Name: סינתזה אנזימטית של אפוקסי מטבוליטים של דוקוסקסהקאקאנוק, אייאיסאופנטנואית וחומצות ארכידונית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: למדו סינתזה אנזימטית של חומצות שומן אפוקסידיות טהורות-אננטיומריות באמצעות האנזים P450 BM3. השיטה פשוטה, מהירה וחסכונית לייצור כמויות משמעותיות של מטבוליטים מ-DHA, EPA וחומצה ארכידונית לחקר תפקודים ביולוגיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו ממומנת על ידי R00 ES024806 (המכון הלאומי לבריאות), DMS-1761320 (הקרן הלאומית למדע) וכספי הפעלה מאוניברסיטת מישיגן סטייט. המחברים מבקשים להודות לד ר ג'ון יאנג (אוניברסיטת קליפורניה בדיוויס) ולליתה קראלה (אונ' מישיגן) לסיוע במיטוב התגובה האנזימטית, וד ר טוני שילמילר (MSU טבולומיקס מאסה ספקטרומטר מתקן ומיתקן) לקבלת סיוע ברכישת נתונים HRMS.

התראה: נא להתייעץ עם כל גליונות הנתונים הרלוונטיים של בטיחות חומרים (MSDS) לפני השימוש בכימיקלים המפורטים.
1. ביטוי מסוג פראי BM3
<ol><li>איחסן pBS-BM3 מDH5α E. coli (תרומה נדיבה של ד ר פ. אן ווקר) ב 5 מ ל של מרק LB סטרילי עם 0.5 מ"ג של אמפיצילין נוסף לתוך שפופרת תרבות 20 מ ל.</li>
	<li>מודטה את תרבות התא בשייקר ב 37 ° c עבור 24 שעות ב 200 rpm. להוסיף את התרבות לילה המתנע (5 מ ל) ו 100 mg של אמפיצילין L של מרק ליברות סטרילי בבקבוקון פרנבאך או Erlenmeyer אייר. נענעי ב 37 ° צ' עבור 6 h ב 200 סל"ד, ואז ב 30 ° c עבור 18 h ב 200 rpm.</li>
	<li>איסוף וצנטריפוגה את תרבות התא ב 4 ° צ' עבור 10 דקות ב 1,000 x g. השמט את הסופרנטנט ואחסן את הגלולה בתא-78 ° צ' עד לטיהור אנזימים. הערה: supernatant יכול להיות מעוקר כימית על ידי טיפול עם אקונומיקה או מעוקר באמצעות החיטוי ולאחר מכן נשפך לטמיון.</li>
</ol>2. טיהור של BM3.
<ol><li>
פירוק תאים
	<ol>
<li>הפשרת את הגלולה הסלולרית על הקרח והשעיית מחדש ב-40 מ ל של מאגר מסיסות (4 ° c) של קרח קר (ארבע מעלות צלזיוס) (10 מ"מ טריס, 0.01 מ"מ פנילמתיל פלופקסיל (PMSF;), 0.01 מ"מ EDTA; pH 7.8). התראה: PMSF הוא רעיל על ידי מגע.</li>
		<li>בעוד בקרח, sonicate את התאים עבור 1 דקות עם הומוגניצר אולטרה סאונד (פלט כוח הגדרת 10, חובת 100%), ואחריו הפסקה 1 דקות על הקרח על מנת lyse את התאים. חזור על הליך זה 6 פעמים. צנטריפוגה את התא ליפוסט ב 4 ° צ' עבור 30 דקות ב 11,000 x g כדי לכלוך תא גלולה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
כרומטוגרפיה של אהדה
	<ol>
<li>הכנת עמודה חזקה של חילופי כרומטוגרפיה (ראה טבלת חומרים; קוטר: 2.8 ס"מ x 6 ס"מ, נפח עמודה: 37 mL) על ידי כביסה עם 5 כרכים של עמודות (CV) של מאגר a (10 מ"מ טריס, pH 7.8) ב 4 ° c.</li>
		<li>הוסף את התאים הניידים לעמודה מעורפלת ושטוף את העמודה עם 3 קורות חיים של מאגר קר A. Elute the BM3 על ידי שטיפת הטור עם מאגר קר B (10 מ"מ טריס, 600 mM הנאקל, 6 קורות חיים).</li>
		<li>לאסוף את שבר משחרלי חום אדמדם. אם החלבון אינו משמש באופן מיידי, ערבב אותו עם נפח שווה של גליצרול והקפאת הבזק עם חנקן נוזלי. אחסן את הפתרון הקפוא ב-78 ° c.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. אפוקסי של DHA על ידי BM3
<ol><li>להכין את התגובה על ידי הוספת 0.308 g (0.940 mmol) של DHA ב 18.8 mL של dimethylsulfoxide (DMSO) כדי 2 L של מאגר התגובה זע (0.12 M אשלגן פוספט, 5 מ"מ MgCl2, pH 7.4) יחד עם 20 ננומטר של האנזים BM3 הופדיל. ריכוז האנזים ניתן לקבוע על ידי שיטת הדו חד תחמוצת הפחמן/דיתיוונייט19.</li>
	<li>בעוד הפתרון הוא זע, להתחיל את התגובה על ידי הוספת 1 שווה ערך ל-NADPH (מופחת בדרך-אגב, מופחתת מלח הטטרנתרן, 0.808 g, 0.940 mmol) הומס מאגר התגובה. מערבבים את התגובה עבור 30 דקות תוך מבעבע אוויר דרך תערובת התגובה עם בלון מלא אוויר מוצמד מזרק מחט.</li>
	<li>באמצעות ספקטרוסקופיה (ראה טבלת חומרים), בדוק את ספיגת תערובת התגובה ב 340 nm כדי לקבוע אם nadph מתרוקן. אם אין ספיגה נוספת המציינת את הצריכה של NADPH, התגובה תושלם. הערה: בדרך כלל, התגובה הושלמה לאחר 30 דקות.</li>
	<li>להרוות את תערובת התגובה על ידי הוספת לאט חומצה אוקסלית 1 M, dropwise, עד pH של הפתרון מגיע 4.</li>
</ol>4. הפקת האדפס
<ol><li>לחלץ את הפתרון מאגר הקרה עם 2 L של דיאתיל אתר (anהידרוous, ללא תחמוצת) 3 פעמים. לאסוף את שכבת האתר (6 L) ויבש עם מגנזיום אנמים סולפט (MgSO4).</li>
	<li>מסננים את MgSO4 מן הפתרון ולרכז את שכבת האתר מיובש על מאייד רוטרי להניב שאריות edp גסה.</li>
	<li>לטהר את השאריות על ידי כרומטוגרפיה עמודה פלאש (מחסנית 40 g סיליקה מספיקה). התחל ב 10% אתיל אצטט (אטואק) ב הקסנס ואת הרמפה עד 60% אטואק ב הקסאנס מעל 22 דקות. הערה: שלוש פסגות גדולות מתקבלות ונאספות, משחררי בסדר של 1. לא הגיב DHA; 2. תערובת של איזופ איפולימרים; ו-3. di-לייף (מוצרים נורמליים על חמצון (ראה איור 1)).</li>
	<li>לשלב את השברים ולמקד אותם על המאדה רוטרי. מדוגמה זו, 0.074 g, (24%) של DHA בלתי מגיב, 0.151 g (47%) של EDP איזוers, ו 0.076 g, (22%) של di-לייף הושגו.</li>
</ol>5. הריפיקציה של EDPs, הפרדה של 16 (s), 17 (r)-ו-19 (s), 20 (r)-edps, ו סאפפיקציה של אסטרים
התראה: טרימתיל סיללדימתאן (TMS-diazomane) הוא רעיל מאוד על ידי מגע ואינהלציה. השתמש רק בתוך מכסה עם ציוד הגנה אישי תקין.
<ol><li>דלל את האפוקסידות (0.151 g, 0.435 manm) בבקבוקון עם תחתית עגול או בקבוקון קטן עם 2 מ ל של anמתנול ous (MeOH) ו-3 מ ל של אנידראן טולואן, מוסיפים בר-מהומה, ומוסיפים TMS-diazomane (1.2 מקבילות, או 0.26 mL של 2 M פתרון ב hexanes) תחת ארגון.</li>
	<li>המתן 10 דקות והוסף תוספת TMS-diazomane (0.050 mL) עד שיישאר צבע צהוב חיוור.</li>
	<li>לאחר 30 דקות, לרכז בזהירות את התערובת באמצעות מאייד רוטרי ולטהר את השאריות על ידי כרומטוגרפיה העמודה פלאש. אליוט עם 4% אטואק בהקסנס (באמצעות טור או מחסנית סיליקה ג'ל 40 g) במשך 22 דקות. בדוגמה זו, 19, 20-EDP מתיל אסתר (0.116 g, 74%) ו 16, 17-EDP מתיל אסתר (0.029 g, 19%), התקבלו כשמנים ברורים (תשואה כוללת, 93%).</li>
	<li>אספו את השברים המכילים את המוני מתיל EDP מטוהרים. 19 (ים), 20 (ה)-edp מתיל אסתר לראשונה, ואחריו 16 (ים), 17 (r)-edp מתיל אסתר.</li>
	<li>אם יישארו שברים מעורבים (המכילים גם איזוers; ניתן להעריך על-ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה (ועוד) ב-8:1 הקסאן/אטואק ומוכתמת באשלגן פרמנגנט (KMnO4)), מחדש כרומאטוגרף אותם עם מערכת ממיסים זהה לפני.</li>
	<li>רכזו את השברים המכילים את היחידות הבודדות. הערה: בשלב זה, הזהות והטוהר עשויים להיות מוערך על ידי NMR (באמצעות CDCl3 כמו הממס; ראה את האגדה עבור איור 2).</li>
	<li>כדי להמיר בודדים EDP מתיל אסתר regiאוינים כדי צורות החומצה שלהם, לדלל את אסתר EDP ב THF: מים (כ 0.7 mL/0.1 mmol של אסתר). להוסיף 2 מימית ליהוי (3 מקבילות טוחנת) ומערבבים בן לילה. הערה: שלמות התגובה יכולה להיות מוערך על-ידי השימוש ב-3:1 הקסאנס/אטואק, כתמים עם KMnO4; למוצר יש גורם שמירה של ~ 0.3.</li>
	<li>להרוות את התגובה לאט עם חומצה פורמית, עד pH של התערובת מגיע 3-4. הוסף מים ו אתיל אצטט (1-2 mL/0.100 mmol של אסתר) ולהפריד את השכבות. לחלץ את שכבת המים עם אטואק (3 x 5 מ ל), לשטוף עם תמיסת מלח רווי ("נמול"), ולייבש את שכבת אטואק מעל נתרן סולפט (Na2SO4).</li>
	<li>רכז את תמיסת אתיל אצטט באמצעות מאייד רוטרי, להוסיף הבעיה (10 mL) ולהתרכז שוב. חזרו פעמיים כדי להסיר את החומצה המיאוטרופית השיורית. לטהר את השאריות על ידי כרומטוגרפיה העמודה פלאש, משחררי עם 10-30% אטואק מעל 15 דקות.</li>
	<li>רכזו את השברים הרצויים ויבשו בתוך הריק כדי לממן את החומצה הטהורה. הערה: בשלב זה ניתן להעריך את טוהר enantiomeric (על-ידי כימיית מערכות, עיין באגדות לאיור 3 - איור 4 לעמודה ולתנאים). טוהר כימי יכול להיות מוערך על ידי סי18 (achiral) כרומטוגרפיה (ראה לוח חומרים והתייחסות 14).</li>
</ol>

<ol><li>Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+epoxyeicosatrienoic+acids+as+endothelium-derived+hyperpolarizing+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors.</a> Circulation Research. 78, 415-423 (1996).</li>
<li>Ulu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+omega-3+epoxide+of+docosahexaenoic+acid+lowers+blood+pressure+in+angiotensin-II-dependent+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">An omega-3 epoxide of docosahexaenoic acid lowers blood pressure in angiotensin-II-dependent hypertension.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64, 87-99 (2014).</li>
<li>Ye, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+p-450+epoxygenase+metabolites+of+docosahexaenoate+potently+dilate+coronary+arterioles+by+activating+large-conductance+calcium-activated+potassium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Cytochrome p-450 epoxygenase metabolites of docosahexaenoate potently dilate coronary arterioles by activating large-conductance calcium-activated potassium channels.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 303, 768-776 (2002).</li>
<li>Imig, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epoxyeicosatrienoic+acids%2C+hypertension%2C+and+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Epoxyeicosatrienoic acids, hypertension, and kidney injury.</a> Hypertension. 65, 476-682 (2015).</li>
<li>Capozzi, M. E., Hammer, S. S., McCollum, G. W., Penn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epoxygenated+fatty+acids+inhibit+retinal+vascular+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Epoxygenated fatty acids inhibit retinal vascular inflammation.</a> Scientific Reports. 6, 39211(2016).</li>
<li>Zou, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereospecific+effects+of+epoxyeicosatrienoic+acids+on+renal+vascular+tone+and+K%28%2B%29-channel+activity%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Stereospecific effects of epoxyeicosatrienoic acids on renal vascular tone and K(+)-channel activity.</a> American Journal of Physiology. 270, F822-F832 (1996).</li>
<li>Lauterbach, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+P450-dependent+eicosapentaenoic+acid+metabolites+are+novel+BK+channel+activators%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Cytochrome P450-dependent eicosapentaenoic acid metabolites are novel BK channel activators.</a> Hypertension. 39, 609-613 (2002).</li>
<li>Clarke, T. C., Black, T. I., Stussman, B. J., Barnes, P. M., Nahin, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aClarke%2C+TC+%22Trends+in+the+use+of+complementary+health+approaches+among+adults%3A+United+States%2C+2002%E2%80%932012%22">Trends in the use of complementary health approaches among adults: United States, 2002–2012</a>. , National Center for Health Statistics. Hyattsville, MD. (2015).</li>
<li>Mozaffarian, D., Wu, J. H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Omega-3+fatty+acids+and+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Omega-3 fatty acids and cardiovascular disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 58, 2047-2067 (2011).</li>
<li>Shearer, G., Harris, W., Pederson, T., Newman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+omega-3+oxylipins+in+human+plasma+in+response+to+treatment+with+omega-3+acid+ethyl+esters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Detection of omega-3 oxylipins in human plasma in response to treatment with omega-3 acid ethyl esters.</a> Journal of Lipid Research. 51, 2074-2081 (2010).</li>
<li>Ostermann, A. I., Schebb, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+omega-3+fatty+acid+supplementation+on+the+pattern+of+oxylipins%3A+a+short+review+about+the+modulation+of+hydroxy-%2C+dihydroxy-%2C+and+epoxy-fatty+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Food+%26+Function%22%5BJournal%5D)">Effects of omega-3 fatty acid supplementation on the pattern of oxylipins: a short review about the modulation of hydroxy-, dihydroxy-, and epoxy-fatty acids.</a> Food & Function. 8, 2355-2367 (2017).</li>
<li>Khan, M. A., Wood, P. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKhan%2C+MA+%22Method+for+the+synthesis+of+DHA%22">Method for the synthesis of DHA</a>. , WO2012126088A1 (2012).</li>
<li>Nanba, Y., Shinohara, R., Morita, M., Kobayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereoselective+synthesis+of+17%2C18-epoxy+derivative+of+EPA+and+stereoisomers+of+isoleukotoxin+diol+by+ring-opening+of+TMS-substituted+epoxide+with+dimsyl+sodium%5BTitle%5D)+AND+%22Organic+and+Biomolecular+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Stereoselective synthesis of 17,18-epoxy derivative of EPA and stereoisomers of isoleukotoxin diol by ring-opening of TMS-substituted epoxide with dimsyl sodium.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 15, 8614-8626 (2017).</li>
<li>Cinelli, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+synthesis+and+chemical+inversion+provide+both+enantiomers+of+bioactive+epoxydocosapentaenoic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Enzymatic synthesis and chemical inversion provide both enantiomers of bioactive epoxydocosapentaenoic acids.</a> Journal of Lipid Research. 59, 2237-2252 (2018).</li>
<li>Falck, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical%2C+enantiospecific+syntheses+of+14%2C15-EET+and+leukotoxin+B+%28vernolic+acid%29%5BTitle%5D)+AND+%22Tetrahedron+Letters%22%5BJournal%5D)">Practical, enantiospecific syntheses of 14,15-EET and leukotoxin B (vernolic acid).</a> Tetrahedron Letters. 41, 4131-4133 (2001).</li>
<li>Celik, A., Sperandio, D., Speight, R. E., Turner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enantioselective+epoxidation+of+linolenic+acid+catalyzed+by+cytochrome+P450BM3+from+Bacillus+megaterium%5BTitle%5D)+AND+%22Organic+and+Biomolecular+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Enantioselective epoxidation of linolenic acid catalyzed by cytochrome P450BM3 from Bacillus megaterium.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 3, 1688-2690 (2005).</li>
<li>Capdevila, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+highly+stereoselective+oxidation+of+polyunsaturated+fatty+acids+by+cytochrome+P450BM-3%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The highly stereoselective oxidation of polyunsaturated fatty acids by cytochrome P450BM-3.</a> Journal of Biological Chemistry. 271, 22663-22671 (1996).</li>
<li>Lucas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereoselective+epoxidation+of+the+last+double+bond+of+polyunsaturated+fatty+acids+by+human+cytochromes+P450%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Stereoselective epoxidation of the last double bond of polyunsaturated fatty acids by human cytochromes P450.</a> Journal of Lipid Research. 51, 1125-1133 (2010).</li>
<li>Guengerich, F. P., Martin, M. V., Sohl, C. D., Cheng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+cytochrome+P450+and+NADPH-cytochrome+P450+reductase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measurement of cytochrome P450 and NADPH-cytochrome P450 reductase.</a> Nature Protocols. 4, 1245-1251 (2009).</li>
<li>Cayman Chemical, 19,20-EpDPA. , 
 <a target="_blank" href="https://www.caymanchem.com/product/10175">https://www.caymanchem.com/product/10175</a> (2019).</li>
<li>Graham-Lorence, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+active+site+substitution%2C+F87V%2C+converts+cytochrome+P450+BM-3+into+a+regio-+and+stereoselective+%2814S%2C+15R%29-arachidonic+acid+epoxygenase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An active site substitution, F87V, converts cytochrome P450 BM-3 into a regio- and stereoselective (14S, 15R)-arachidonic acid epoxygenase.</a> Journal of Biological Chemistry. 272, 1127-1135 (1996).</li>
</ol>

למחברים אין קונפליקטים של עניין לגלות.

אנו מציגים כאן שיטה פשוטה וחסכונית עבור הכנת שני מטבוליטים אפוקסי השפע ביותר של DHA-19, 20 ו 16, 17-EDP. חומצות שומן אפוקסי אלה ניתן להכין ב enantiopure מאוד (כמו S שלהם , R-איזוers) טופס באמצעות האנזים BM3 סוג פראי. כמה נקודות קריטיות שניתן להשתמש בהם לפתרון בעיות, ואת השלוחה של השיטה שלנו להכנת אפוקסי אנאנטיפורה מטבוליטים של AA ו-EPA, מתוארים להלן.
BM3 הנחיות לאחסון
אחסון האנזים BM3 מטוהרים אפשרי על ידי ערבוב תמיסת חלבון עם נפח שווה של גל...

כעניין התפקיד כי חומצות שומן רב בלתי רווי (במיוחד אומגה 3 ו אומגה 6 חומצות שומן רב בלתי רווי) לשחק בביולוגיה אנושית גדל בשנים האחרונות, החוקרים הבחינו של מגוון רחב של הטבות מושך כי מטבוליטים שלהם תערוכה. במיוחד, שומן אפוקסי חומצת מטבוליטים המיוצר על ידי מחלקה P450 ציטוכרום של אנזימים היו נקודת גדול של מיקוד. לדוגמה, באפופא רבים, כולל חומצות שונות (eets), חומצות שמנת (edps) וחומצות אפוקסי (eeqs), משחקים תפקיד קריטי בוויסות לחץ הדם ודלקת1,2 ....... , מיכל שלוש , ד , 5. מעניין, enantiomers ספציפיים ו regioisomers של AA ו-EPA ואפוקסידס ידועים יש השפעות שונות על הצומת6,7. בעוד ההשפעות הפיזיולוגיות של enantiomers ו regioisomers של EETs ו-EEQs תועדו, מעט ידוע על ההשפעה של חומצות האפוקסי מקבילה ביותר (EDPs) נוצר מ DHA. שימוש נרחב של שמן דגים8, אשר עשיר הן EPA ו-DHA, גם עוררה עניין ב-edps9. היתרונות של תוספי מזון אלה הם האמינו בחלקו בשל הזרם מטבוליטים DHA (16, 17-EDP ו 19, 20-EDP להיות הנפוץ ביותר) כי ברמות vivo של הקואורדינטות Edp טוב מאוד עם כמות של DHA בדיאטה10, . בסדר, 11
לימוד המנגנונים והיעדים של חומצות שומן אפוקסי אלה על ידי טבולומיקס, ביולוגיה כימית, ושיטות אחרות הוכיחו מאתגרת, בין השאר כי הם קיימים כתערובות של regio-ו-מערכת סטריאו, ושיטה להשיג כמויות טהורות של המלון מחויב ליחידים ולמבודדים. אמצעים קונבנציונליים לסינתזה תרכובות אלה הוכחו ללא יעילים. שימוש בחומצות הפראוקסיטציה כמו חומצה מטה-כלורמטומית לאפוקסי בעלי חסרונות רבים, ובראשם העדר סלקטיביות, הדורשת טיהור יקר ומדקדק של המוני ואנאנטינים בודדים. סינתזה הכולל של DHA ו-EPA מטבוליטים אפשרי, אבל גם סובל מחסרונות שעושים את זה מעשי סינתזה בקנה מידה גדול כגון עלויות גבוהות תשואה נמוכה12,13. הייצור הכולל יעיל ניתן להשיג עם סינתזה אנזימטית, כמו תגובות אנזימטיות הם regio-ו סטריאוסלקטיבית14. מחקרים מראים כי מגוון אנזימטית של AA ו-EPA (עם BM3) הוא שניהם regioselective ו enantioselective15,16,17,18, אבל הליך זה לא נבדק עם DHA, או על גדול ידה. המטרה הכללית של השיטה שלנו היתה לשנות את היקף ולייעל את האפוקסי כימוזציה זו כדי לייצר במהירות כמויות משמעותיות של חומצות שומן באפוקסי טהור כמו enantiomers הפרט שלהם. באמצעות השיטה המוצגת כאן, החוקרים יש גישה אסטרטגיה פשוטה וחסכונית לסינתזה של EDPs ו-PUFA אחרים אפוקסי מטבוליטים.

<table><tbody><tr><td>אמוניום ביקרבונט</td><td>סיגמא</td><td>9830</td><td>NA</td></tr><tr><td>אמפיצילין</td><td>GoldBio</td><td>A30125</td><td>NA</td></tr><tr><td>מגנזיום גופרתי נטול מים</td><td>Fisher Scientific</td><td>M65-3</td><td>NA</td></tr><tr><td>מתנול נטול מים</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>322515</td><td>NA</td></tr><tr><td>נתרן גופרתי נטול מים</td><td>Fisher Scientific</td><td>S421-500</td><td>NA</td></tr><tr><td>נטול מים טולואן</td><td>סיגמא-אולדריץ</td>' <td>244511</td><td>NA</td></tr><tr><td>חומצה ארכידונית (AA)</td><td>Nu-Chek Prep</td><td>U-71A</td><td>רגיש לאוויר.&nbsp;</td></tr><tr><td>דיאתיל אתר</td><td>סיגמא</td><td>296082</td><td>NA</td></tr><tr><td>DMSO (דרגת ביולוגיה מולקולרית)</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D8418</td><td>NA</td></tr><tr><td>חומצה דוקוסהקסאנואית (DHA)</td><td>Nu-Chek Prep</td><td>U-84A</td><td>רגיש לאוויר.&nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA (חומצה אתילנדיאמינטטראצטית)</td> <td>Invitrogen</td><td>15576028</td><td>NA</td></tr><tr><td>חומצה איקוסאפנטאנואית (EPA)</td><td>מכינה Nu-Chek</td><td>&nbsp; U-99A</td><td>רגיש לאוויר.&nbsp;</td></tr><tr><td>אתיל אצטט</td><td>סיגמא&nbsp;</td><td>34858</td><td></td></tr><tr><td>מחסניות עמודות פלאש NA 25, 40, 4, 12 גרם גדלים</td><td>Fisher Scientific</td><td>145170203, 145154064, 5170200</td><td>לחלופין, ניתן להשתמש בכרומטוגרפיה של עמודות קונבנציונלית</td></tr><tr><td>חומצה פורמית (דרגת HPLC)</td> <td>J.T. Baker</td><td>0128-01</td><td>NA</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>סיגמא</td><td>G7757</td><td>NA</td></tr><tr><td>הקסנים</td><td>VWR</td><td>BDH24575</td><td>מרק</td></tr> <tr><td></td><td>NA LBSigma</td><td>L3022</td><td>NA</td></tr><tr><td>ליתיום הידרוקסיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>442410</td><td>NA</td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>2444-01</td><td>NA</td></tr><tr><td>מתנול (בדרגת HPLC)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>34860-41-R</td><td>NA</td></tr><tr><td>NADPH מלח טטרסודיום</td><td>סיגמא-אולדריץ</td>' <td>481973</td><td>רגיש לאוויר.&nbsp;</td></tr><tr><td>חומצה אוקסלית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>194131</td><td>NA</td></tr><tr><td>pBS-BM3 שעבר טרנספטציה DH5 ואלפא; E. coli</td><td></td><td>NA</td><td>NA</td></tr><tr><td>PMSF (פנילמתאן סולפוניל פלואוריד)</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td>רעיל!</td></tr><tr><td>אשלגן פרמנגנט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>223468</td><td>לצביעה TLC.&nbsp;</td></tr><tr><td>אשלגן פוספט דו-בסיסי</td><td>סיגמא</td><td>795496</td><td>NA</td></tr><tr><td>אשלגן פוספט מונו-בסיסי</td><td>סיגמא</td><td>795488</td><td>NA</td></tr><tr><td>Q שרף זרימה מהירה (GE Healthcare מדעי החיים)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>17-0515-01</td><td>לטיהור חילופי אניונים של האנזים</td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>סיגמא</td><td>71376</td><td>NA</td></tr><tr><td>טטרהידרופורן,</td><td>סיגמא-אולדריץ' נטול מים</td><td>186562</td><td>NA</td></tr><tr><td>TMS-דיאזומתאן (2.0 מ' בהקסאנים)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>362832</td><td>רעיל מאוד.&nbsp;</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>GoldBio</td><td>T-400</td><td>NA</td></tr><<tr><td>strong>הכרחי גם:מערכת טיהור פלאש </חזקה></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אוטומטית (השתמשנו ב-Buchi Reveleris X2)&nbsp;</td><td>עמודת HPLC Buchi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C18 (Zorbax Eclipse XDB-C18)</td>צנטריפוגה <td>זריזה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>המסוגלת ל-10,000 x גרם</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>עמודת HPLC כיראלית (תאית לוקס-3), 250 x 4.6 מ"מ, 5 ומיקרו; M, 1000 &Aring;)</td>אספקה לכימיה כללית <td>של פנומנקס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>: משפך הפרדה של 2 ליטר, כוסות וצלוחיות ארלנמאייר בקיבולת של 1000-2000 ליטר, בקבוקונים של 20 מ"ל, בקבוקוני HPLC, צלוחיות קטנות עם תחתית עגולה ומוטות ערבוב</td>.<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC (אנו משתמשים במשאבה אנליטית Shimadzu Prominence LC-20AT וגלאי SPD-20A UV-vis</td> ספקטרופוטומטר <td>Shimadzu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000&nbsp;</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NMR</td><td>NMR: ספקטרומטר Agilent DD2 (500 מגה-הרץ)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>מאייד סיבובי</td><td>Buchi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonic dismembrator או הומוגנייזר קולי</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

סינתזה אנזימטית של אפוקסי מטבוליטים של דוקוסקסהקאקאנוק, אייאיסאופנטנואית וחומצות ארכידונית

Enzymatic Synthesis of Epoxidized Metabolites of Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic, and Arachidonic Acids

האפוקסי מטבוליטים של חומצות שומן רב בלתי רוויות שונות (PUFAs), הנקראת חומצות שומן אפוקסי, יש מגוון רחב של תפקידים בפיזיולוגיה של האדם. אלה מטבוליטים מיוצרים באופן שורש על ידי מחלקת P450 ציטוכרום של אנזימים. בגלל השפעות ביולוגיות מגוונות וחזקות שלהם, יש עניין רב בלמידה אלה מטבוליטים. קביעת התפקידים הייחודיים של מטבוליטים אלה בגוף היא משימה קשה, כמו חומצות שומן אפוקסי יש לקבל תחילה בכמויות משמעותיות עם טוהר גבוהה. קבלת תרכובות ממקורות טבעיים היא לעתים קרובות עבודה אינטנסיבית, ו לייף hydrolases מסיסים הידרו במהירות את מטבוליטים. מצד שני, קבלת אלה מטבוליטים באמצעות תגובות כימיות הוא מאוד לא יעיל, בשל הקושי של קבלת regisomers טהור, enantiomers, תשואות נמוכות, ונרחב (ויקר) טיהור. כאן, אנו מציגים סינתזה אנזימטית יעיל של 19 (s), 20 (r)-ו-16 (s), 17 (r)-האפוקסי חומצות (edps) מ-DHA באמצעות אפוקסי עם BM3, אנזים CYP450 חיידקי מבודד במקור ממלוס מקרתגו megaterium (המתבטא בקלות באסאנכיה קולי). אפיון וקביעת טוהר מתבצעים באמצעות ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית (NMR), כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים, וספקטרומטר מסה (MS). הליך זה ממחיש את היתרונות של סינתזה אנזימטית של PUFA אפוקסי מטבוליטים, והוא חל על האפוקסי של חומצות שומן אחרות, כולל חומצה ארכידונית (AA) וחומצה eאיסאופנטקאנומית (EPA) כדי לייצר את האפוקסי האנלוגי חומצות (EETs) ומוצרי אפוקסי (EEQs), בהתאמה.

כרומאטוגרמה הבזק (מבוצע באמצעות מערכת טיהור פלאש אוטומטית כפי שמתואר להלן) שהושג על ידי טיהור התערובת הגולמי מתוך מראה של אפוקסי אנזימטי מוצג באיור 1. לאחר הפרדת המוני והפרדה של האריאוינים הטהורים 16 (s), 17 (r)-Edp ו -19 (s), 20 (r)-אסטרים של מתיל edp הושגו. בדרך כלל, הם נמצאים 1:4 בקירוב ליחס 1:5, עם המוצר העיקרי להיות 19 (S), 20 (R)-edp. לא מתקבלים עוד מגזרי EDP (לדוגמה, 13, 14 או 10, 11-EDP). 1</s...

אנו מציגים שיטה מועילה לסינתזה אנזימטית וטיהור של אנאנטימרים ספציפיים ובעלי מגוון רחב של חומצה ארכידונית (AA), חומצה docosahexaenoic (DHA), וחומצה eicosapentaenoic (EPA) עם שימוש של ציטוכרום בקטריאלי אנזים P450 (BM3).

The epoxidized metabolites of various polyunsaturated fatty acids (PUFAs), termed epoxy fatty acids, have a wide range of roles in human physiology. These ...

אז הפרוטוקול שלנו מאפשר לנו להכין חומצות שומן אפוקסי enantiopure, שיטה זו עשויה לעזור לקדם מחקר על המנגנונים שבהם מטבוליטים אלה פועלים בגוף. מבחינה היסטורית, חומצות שומן אפוקסי טהור קשה מאוד להשיג. אז הפרוטוקול שלנו הוא פשוט, מהיר, חסכוני, וזה מאפשר לנו להכין כמויות משמעותיות של מטבוליטים אלה.כן, פיתחנו פרוטוקול עבור DHA, אבל זה גם עובד טוב מאוד עבור המשרד לאיכות הסביבה וחומצה רחידונית. עבוד במהירות, מכיוון שחלק מהרהגנטים רגישים לאוויר, במיוחד DHA ו- NADPH, ו הקפד לשייך הכל מראש כך שההגדרה תהיה פשוטה. כמו כן, להיות מודעים לסכנות.הפרוטוקול שלנו משתמש בטכניקות הן באנזימולוגיה והן בכימיה אורגנית. הדמיה היא קריטית כדי לסייע לקוראים וצופים שאינם מכירים את הטכניקות המיוחדות בתחומים אלה. כדי לחסן, להשתמש בלולאה סטרילית או פיפטה טבול במלאי גליצרול של pBS-BM3 הפך DH5-אלפא E.coli לתוך חמישה מיליליטר של מרק LB סטרילי בתוספת 0.5 מיליגרם של אמפיצילין.הדגירה את תרבות התא בשייקר ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ב 200 סל"ד. לאחר מכן, מוסיפים את תרבות המתנע של חמישה מיליליטר ו -100 מיליגרם של אמפיצילין לליטר אחד של מרק LB סטרילי בבקבוק ארלנפייר. לנער ב 37 מעלות צלזיוס במשך שש שעות ב 200 סל"ד, ולאחר מכן ב 30 מעלות צלזיוס במשך 18 שעות ב 200 סל"ד.לאחר מכן, לאסוף את תרבות התא לתוך צינורות צנטריפוגה, צנטריפוגה את תרבות התא בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ב 1, 000 פעמים g. יוצקים את העל-טבעי לתוך בקבוקון אחר. לטהר עם אקונומיקה או באמצעות autoclave, ולאחסן את גלולת התא במינוס 78 מעלות צלזיוס עד טיהור אנזים.כדי לבצע תזה תא, תחילה להפשיר את גלולת התא על קרח, ולתלות מחדש 40 מיליליטר של חיץ מסיסות קר כקרח המכיל טריס, PMSF, ו EDTA. בעוד על קרח, sonicate התאים במשך דקה אחת עם homogenizer קולי, עם הגדרת כוח פלט של 10 וחובת 100, ואחריו הפסקה של דקה אחת על הקרח על מנת ללטף את התאים. חזור על הליך זה שש פעמים.צנטריפוגה התא lysate בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות ב 11, 000 פעמים g כדי גלולה פסולת התא. כדי לבצע כרומטוגרפיה של זיקה, בחדר קר או במקרר עם דלת הזזה, בארבע מעלות צלזיוס, הכינו תחילה עמוד כרומטוגרפיה חזק של חילופי אניון על ידי שטיפת השרף עם חמישה כרכים של חיץ A של טריס 10 מילימולר ב- pH 7.8. לאחר מכן, הוסף את העל-טבעי של lysates התא לעמודה שיווי משקל, ולשטוף את העמודה עם שלושה כרכים עמודה של מאגר קר A.Then, להשתיק את BM3 על ידי שטיפת העמודה עם שישה כרכים עמודה של מאגר קר B של טריס 10-מילימולר ו 600 מילימולר נתרן כלוריד.לאסוף את שבר אלונט אדמדם-חום. אם החלבון אינו בשימוש מיידי, מערבבים אותו עם נפח שווה של גליצרול, והבזק להקפיא עם חנקן נוזלי. אחסן את הפתרון הקפוא במינוס 78 מעלות צלזיוס.כדי לבצע אפוקסידציה של DHA, תחילה לקבוע את הריכוז של אנזים BM3 מופשר, על פי שיטת בדיקה ספקטרלית חד תחמוצת הפחמן dithionite. לאחר מכן, ב beaker המכיל שני ליטרים של חיץ תגובה להיות מעורבב על צלחת ערבוב מגנטי, להוסיף 0.94 מילימולים של DHA מדולל 18.8 מיליליטר של DMSO ואת האנזים BM3 מדולל 20 nanomolar. בעוד הפתרון הוא ערבוב, להתחיל את תגובת אפוקסידציה על ידי הוספת 8.7 מיליליטר של חיץ התגובה המכיל 0.94 מילימולים של NADPH.מערבבים את התגובה במשך 30 דקות תוך מבעבע אוויר לתוך תערובת התגובה עם בלון מלא אוויר מחובר מזרק ומחט מודבק לתוך הקנומה. לאחר מכן, לצייר מיקרוליטר אחד של תערובת התגובה, ולשים אותו לתוך ספקטרופוטומטר NanoDrop כדי למדוד את הספיגה ב 340 ננומטר. השתמש במים כריק.אם אין ספיגה שנותרה, מה שמצביע על NADPH כבר נצרך, התגובה הושלמה. מרווה את תערובת התגובה על ידי הוספה איטית של חומצה אוקסלית טוחנית אחת dropwise, עד pH של הפתרון מגיע כארבעה. עכשיו, לחלץ את פתרון חיץ מרווה עם שני ליטרים של אתר דיתיל נטול חמצן נטול חמצן.השתמש משפך הפרדה לנער ולהפריד את השכבות, ולאסוף את האתר לתוך בקבוק Erlenmeyer. חוזרים על הפעולה פעמיים נוספות ומוסיפים כ-50 גרם מגנזיום גופרתי נטול מים לייבוש האתר. על משפך מסנן ואקום, יוצקים את האתר המיובש כדי לסנן את המגנזיום גופרתי, ומעבירים את שכבת האתר המסוננת לבקבוק תחתון עגול של האידוי הסיבובי.כוונן את מהירות הסיבוב לבינונית, והתחל את הוואקום כדי לרכז את הנוזל להניב שאריות EDP גולמיות. טען את השאריות במחסנית סיליקה של 40 גרם כדי לבצע כרומטוגרפיה של עמודת הבזק באמצעות מכונת טיהור פלאש אוטומטית. התחל ב- 10%ethyl אצטט בהקסאן והגדל עד 60% אתיל אצטט בהקסאן במשך 22 דקות.השברים נאספים באופן אוטומטי בצינורות. לאחר מכן, לשלב את השברים מכל שיא לתוך בקבוקון עגול למטה, לשים על אידוי סיבובי, ולהתחיל את האידוי. שלושה שברים מתקבלים, DHA, אייסומרים EDP, ו diepoxide.כדי להבליט את 0.151 גרם של אפוקסיד, בבקבוקון עגול למטה או בקבוקון קטן, להוסיף שני מיליליטר של מתנול נטול מים ושלושה מיליליטר של טולואן נטול מים, ולהוסיף בר ערבוב. חבר את הבקבוק עם בלון מלא ארגון דרך מחיצת גומי ומחט, ולהוסיף 0.26 מיליליטר של שני טוחנת TMS-diazomethane דרך מזרק תוך ערבוב. המתן 10 דקות והוסף 05 מיליליטר נוספים של TMS-diazomethane עד שיופיע צבע צהוב חיוור.לאחר 30 דקות, לרכז בזהירות את התערובת באמצעות אידוי סיבובי, ולהשתמש 40 גרם ג'ל סיליקה עמוד מחסנית על מכונת כרומטוגרפיה פלאש כדי לטהר את השאריות. אלוט עם ריכוז isocratic של 4% אתיל אצטט בהקסאן מעל 22 דקות. לאסוף את השברים המכילים את מטוהרים 19S, 20R-EDP מתיל אסתר מרומם הראשון, ואחריו 16S, 17R-EDP מתיל אסתר.עכשיו, להעריך את השברים על ידי כרומטוגרפיה שכבה דקה בתערובת הקסאן-לאתיל-אצטט שמונה לאחד. כתם עם אשלגן פרמנganate כדי לבדוק אם יש שברים מעורבים המכילים את שני האיזומרים. לרכז את השברים המתאימים לכל שיא על אידוי סיבובי, ולאחר מכן לשקול איזון כדי לקבוע את כמות ESTERS EDP שהושגו.אם נשארים שברים מעורבים, יש להפוך אותם מחדש לאותה מערכת ממסים כפי שהיה בשימוש בעבר. לרכז כל שבר המכיל את regioisomer בודדים על אידוי סיבובי. כדי להמיר regioisomers מתיל אסתר EDP בודדים לצורות החומצה שלהם, לדלל את אסתר EDP בבקבוקון קטן עם כ 0.7 מיליליטר של THF לכל 0.1 מילימולים של אסתר, יחד עם 0.175 מיליליטר של מים.מקררים את הבקבוקון לאפס מעלות צלזיוס באמבט קרח, מוסיפים שלוש שוות ערך לתסכול ליתיום הידרוקסידי, ומערבבים על צלחת ערבוב מתחת לארגון במהלך הלילה תוך התחממות לטמפרטורת החדר. בבוקר, מרווה את התגובה על ידי הוספה איטית של חומצה פורמית, עד שה- pH של התערובת מגיע לשלוש עד ארבע. לאחר מכן, מוסיפים מים ושני מיליליטר של אתיל אצטט כדי להפריד את השכבות.מוציאים את שכבת המים עם 10 מיליליטר של אתיל אצטט שלוש פעמים, לשטוף עם 20 מיליליטר של תווי מלח רוויים, ולהוסיף כמה גרם של נתרן גופרתי נטול מים בתסומה לייבוש שכבת האתיל אצטט. לרכז את פתרון האתיל אצטט באמצעות אידוי סיבובי, להוסיף 10 מיליליטר של הקסנים, ולהתרכז שוב. חזור פעמיים כדי להסיר azeotropically חומצה פורמית שיורית.לטהר את השאריות על ידי כרומטוגרפיה של עמודת פלאש, eluting עם 10 עד 30% אתיל אצטט על פני 15 דקות. לרכז את השברים הרצויים מאייד סיבובי, ויבש vacuo כדי להרשות לעצמם את החומצה המטוהרת. הכרומטוגרמה של עמודת הפלאש המתקבלת עם טיהור התערובת הגולמית מאפסידציה אנזימטית מוצגת כאן.שלוש פסגות עיקריות הושגו, eluting בסדר של, הראשון, DHA unreacted, השני, תערובת של איזומרים EDP, ושלישית, diepoxide, שהם מוצרי חמצון יתר נורמלי. לאחר אסתריות והפרדה של regioisomers, ספקטרום NMR פרוטון עולה כי טוהר גבוה 16S, 17R-EDP ו 19S, אסטרים מתיל 20R-EDP הושגו. כיראל HPLC אישר טוהר אננטיומרי של צורות החומצה של EDPs.הקפד לשמור על המרק שלך סטרילי תוך כדי טיפול וחינוך כדי למנוע זיהום. אפוקסידציה יכול לשמש חומצות שומן אחרות. אז ניסינו את זה גם עם חומצות ארכואידיות ואיקוספנטאנואיות, והשגנו תשואות טובות של אפוקסידים enantiopure אלה, כך 14, 15-EET ו 17, 18-EEQ.אז פרוטוקול המאפשר לחוקרים לגשת חומצות שומן אפוקסי עשוי לסייע במחקר על הפונקציות הביולוגיות של תרכובות אלה, אשר יכול להוביל את השימוש בהם כמוביל סמים. הכימיקלים המסוכנים הם PMSF, אשר מסוכן על ידי מגע, ו TMS-diazomethane, אשר רעיל מאוד על ידי מגע שאיפה. אז האחרון צריך לשמש ברדס אדים עם ציוד מגן אישי נאות.

enzymatic-synthesis-epoxidized-metabolites-docosahexaenoic

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

פרוטוקול זה ידגים מיצוי וניתוח של חומצות שומן ביו-אקטיביות חופשיות ואסטריות מהתאים. חומצות שומן מכומתות במדויק באמצעות דילול איזוטופים יציב, כרומטוגרפיה נוזלית כיראלית, לכידת אלקטרונים, יינון כימי אטמוספרי, ספקטרומטריית מסה לניטור תגובות מרובות (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

ליפידים מיצוי נייד עבור דילול ממוקד איזוטופ יציב ניתוח כרומטוגרפיה נוזלית ספקטרומטריית-Mass

אנו מתארים פרוטוקול עבור דור האור היה זרז של מי חמצן - גורם-שותף עבור טרנספורמציות חמצונים.

אור מונחה אנזימתי Decarboxylation

כהלים אמינו כיראלי הם מולקולות רב-תכליתי לשימוש בתור פיגומים סינטזות. החל מ- L-ליזין, אנחנו יוצרים אמינו מאת לתגובה אשד אנזימטי diastereoselective C-H חמצון על ידי dioxygenase ואחריו המחשוף חומצה קרבוקסילית moiety של חומצת אמינו הידרוקסיל המתאימים ביותר על ידי שילוב decarboxylase.

תגובות אנזימטיות אשד לסינתזה של כהלים אמינו כיראלי מ L-ליזין

ב פרוטוקול זה, נתאר את הסינתזה של התרמילים, phenyoxadiazolyl מתיל מבוססי sulfone ריאגנט של הקובץ המצורף באתר סלקטיבית של מטענים תיולים של מולקולות, במיוחד נוגדנים. בנוסף, נתאר את סינתזה ואפיון של chelator bifunctional של תרמילי מניבי, ההטיה שלה נוגדן מודל.

סינתזה, Bioconjugation של תיול-תגובתי ריאגנטים עבור הקמת האתר באופן סלקטיבי שונה Immunoconjugates

עבודה זו מתארת שיטה חזקה וישירה כדי לזהות ולכמת את האנדוקאנמיאיד 2-ארכאינול (2-AG) ב- C. אלגיה. תקן הניתוח האנליטי הינו מוכן ומשמש לקוונפיקציה של 2-AG על ידי איזונושא דילול וכרומטוגרפיה נוזלית-אלקטרורינון-ספקטרוגרפית מאסיבית (LC-ESI-MS/MS).

סינתזה של תקן שניוני לקוונפיקציה של 2-ארכידליגליליצרול באוקנאבאבדיטיס

כאן, אנו מציגים שיטה כמותית זולה המשתמשת תחמוצת דאוטריום וספקטרומטריית מסה כרומטוגרפית גז (GCMS) לניתוח של חומצת שומן כוללת דה נובו ליפוגנזה ברקמת שומן חום in vivo.

קביעה כמותית של סינתזת חומצות שומן דה נובו ברקמת שומן חומה באמצעות תחמוצת דאוטריום

Distyryl-2-1,4 בנזן (arylethynyl) ,5-BIS וגרעיני benzobisoxazole יכולים לשמש fluorophores צורת הצלב חוצה מצומדות מבוסס על לזהות איכותי מגוון לואיס חומצי וanalytes הבסיסי לואיס. שיטה זו מסתמכת על ההבדלים בצבעי פליטה של ​​cruciforms כי הם נצפו על בנוסף אנליטי. ניתן להבחין בין מינים מבחינה מבנית הקשורים באופן הדוק מזה.

זיהוי איכותי של חומצות קרבוקסיליות, חומצות boronic, ואמיני שימוש fluorophores הצלב

סינתזה, הפעלה, ואפיון של חומרי מסגרת מתכת אורגנית במכוון נועדו הוא מאתגרת, במיוחד כאשר אבני בניין הוא הפולימורפים לא תואמים או לא רצויים הם העדיפו thermodynamically על צורות הרצויות. אנו מתארים כיצד יישומים של שער סייע ממס מקשר, עקיפה X-ray אבקה בנימים והפעלה באמצעות CO 2 ייבוש סופר קריטי, יכולים לתת מענה לחלק מהאתגרים האלה.

מסגרות סינתזה ואפיון של פונקציונליות מתכת אורגנית

מתוארת סינתזת הסול-ג'ל בתיווך פעילי שטח של מונוסודיום טיטנאט בגודל ננומטר, יחד עם הכנת החומר המתאים שהשתנה במי חמצן. מוצגת גם תגובת חילופי יונים עם Au(III).

כימית סינתזת תגובה של nanosize מונוסודיום Titanate

מתואר פרוטוקול לסינתזה ואפיון של קולואידים המצופים בחלקים סופרמולקולריים. קולואידים על-מולקולריים אלה עוברים הרכבה עצמית עם הפעלת קשרי המימן בין המולקולות המעוגנות על פני השטח על ידי אור UV.

סינתזה ואפיון של קולואידים מולקולריים

למדו סינתזה אנזימטית של חומצות שומן אפוקסידיות טהורות-אננטיומריות באמצעות האנזים P450 BM3. השיטה פשוטה, מהירה וחסכונית לייצור כמויות משמעותיות של מטבוליטים מ-DHA, EPA וחומצה ארכידונית לחקר תפקודים ביולוגיים.

סינתזה אנזימטית של אפוקסי מטבוליטים של דוקוסקסהקאקאנוק, אייאיסאופנטנואית וחומצות ארכידונית

גלה סרטונים נוספים