</td><td>מזרקי</td><td>סיגמא</td><td>Z116866-100EA</td></tr><tr><td>BD מחטי מזרק Precisionglide</td><td>סיגמא</td><td>Z118044-100EA</td><td>מחטים 18G (1.20*40)</td></tr> <tr><td>זכוכית בורוסיליקט 10 ס"מ OD 1.2 מ"מ</td><td>מכשיר סאטר</td><td>BF120-94-10</td><td>פיפטה זכוכית</td></tr><tr><td>DiI (1,1&prime;-Dioctadecyl-3,3,3&prime;,3&prime;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)</td><td>Invitrogen</td><td>D-282</td><td></td></tr><tr><td>LDPE tube OD 1.7 מ"מ ו-I.D 1.1 מ"מ</td><td>Portex</td><td>800/110/340/100</td><td>Canula</td></tr><tr><td>Phosphate Buffer תמיסת מלח (PBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>חולץ פיפטה</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי מפלסטיק</td><td>VWR</td><td>391-0442</td><td></td></tr><tr><td>לוקטיט</td><td>ג'ל דבק סופר</td><td>c4356</td><td></td></tr><tr><td>טריקאין (ms-222)</td><td>sigma</td><td>E10521-50G</td><td></td></tr></tbody></table>

הוספת תוויות של כלי דם במוח teleost ואת בלוטת היותרת שימוש בפרזיה לב עם dii-fixative

Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative

כלי הדם מinnervate את כל הרקמות בחוליות, ומאפשרים את הישרדותה על ידי מתן החומרים המזינים, החמצן והאותות ההורמונליים הנחוצים. זהו אחד האיברים הראשונים להתחיל לתפקד במהלך הפיתוח. מנגנונים של היווצרות כלי הדם הפכו להיות נושא של עניין מדעי וקליני גבוה. אצל מבוגרים עם זאת, קשה לדמיין את היום ברוב חיות החיים בשל הלוקליזציה שלהם עמוק בתוך רקמות אחרות. עם זאת, הדמיה של כלי הדם ממשיכה להיות חשובה למספר מחקרים כגון אנדוקרינולוגיה ונוירוביולוגיה. בעוד כמה קווים טרנסגניים פותחו ב zebrafish, עם כלי הדם לדמיין ישירות דרך הביטוי של חלבונים פלורסנט, אין כלים כאלה קיימים עבור מינים teleost אחרים. הפרוטוקול הנוכחי מציג טכניקה מהירה וישירה כדי לתייג כלי דם במוח ובבלוטת יותרת, באמצעות השימוש בשיטת "הצדקה" (Oryzias) כמודל. פרוטוקול זה מאפשר שיפור של ההבנה שלנו על איך בתאי המוח ובלוטת ההיפופיזה לקיים אינטראקציה עם דם ובללטורה ברקמה שלמה או פרוסות רקמה עבה.

פרוטוקול זה מדגים הליך צעד אחר צעד כדי לתייג את כלי הדם במוח מאקה ובלוטת היותרת, ובאותו זמן לתקן את הרקמה. לאחר תיוג על ידי הזרקה לב של פתרון קבע המכיל dii ללב, כלי הדם ניתן לצפות על פרוסות באמצעות stereomicroscope פלורסנט (איור 4) או על רקמות שלמות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית וקד (איור 5). או על הפרוסה רקמה עבה או על הרקמה כולה, את הארכיטקטורה של הדם ובקרה ניתן להבחין בשלושה מימדים. פרוסות רקמה יכול להיות מתויג עבור חלבונים ייעודיים ספציפיים באמצעות פרוטוקולים ...

המאמר מתאר פרוטוקול מהיר לתיוג כלי דם בדגים teleost על ידי זלוף הלב של dii מדולל בתיקונים, באמצעות מסדר (oryziasלטיפס) כמודל והתמקדות במוח ובבלוטת יותרת השומן.

הוספת תוויות של כלי דם במוח Teleost ואת בלוטת היותרת שימוש בפרזיה לב עם DiI-fixative

Blood vessels innervate all tissues in vertebrates, enabling their survival by providing the necessary nutrients, oxygen, and hormonal signals. It is one ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לתייג את כלי הדם במוח ובמוח של דגי טלוסט, ואנחנו משתמשים בזיבול לב עם תיקון המכיל DiI בזן המודל מדאקה. אז טכניקה זו היא פשוטה ויעילה תסייע לענות על שאלות חשובות לגבי האנטומיה של כלי הדם במוח ובמוח של דגי טלוסט, כמו גם את הקשר בין נוירונים או תאים אנדוקריניים וכלי דם. כמה יתרונות של טכניקה זו כוללים הכנה מהירה ופשוטה, ואת הסתגלותה למין הדגים טלוסט.כדי להכין מחזיק דגים, חותכים חתיכת פוליסטירן לאורך של חמישה סנטימטרים, רוחב של שלושה סנטימטרים ועובי של שני סנטימטרים, ולהדביק את הפוליסטירן לצלחת פלסטיק בקוטר תשעה סנטימטרים. ואז להשתמש באזמל כדי להפוך את סירה שלושה סנטימטר בצורת חור בפוליסטירן. כדי להכין את מערכת חליטה, להוסיף 30 עד 50 ס"מ צינורית פלסטיק ארוכה בגפיים של מחט מערכת חיסון.כדי להכין חמש פיפטים זכוכית סנטימטר, להשתמש מושך פיפטה למתוח נימי זכוכית בודדים על פי הוראות היצרן. לפני תחילת הניתוח, לטעון מזרק 10 מיליליטר עם הפתרון מוכן DiI-fixative ולהמקם מחט עם cannula בגפיים של המזרק. לאחר מכן השתמש בכמה חתיכות של סרט הדבקה להציב אוריינטציות שונות כדי לתקן את המזרק לספסל, ולהתאים את המיקום של המיקרוסקופ ואת המושב כדי לקבל עמדה טובה עבור ניתוח עבור לחיצה על בוכנה מזרק עם המרפק.לאחר מכן, מניחים דג המתת סנפיר בצד הבטן של מחזיק הדגים ומאבטחים את הראש והזנב עם סיכות. השתמש במספריים כדי לחתוך אופקית את השכבה השטחית של העור כדי לפתוח את הבטן הפנימית, ולהשתמש במקלפים כדי להסיר את העור מעל הלב עד גישה ברורה החדר ואת העורקים בולבוס מושגת. מוסיפים צינור זכוכית בקצה נימי ולשבור את קצה פיפטה.להביא את צינור הזכוכית קרוב החדר ולהוסיף לחץ מרפק לבוכנה מזרק כדי לאלץ את הנוזל החוצה תוך הצמדת החדר הלב עם פיפטה. ואז מיד לחטא את הסינוס ונוסוס עם מטלאים כדי לשחרר את הדם מהמחזור. מן החדר, להתאים את הזווית של פיפטה זכוכית כדי לאתר את הכניסה של טרטרוסוס בולבוס, ולהזיז את פתח פיפטה בתוך העורקים bulbus.לאחר מכן להוסיף לחץ על המזרק במשך 30 עד 60 שניות נוספות תוך שמירה על פיפטה בתוך העורקים bulbus. עבור תיוג אופטימלי של כל כלי הדם זה קריטי כדי לתפוש לתוך העורקים בולבוס מספיק זמן כדי להחליף את כל הדם עם פתרון DiI-fixative. לאחר כ -60 שניות של זלוף, כאשר לא נצפתה עוד דליפת דם, הסר את פיפטה הזכוכית והמחטים מהדגים, וקצר את המוח ואת בלוטת יותרת המוח לתוך טרי 4% paraformaldehyde במשך שעתיים בטמפרטורת החדר בחושך.לאחר מכן לשטוף את הרקמות פעמיים PBS טרי במשך 10 דקות לכל לשטוף לפני הכנת הדגימות להדמיה. לאחר הזרקת לב של פתרון קיבוע המכיל DiI כפי שהודגם, כלי הדם המסומנים ניתן לראות על פרוסות רקמות על ידי מיקרוסקופיה סטריאו פלואורסצנטי או על רקמות שלמות על ידי מיקרוסקופיה קונפוקאלית. שים לב שאם הפתרון מוזרק בחדר הלב במקום טרקי העורקים בולבוס או אם הפתרון מוזרק עם נמוך מדי של לחץ ו / או לתקופה קצרה מדי, תיוג לקוי של כלי הדם יצפה.בנוסף, כאשר מדמיינים את אותה רקמה עם אותם פרמטרי הדמיה, ניתן לראות ירידה בעוצמת התיוג לאחר מספר ימים, כאשר האות מופיע מתפשט יותר בתוך דגימת הרקמה. פרוסות רקמה מקווים מהוססים שבתוכם התאים בעלי העניין מבטאים חלבוני כתב פלואורסצנטיים יכולים להיות מסומנים עוד יותר עבור חלבונים ספציפיים של עניין באמצעות פרוטוקולי immunofluorescence סטנדרטיים המאפשרים חקירה של אינטראקציות בין כלי דם וסוגי תאים אחרים. חשוב להגיע לתרקוס בולבוס.כאשר זה מושגת, הוספת לחץ לבוכנה מזרק צריך לגרום הרחבה של בולבוס המאשר הליך מוצלח. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לחקור את האינטראקציה בין תאים אנדוקריניים וכלי דם בלוטת יותרת המוח טלוסט בכלל, אבל אולי באופן ספציפי יותר כדי לחקור הבדלים אפשריים או קווי דמיון בין מערכות הפורטל בטלוסט ויונקים. מכיוון ששימוש פוליטי זה תרכובות רעילות ונדיפות אמצעי זהירות כגון שימוש במסכת גז וחדר מאוורר תמיד יש לנקוט בעת ביצוע הליכים אלה.

labeling-blood-vessels-teleost-brain-pituitary-using-cardiac

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

אנו מדגימים את השימוש באקדח הגן להציג צבעי ניאון, כגון DiI, לתוך הנוירונים פרוסות המוח של מכרסמים פרימטים שאינם בני אדם בגילאים שונים. במקרה הספציפי הזה, אנו משתמשים בעכברים בוגרים (3-6 חודשים) וקופים cynomologus מבוגר (9-15 שנים). טכניקה זו, שתוארה לראשונה על ידי במעבדה של ד"ר ליכטמן...

תיוג DiOLISTIC של הנוירונים מפני מכרסמים שאינן פרוסות המוח האנושי הפרימאטים

מאמר זה מתאר שיטה תיוג עור וכלי דם עובריים התימוס.

שיטה תיוג vasculature ב עכברים עובריים

כאן אנו מתארים בעלות נמוכה, בהליך מהיר, קיבעון מבוקר ואחיד באמצעות paraformaldehyde 4% perfused דרך מערכת כלי הדם: דרך הלב של חולדה כדי לקבל את השמירה הטובה ביותר של המוח.

בעלי חיים שלמה זלוף קיבוע של מכרסמים

מעגלים עצביים מאורגנים מבחינה טופוגרפית עם פרופילים מולקולריים ספציפיים לתאים פונקציונליים. כאן, אנו מספקים את הצעדים המעשיים והטכניים של חשיפת הטופוגרפיה המוח העולמי באמצעות גישה צדדי wholemount מכתים immunohistochemical. אנו להדגים את התועלת של השיטה באמצעות cytoarchitecture מבינים היטב ואת המעגלים של המוח הקטן.

אימונוהיסטוכימיה Wholemount על טופוגרפיה חושפני המוח קומפלקס

ניתוח של כלי דם במוח האנטומיה מכרסם משחק תפקיד חשוב במחקר ניסויי שבץ. בהקשר זה, זלוף intravascular עם לטקס צבעוני כבר נחשב כלי סטנדרטי במשך כמה שנים. עם זאת, טכניקה זו מרמזת מגבלות טכניות שונות, המערערים את השחזור שלה. כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה לדמיין כולים מוחיים באופן שחזור. הזרקה של תערובת של שני צבעים שחורים פחם מסחרי זמינים דרך תוצאות חדר לב השמאליות של שריר הלב במילוי נאות של כולים מוחיים עם הדמית ניגודיות גבוהה. יש לנו ליישם בהצלחה בטכניקה זו כדי לזהות נקודתי anastomotic בין שטחי כלי דם...

זלוף intravascular של דיו שחור פחם מאפשר הדמיה אמינה של כלי מוחות

באמצעות lipophilic 1,1-Dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) מכתים טכניקה, Ambystoma mexicanum יכול לעבור זלוף כלי הדם כדי לאפשר ויזואליזציה קלה של כלי הדם.

DiI זלוף כשיטת ויזואליזציה של כלי הדם<em&gt; Ambystoma מקסיקניום</em

כאן נציג של assay חדירות כלי דם במוח העכבר באמצעות הזרקה בקרום הבטן של המשדרים פלורסנט ואחריו זלוף הרלוונטיים מודלים חייתיים של תפקוד לקוי של מחסום הדם - מוח. חמי-המוח משמש עבור הערכת חדירות באופן כמותי, והשני עבור מעקב חזותי/immunostaining. התהליך לוקח ב' 5-6-10 עכברים.

In Vivo מחסום הדם - מוח חדירות Assay בעכברים באמצעות Fluorescently עם התווית המשדרים

פרוטוקול זה מתאר גישה יעילה וניתנת לשחזור למחקרים היסתולוגיים במוח העכבר, כולל זלוף, חתך מוחי, חיסונים צפים חופשיים, הרכבת רקמות והדמיה.

חיסון חופשי של מוחות עכבר

היכולת לסמן באופן קבוע תאי גזע וצאצאיהם באמצעות פלואורופור באמצעות קו עכברים מהונדס בלתי ניתן להשראה מאפשרת ניתוח מרחבי וזמני של הפעלה, התפשטות, נדידה ו/או התמיינות in vivo. מעקב אחר שושלת יכול לחשוף מידע חדש על מחויבות לשושלת, תגובה להתערבויות ורב-תחומיות.

מעקב אחר שושלת של תאי גזע בעלי תווית פלואורסצנטית אינדוקטיבית במוח העכבר הבוגר

החקירה הראשונית מאשרת כי דימום תת-עכבישי (SAH) גורם למוות של פריציטים במוח. הערכת התכווצות פריציטים לאחר SAH דורשת הבחנה בין פריציטים חיים ולא קיימא במוח. לפיכך, פותח הליך לסימון פריציטים במוח בני קיימא ושאינם בני קיימא בו זמנית בקטעי מוח, מה שמקל על תצפית באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי ברזולוציה גבוהה.

הדמיה של פריציטים חיוניים ולא חיוניים במוח בפרוסות מוח לאחר דימום תת-עכבישי

אנו מדגימים התרחבות כימית של כלי דם גדולים בעכברים כמודל לחקר תפקוד לקוי של כלי הדם במוח, אשר יכול לשמש עבור מודלים של דמנציה וסקולרית ואלצהיימר. אנו גם מדגימים הדמיה של כלי הדם על ידי הזרקת תרכובת גומי סיליקון ומתן הדרכה חזותית ברורה למדידת שינויים בגודל כלי הדם.

גישה חזותית לגרימת דוליכואקטזיה בעכברים כדי למדל תפקוד לקוי של כלי דם גדולים בתיווך כלי דם במוח

למדו פרזיה לבית עם DiI-fixative לתיוג כלי דם במוח ובלוטת היותרת של דגי Teleost. שיטה זו, המבוססת על מודל Oryzias latipes, מאפשרת חקר אנטומיה וסקולרית וקשרים בין תאים עצביים או אנדוקריניים לכלי דם ביעילות ובמהירות.

הוספת תוויות של כלי דם במוח Teleost ואת בלוטת היותרת שימוש בפרזיה לב עם DiI-fixative

גלה סרטונים נוספים