Name: הקלטות אלקטרופיזיולוגיות של זרמי יונים של תא בודד תחת לחץ הטיה מוגדר היטב (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: למדו לחקור תעלות יונים מכנו-רגישות בזמן אמת באמצעות תאי בודדים תחת לחץ גזירה מבוקר. שיטת תאי הזרימה המקבילים המשופצרת מאפשרת מעקב אלקטרופיזיולוגי מדויק של תגובות תאיות למכאניות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו ממומנת על ידי הלב הלאומי, ריאות, ובדם המכון (R01 HL073965, IL) ו (T32 HL007829-24, קרן הלאומית). המחברים גם רוצה להכיר את המכונה המדעית חנות באוניברסיטת אילינוי בשיקגו להפקת שלנו האחרונים שלנו לתאי זרימה.

השימוש בבעלי חיים בלימודים שלנו מאושר על ידי אוניברסיטת אילינוי בוועדת הטיפול בבעלי חיים בשיקגו (16-183).
1. הרכבת לשכת הזרם של הלוח המקביל המתוקן
הערה: נא עיין בטבלה 1 ובאיור 1 עבור מזהי החלקים הקאמריים של זרימת MPP. אנא התייחס לאיור 1 עבור סכמטי המפרט את כיוון הכלים הקאמריים להרכבה.
<ol><li>כדי לדבוק זכוכית כיסוי מלבני, פיסת D, לחלק התחתון של פיסת C, תחילה להפוך את הפתרון אלסטורר סיליקון על-ידי ערבוב ביסודיות 500 μL סיליקון אלסטוייר לריפוי סוכן לתוך 5 מ ל של בסיס אלסטומר סיליקון.</li>
	<li>להחיל שכבה דקה של הפתרון elastomer סיליקון סביב הקצוות של החלל המלבני של פיסת C ובעדינות למקם את העטיפה מלבני זכוכית פיסת D ישירות על הפתרון elastomer כגון זה חתיכת D מכסה לחלוטין את החלל מלבני פתוח של פיסת C. נגב בזהירות את התמיסה העודפת של אלסטומר סיליקון.</li>
	<li>חזור על שלב 1.2 עבור שמירה על זכוכית העטיפה המלבנית, פיסת F, לחלק התחתון של פיסת E ולאפשר פתרון אלסטונר סיליקון לריפוי בלילה בטמפרטורת החדר. הערה: לאחר שנרפא, הזכוכית המכסה מלבני יישאר במשך עד שישה חודשים לפני הצורך להיות מוחלף.</li>
	<li>החל עם פיסת החדר התחתון, חתיכת E, להרכיב את החדר לזרום MPP ידי ברציפות הצבת כל פיסת על גבי הקודם בסדר הבא: פיסה E (למטה), חתיכה C, חתיכת B, piece A (למעלה).</li>
	<li>יישר את חורי הברגים של כל חתיכה בפינות והברג בחוזקה את החלקים ביחד כדי למנוע התרחשות של דליפות בעת ניהול הזרימה אל תא זרימת MPP.</li>
</ol>2. תא הכנה וזריעה לתוך תא הזרמת MPP
הערה: בצע את שלבים 2.1-2.7 על תאי האנדותל התרבותי. בצע את השיטה המפורטת בשלבים 2.8-2.14 לבידוד תאי האנדותל מתוך ארקייד עורקי העכבר והכנת תאי האנדותל הבודדים הטריים.
<ol><li>בצלחת 6-הבאר, במקום 4 כדי 5 12 מ"מ לכסות עיגולים זכוכית/גם תאים זרע בין 10% ו 30% שטף כזה תאים בודדים ניתן לגשת עבור הקלטות אלקטרופיזיולוגיות.</li>
	<li>התאים מודניים תחת תנאי תרבות סטנדרטיים (5% CO2, 37 ° c) עבור לא פחות מ 2 h כדי לאפשר לתאים לדבוק ולא יותר 24 שעות כמו תאים אנדותל בניסיון המחברים להיות שטוח מאוד וקשה תיקון כאשר הזרע בתוך משנה שליטה עבור יותר מ -24 h.</li>
	<li>הסרת זכוכית כיסוי המכילה תאים דבק מבאר של 6-היטב צלחת, לשטוף במהירות מלוחים באגירה פוספט (PBS), ולהעביר לצלחת פטרי 35 מ"מ המכיל 2 מוצרי אמבטיה אלקטרולוגיים (שולחן 2) לפני העברה לזרימת MPP קאמרית.</li>
	<li>העבר את העיגול זכוכית המכסה את הזכוכית לכסות מלבני, פיסת D, אשר דבקה של פיסת C של תא הזרימה MPP להיות בטוח כי פתרון הולם נשאר על הזכוכית לכסות כך תאים לא להיות חשופים לאוויר. הוסף את פתרון האמבטיה הרצוי (~ 250 μL) אל התאים כך שמעגל הזכוכית והתאים המכסה שקועים לחלוטין בתמיסה.</li>
	<li>מקמו את מעגל זכוכית המכסה כך שהוא נח במחצית הקרובה בצד של מאגר הוואקום, כך תאים יהיו בקנה אחד עם פתחי החריץ של פיסת B. ודא כי מעגל כיסוי הזכוכית דבק D דרך הפתרון-הדבקה זכוכית כך יישום של הזרימה אל החדר אינה משבש את מיקומו של מעגל הזכוכית המכסה.</li>
	<li>הכנס את תא זרימת MPP על-ידי התעסקות בחלקים בסדר המתאים, כמתואר בשלבים 1.4 ו-1.5 וכמוצג באיור 1. להעביר את החדר לשלב המיקרוסקופ ומיד מיד בחדר עם פתרון אמבטיה כזה הפתרון מגיע למאגר הוואקום לשאיפה (~ 10 mL).</li>
	<li>זיהוי תא בריא לניסוי על-ידי זיהוי תא באמצעות גבול כהה וגרעין ברור. הימנע מתאים הנראים כבלתרים או תאים הנמצאים בקשר עם תאים אחרים. הערה: במעבדת המחברים, משתמשים בתאי אבי העורקים האנושיים ובתאים הראשוניים של העכבר הראשי בתרבות. עם זאת, כל סוג אחר של תא חסיד שהוא עניין צרכי מחקר ספציפיים ניתן להשתמש באותו אופן.</li>
	<li>שטוף ארקייד עורקים מבודדים בתמיסה הדיסוציאציה (שולחן 2). העבר את הארקייד לצינורית צנטריפוגה של 2 מ ל המכילה 2 מ ל של פתרון דיסוציאציה מחומם (37 ° c) (מתכון לפתרון הדיסוציאציה המוצג בטבלה 2) המכיל פרוטאז נייטרלי (0.5 Mg/ml) ו elastase (0.5 Mg/ml). דגירה של 1 h ב 37 ° צ' עם טלטול עדין כל 10 דקות.</li>
	<li>הסר 1 mL של הפתרון הניטרלי פרוטאז/elastase דיסוציאציה ולהוסיף 1 מ"ג/mL קולגן סוג 1. החזר את הפתרון הקולגן לפתרון המכיל את העורקים עבור כקולגן הסופי סוג 1 ריכוז של 0.5 mg/mL. מודקון עבור 2 עד 3 דקות ב 37 ° c.</li>
	<li>שימוש 5 מלקחיים כיתה, במהירות להעביר את הארקייד אל הצלחת פטרי 35 מ"מ המכילים ירידה של 750 μL של פתרון הדיסוציאציה רענן, מקורר. עוד לנתק את הרקמה באמצעות 2 20 G מזרק מחטים לשחרור מכני תאים אנדותל מעורקים מתעכל אנזימטי.</li>
	<li>באמצעות 9 "חד פעמי מזכוכית פסטר, קצוצות פתרון התא 10x לפני העברת התאים שפופרת חדש 1.5 mL צנטריפוגה באמצעות הזכוכית pipet.</li>
	<li>שטוף את צלחת פטרי עם עוד 750 μL של פתרון הדיסוציאציה והעבר לאותה צינורית. באמצעות הצינורות זכוכית, עוד לפזר מכנית את התאים על ידי ליטוף לפחות 10x כדי ליצור תא הבולם היחיד נזהר לא להציג בועות שעלולות לגרום נזק לשלמות התא של האנדותל.</li>
	<li>הוסף 750 μL של השעיית התא האנדותל (~ 500-1000) ישירות כדי לחלק D של תא הזרימה MPP על החצי הקרוב ביותר של ואקום בצד המאגר. אפשר לתאי האנדותל לדבוק בין 45 דקות ו-1 h בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הכנס את תא זרימת MPP על-ידי התעסקות בחלקים בסדר המתאים כמתואר בשלבים 1.4 ו-1.5 וכמוצג באיור 1. העבר את החדר לשלב המיקרוסקופ והוא מיד מבצע את החדר עם פתרון האמבטיה כך הפתרון מגיע שאיפה ואקום (~ 10 mL). זיהוי תאי האנדותל הנגישים באמצעות הפנוטיפ הגולמי והעגול שלהם19,20. הערה: מגוון שיטות עיכול וקוקטיילים אנזימים שימשו לבידוד תאי האנדותל ממיטות עורקים שונות. ראה שולחן 3 לתיאורים מפורטים של פרוטוקולים ששימשו מגוון חוקרים לבידוד תאי האנדותל לצורך הדבקת מהדק של שימוש בערוצי יון מכניקלים. שיטות אלה עשויות להתאים לשימוש בשילוב עם תא הזרימה MPP.</li>
</ol>3. שליטה במתח הטיה לחדר הזרמת MPP עבור הקלטות אלקטרופיזיולוגיות של הטיה-ערוצי יון-מכניתרגישים מופעלים
<ol><li>הגדרת מערכת הכבידה זלוף על ידי חיבור 30 mL בוגר גליל מזרק למנעול 3-way לנעול מצויד צינורות microbore (בקוטר פנימי: 0.05 אינץ ', קוטר החיצוני: 0.09 אינץ ') מתאים הכניסה לתוך החור בקוטר 3 מ"מ של פיסת a של MPP קאמרית.</li>
	<li>חברו את גליל הסיום לפנים החיצוניות של כלוב פאראדיי שמסביב למעטה האלקטרופיזיולוגיה (איור 2) תוך שימוש בטייפ דו-צידי. לפני החדרת אבובים בחדר MPP, למלא מראש את המזרק ואבובים עם פתרון אמבטיה (ראה שולחן 2 עבור הפתרון אמבטיה המשמש לחקירת מבפנים K+ ערוצים בתאי האנדותל). הכנס את הצינורות לתוך חור הזרימה של הזרם MPP של חתיכה A.</li>
	<li>טרום למלא את תא הזרימה MPP עם פתרון כזה הפתרון הוא הוסר במאגר ואקום. להפסיק לזרום לחדר ולמלא את גליל הסיום לסמן העליון. לחשב את קצב הזרימה באופן ידני על ידי מתן הפתרון לזרום דרך החדר ובאמצעות לעצור-שעון כדי לחשב mL/s בגובה מזרק שניתנו צילינדר.</li>
	<li>הרימו או הורידו את המזרק כדי לשנות את הזרימה, ובכך להטות את החדר, ולהמשיך בתהליך זה עד שתימצא רמה רצויה של מתח הטיה.</li>
	<li>חישוב לחץ הטיה בתא מקביל באמצעות המשוואה הבאה21: τ = 6μQ/h2w כאשר μ = צמיגות של נוזלים (גר'/cm · s), Q = קצב הזרימה (mL/s), ורוחב חדר הצלחת המקביל (w = 2.2 ס מ) וגובה (h = 0.1 ס מ). הערה: במערכת הכבידה הנוכחית מערכת, בגובה גליל מזרק (כפי שנמדד מראש גליל) של 57 ס מ מעל לשלב המיקרוסקופ, קצב הזרימה הוא 0.3 mL/s. ההטיה מחושבת בחדר בגובה גליל זה מזרק ושיעור הזרימה הוא 0.7 דינמיקה/cm2. כמו כן יש לציין כי מערכות פרסטזיה אחרות, כגון משאבה פריסטלטית, יכולות לשמש לשליטה בזרימה לחדר הזרימה של MPP. עם זאת, התקנים אלה עשויים להוסיף מערבולות לא רצויות ויציבות השפעה של מדידות אלקטרופיזיולוגיה בזרימה, ולכן, באמצעות מערכת הכבידה שתוארה כאן מומלץ.</li>
	<li>העבר חדר מורכב המכיל תאים הדבקה לשלב המיקרוסקופ של המתקן אלקטרופיזיולוגיה ולהכניס את האבובים מתמלא מראש עם פתרון אמבטיה לתוך החור של פיסת A. במקביל למלא את התא ולשטוף את התאים עם 10 מ ל של פתרון אמבטיה על ידי הפיכת המנעול התלת-ממדי לנעול כגון הפתרון זורם אל החדר.</li>
	<li>לאחר קביעת תצורת התיקון הרצויה מושגת בהצלחה לאפשר זרמי הערוץ לייצב באמבט סטטי בטמפרטורת החדר. פעם הזרמים התייצב, להחיל את ההטיה באופן צעד נבון המאפשר עליות בזרם לייצב לפני להגדיל את השלב הבא במתח הטיה. הערה: המחברים מוצאים את ההצלחה הגדולה ביותר עם תצורת טלאי מחורר בעת לימוד ערוצי יון מכניתפעילים בתאי האנדותל. כדי לבצע מחורר התיקון השלם בתאים, להוסיף 5 μl של 60 mg/mL מלאי אמפוריטיצין B ב diמתיל סולפוקסיד (dmso) ל 1 מ ל של 0.2 יקרומטר מסוננים ניקוי הפתרון צנרת. לאחר יצירת חותמת giga-אוהם בתצורה המצורפת לתא, מחורר את הצורה של תיקוני תאים שלמים בתוך 2 עד 5 דקות.</li>
	<li>להסיר את החשיפה הטיה לתאים על ידי עצירת זרימת לחדר לאפשר זרמים מכנימים רגישים לחזור זרמים בסיסיים נצפתה באמבט סטטי.</li>
	<li>בידוד זרמים מכונאי ערוץ יון של עניין על ידי שינוי הערכיות הפתרון (למשל, 60 mM K+ בפתרון אמבטיה עם 0 Ca2 + בתמיסה הפיפטה כדי ללמוד מבפנים K + ערוצים. Table 2 מציג מתכוני פתרון לדוגמה) ו/או עיכוב תרופתי של מקורות נוכחיים העלולים לזהם.</li>
</ol>

<ol><li>Green, D. J., Hopman, M. T., Padilla, J., Laughlin, M. H., Thijssen, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+Adaptation+to+Exercise+in+Humans%3A+Role+of+Hemodynamic+Stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Vascular Adaptation to Exercise in Humans: Role of Hemodynamic Stimuli.</a> Physiological Reviews. 97 (2), 495-528 (2017).</li>
<li>Gimbrone, M. A. Jr, Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+dysfunction%2C+hemodynamic+forces%2C+and+atherogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 902, discussion 239-240 230-239 (2000).</li>
<li>Olesen, S. P., Clapham, D. E., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haemodynamic+shear+stress+activates+a+K%2B+current+in+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haemodynamic shear stress activates a K+ current in vascular endothelial cells.</a> Nature. 331 (6152), 168-170 (1988).</li>
<li>Barakat, A. I., Lieu, D. K., Gojova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secrets+of+the+code%3A+do+vascular+endothelial+cells+use+ion+channels+to+decipher+complex+flow+signals%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Secrets of the code: do vascular endothelial cells use ion channels to decipher complex flow signals?</a> Biomaterials. 27 (5), 671-678 (2006).</li>
<li>Beech, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Piezo1+channels+as+sensors+of+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Endothelial Piezo1 channels as sensors of exercise.</a> Journal of Physiology. 596 (6), 979-984 (2018).</li>
<li>Ahn, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inwardly+rectifying+K%28%2B%29+channels+are+major+contributors+to+flow-induced+vasodilatation+in+resistance+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Inwardly rectifying K(+) channels are major contributors to flow-induced vasodilatation in resistance arteries.</a> Journal of Physiology. 595 (7), 2339-2364 (2017).</li>
<li>Fancher, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypercholesterolemia-Induced+Loss+of+Flow-Induced+Vasodilation+and+Lesion+Formation+in+Apolipoprotein+E-Deficient+Mice+Critically+Depend+on+Inwardly+Rectifying+K%28%2B%29+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Hypercholesterolemia-Induced Loss of Flow-Induced Vasodilation and Lesion Formation in Apolipoprotein E-Deficient Mice Critically Depend on Inwardly Rectifying K(+) Channels.</a> Journal of the American Heart Association. 7 (5), (2018).</li>
<li>Rode, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Piezo1+channels+sense+whole+body+physical+activity+to+reset+cardiovascular+homeostasis+and+enhance+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Piezo1 channels sense whole body physical activity to reset cardiovascular homeostasis and enhance performance.</a> Nature Communications. 8 (1), 350(2017).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Piezo1+integration+of+vascular+architecture+with+physiological+force%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Piezo1 integration of vascular architecture with physiological force.</a> Nature. 515 (7526), 279-282 (2014).</li>
<li>Levitan, I., Helmke, B. P., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chamber+to+permit+invasive+manipulation+of+adherent+cells+in+laminar+flow+with+minimal+disturbance+of+the+flow+field%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomed+Engineering%22%5BJournal%5D)">A chamber to permit invasive manipulation of adherent cells in laminar flow with minimal disturbance of the flow field.</a> Annals of Biomed Engineering. 28 (10), 1184-1193 (2000).</li>
<li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypercholesterolemia+suppresses+inwardly+rectifying+K%2B+channels+in+aortic+endothelium+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Hypercholesterolemia suppresses inwardly rectifying K+ channels in aortic endothelium in vitro and in vivo.</a> Circulation Research. 98 (8), 1064-1071 (2006).</li>
<li>Shetty, S., Weston, C. J., Adams, D. H., Lalor, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flow+adhesion+assay+to+study+leucocyte+recruitment+to+human+hepatic+sinusoidal+endothelium+under+conditions+of+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A flow adhesion assay to study leucocyte recruitment to human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of shear stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51330(2014).</li>
<li>Man, H. S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Expression+Analysis+of+Endothelial+Cells+Exposed+to+Shear+Stress+Using+Multiple+Parallel-plate+Flow+Chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e58478(2018).</li>
<li>White, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Assembly+and+Application+of+%27Shear+Rings%27%3A+A+Novel+Endothelial+Model+for+Orbital%2C+Unidirectional+and+Periodic+Fluid+Flow+and+Shear+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (116), e54632(2016).</li>
<li>Franzoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+cone-and-plate+device+for+controlled+realistic+shear+stress+stimulation+on+endothelial+cell+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Design of a cone-and-plate device for controlled realistic shear stress stimulation on endothelial cell monolayers.</a> Cytotechnology. 68 (5), 1885-1896 (2016).</li>
<li>Dewey, C. F. Jr, Bussolari, S. R., Gimbrone, M. A. Jr, Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+response+of+vascular+endothelial+cells+to+fluid+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">The dynamic response of vascular endothelial cells to fluid shear stress.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 177-185 (1981).</li>
<li>Hoger, J. H., Ilyin, V. I., Forsyth, S., Hoger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+regulates+the+endothelial+Kir2.1+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).</li>
<li>Moccia, F., Villa, A., Tanzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-activated+Na%28%2B%29and+K%28%2B%29Current+in+cardiac+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Flow-activated Na(+)and K(+)Current in cardiac microvascular endothelial cells.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 32 (8), 1589-1593 (2000).</li>
<li>Crane, G. J., Walker, S. D., Dora, K. A., Garland, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+differential+cellular+distribution+of+inward+rectifier+K+channels+in+the+rat+isolated+mesenteric+artery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Research%22%5BJournal%5D)">Evidence for a differential cellular distribution of inward rectifier K channels in the rat isolated mesenteric artery.</a> Journal of Vascular Research. 40 (2), 159-168 (2003).</li>
<li>Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+SK%28Ca%29+and+IK%28Ca%29+channels+regulate+brain+parenchymal+arteriolar+diameter+and+cortical+cerebral+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cereberal+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Endothelial SK(Ca) and IK(Ca) channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow.</a> Journal of Cereberal Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).</li>
<li>Lane, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel-plate+flow+chamber+and+continuous+flow+circuit+to+evaluate+endothelial+progenitor+cells+under+laminar+flow+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3349(2012).</li>
<li>Lieu, D. K., Pappone, P. A., Barakat, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+membrane+potential+and+ion+current+responses+to+different+types+of+shear+stress+in+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Differential membrane potential and ion current responses to different types of shear stress in vascular endothelial cells.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (6), C1367-C1375 (2004).</li>
<li>Le Master, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proatherogenic+Flow+Increases+Endothelial+Stiffness+via+Enhanced+CD36-Mediated+Uptake+of+Oxidized+Low-Density+Lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Proatherogenic Flow Increases Endothelial Stiffness via Enhanced CD36-Mediated Uptake of Oxidized Low-Density Lipoproteins.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (1), 64-75 (2018).</li>
<li>Kim, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Ion+Concentration+in+the+Unstirred+Boundary+Layer+with+Open+Patch-Clamp+Pipette%3A+Implications+in+Control+of+Ion+Channels+by+Fluid+Flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58228(2019).</li>
<li>Kim, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+flow+facilitates+inward+rectifier+K%28%2B%29+current+by+convectively+restoring+%5BK%28%2B%29%5D+at+the+cell+membrane+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Fluid flow facilitates inward rectifier K(+) current by convectively restoring [K(+)] at the cell membrane surface.</a> Scientific Reports. 6, 39585(2016).</li>
<li>Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemodynamic+shear+stress+and+its+role+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis.</a> Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).</li>
<li>Jacobs, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+activated+channels+in+cell-attached+patches+of+cultured+bovine+aortic+endothelial+cells.+Pflugers+Archiv%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Shear activated channels in cell-attached patches of cultured bovine aortic endothelial cells. Pflugers Archiv.</a> European Journal of Physiology. 431 (1), 129-131 (1995).</li>
<li>Barakat, A. I., Leaver, E. V., Pappone, P. A., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flow-activated+chloride-selective+membrane+current+in+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">A flow-activated chloride-selective membrane current in vascular endothelial cells.</a> Circulation Research. 85 (9), 820-828 (1999).</li>
<li>Fitzgerald, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+shear+stress+stimulates+vascular+smooth+muscle+cell+apoptosis+via+the+Akt+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Laminar shear stress stimulates vascular smooth muscle cell apoptosis via the Akt pathway.</a> Journal of Cellular Physiology. 216 (2), 389-395 (2008).</li>
<li>Ueba, H., Kawakami, M., Yaginuma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+as+an+inhibitor+of+vascular+smooth+muscle+cell+proliferation.+Role+of+transforming+growth+factor-beta+1+and+tissue-type+plasminogen+activator%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Shear stress as an inhibitor of vascular smooth muscle cell proliferation. Role of transforming growth factor-beta 1 and tissue-type plasminogen activator.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17 (8), 1512-1516 (1997).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

מערכת כלי הדם נחשפת כל הזמן לכוחות המטדינאמיים הפעילים, המפעילים את ערוצי היון המכניים3,22 אך התפקידים הפיזיולוגיים של הערוצים הללו בהטיה הנגרמת רק . מתחילים להופיע4,6,8 המנגנונים האחראים לרגישות המנגנון של התעלות המופעלות במתחים, נותרים בלתי ידועים. הפרוטוקול המפורט כאן מתאר את השיטה לחקירה ישירה של ערוצי יונים מכניביים החשופים למתח מאוזן בזמן אמת.
<p class="jove_co...

כוחות הומודינמיים המופקים על ידי זרימת הדם ידועים לשחק תפקידים מרכזיים בפונקציה אנדותל ובתפקוד כלי דם1,2. כמו כן ידוע גם כי מספר סוגים של ערוצי יונים בחריפות להגיב לשינויים בלחץ הטיה3,4,5 המוביל ההשערה כי ערוצי יון יכול להיות ראשי מתח להטות חיישנים. לאחרונה, אנו ואחרים הראו כי ערוצי היונים הרגישים מאוד לשחק תפקידים קריטיים בכמה פונקציות המתח להטות-לחץ רגיש, כולל התגובה vasoactive כדי להטות את הלחץ6,7,8 ואנגיוגנזה התפתחותי9. לעומת זאת, המנגנונים של רגישות ההטיה של ערוצי היונים אינם ידועים כמעט לחלוטין. פער הידע הזה עשוי להיות בשל הקושי הטכני של ביצוע הקלטות אלקטרופיזיולוגיות תחת לחץ גזירה מוגדר היטב. במאמר זה, לכן, אנו מספקים צעד אחר צעד פרוטוקול מפורט באופן שגרתי במעבדה שלנו כדי להשיג את המטרה הזאת6,7,10,11.
המטרה הכוללת של שיטה זו היא לאפשר חקירה בזמן אמת של ערוץ יון מכונאי תחת מוגדר להדגיש הטיה בטווח הפיזיולוגי. זה מושגת על ידי שינוי תא מקביל לוחית הלוח המקביל כדי לאפשר לצינורות אלקטרופיזיולוגיה להיות מופחת לתוך התאים לתאי הגישה גדל על הלוח התחתון בזמן חשיפה ממשית לזרום, מתן גישה ייחודית כדי להשיג את זה . מטרה6,7,11 לעומת זאת, תאים סטנדרטיים מקבילים לוחות הלוח, המתואר בפרסומים קודמים ניתן להשתמש עבור ניתוח הדמיה בזמן אמת של תאים חשופים כוחות הטיה12 או אחרים שאינם פולשנית גישות13,14 אבל לא עבור אלקטרופיזיולוגיה. באופן דומה, חרוט ומכשיר צלחת, עוד גישה רבת עוצמה כדי לחשוף את התאים כדי להטות את הלחץ15,16 הוא גם לא מתאים הקלטות אלקטרופיזיולוגיות. לפיכך, מתקני זרימה אלה אינם מאפשרים את החקירה של הטיית הרגישות של ערוצי יונים. הקושי בביצוע הקלטות אלקטרופיזיולוגיות מתחת לזרימה הוא הסיבה העיקרית לפאולעיר המידע על המנגנונים האחראים להשפעות הקריטיות הללו.
מבחינת הגישות החלופיות להשגת אותה מטרה, אין כאלה מדויקים או מבוקרים. כמה מחקרים קודמים ניסו להקליט את הפעילות ערוץ יון תחת הזרימה על ידי חשיפת תאים לזרם של נוזל המגיע מצינורות אחרים הביא לקרבת תא מ17,18. זה מאוד לא פיזיולוגי, כמו כוחות מכניים שנוצרו בתנאים אלה יש מעט משותף עם פרופילים פיזיולוגיים של מתח הטיה בכלי הדם. חששות דומים חלים על ניסיונות לדמות לחץ הטיה פיסיולוגיים על ידי הפרזיה של התאים הפתוחים. כפי שנדונו בפירוט במחקר המוקדם שלנו10, ממשק פתוח באוויר הנוזלי יוצר הפרעות מרובות, שאינן פיזיולוגיות. כדי לטפל בכל החששות האלה, עיצבנו לוחית מקבילית שונה (MPP) תא זרימה, המכונה גם "מכשיר הזרמת מינימלית פולשנית" במחקרים המוקדמים שלנו6,7,10,11, עשה מאקריליק ושימוש נרחב במעבדה שלנו. עם זאת, למרות העובדה כי התיאור המקורי של העיצוב פורסם כמעט לפני 20 שנה והוא מכשיר הזרימה היחיד המאפשר ביצוע הקלטות אלקטרופיזיולוגיות תחת מוגדרים היטב להדגיש הטיה, מתודולוגיה זו לא היתה שאומצה על-ידי מעבדות אחרות ויש רק מעט מחקרים שמנסים להקליט זרמים בזרם. אנו מאמינים, אפוא, כי מתן תיאור מפורט עבור שימוש בחדר הזרימה MPP יהיה לעזר רב למחקרים המעוניינים בערוצי יון ומכנירגישים וביולוגיה כלי דם.

<table><tbody><tr><td>0.2 ומיקרו; מסנני מזרק סטריליים m</td><td>VWR</td><td>28145-501</td><td>משמש לסינון תמיסת פיפטה אלקטרופיזיולוגית</td></tr><tr><td>5 מלקחיים בדרגה</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>1252-30</td><td>משמש להעברת עורקים מעוכלים לתמיסה טרייה</td></tr><tr><td>9 אינץ' פסטר פיפט</td><td>פישר Scientifc</td><td>13-678-20D</td><td>משמש לשיבוש מכני של עורקים מעוכלים והעברת תאים אנדוטליאליים מבודדים טריים&nbsp;</td></tr><tr><td>קוטר 12 מ"מ כיסוי עיגולי זכוכית</td><td>Fisher Scientifc</td><td>12-545-80</td><td>לשימוש עם מחקרים הכוללים תאים מתורבתים וטיפולים מרובים. תאים המודבקים לזכוכית הכיסוי משמשים לניתוחי מהדק תיקון</td></tr><tr><td>24 מ"מ x 40 מ"מ זכוכית כיסוי מלבנית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>CLS2975224 זכוכית כיסוי להוספת חלקי תא זרימה MPP C (איור 1)</td></tr><tr><td>24 מ"מ x 50 מ"מ זכוכית כיסוי מלבנית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS2975245</td><td>זכוכית כיסוי לתוספת לתא זרימת MPP E (איור 1)</td></tr><tr><td>מחטי מזרק 20 G</td><td>Becton Dickinson and Co</td><td>305175</td><td>לשימוש בשיבוש מכני של עורקים מזנטריים מעוכלים</td></tr><tr><td>צלחת פטרי 35 מ"מ</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-103</td><td>לשימוש בשיבוש מכני של עורקים מזנטרים מעוכלים</td></tr><tr><td>Amphotericin B מסיס</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9528-50MG</td><td>משמש ליצירת תצורת תיקון תא שלם מחורר.</td></tr><tr><td>קולגנאז, סוג I</td><td>וורת'ינגטון ביוכימי</td><td>100 מ"ג - LS004194</td><td>אנזים המשמש במעבדתנו כעיכול קצר לאחר הקוקטייל הראשוני של פרוטאז ניטרלי ואלסטאז</td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>67-68-5</td><td>ממס לאמפוטריצין B המשמש במהדק טלאי מחורר של תאים שלמים</td></tr><tr><td>אלסטאז, ליופיליזציה</td><td>וורת'ינגטון ביוכימי</td><td>25 מ"ג - LS002290&nbsp;</td><td>אנזים המשמש במעבדה שלנו בקוקטייל עם פרוטאז/דיספאז ניטרלי להתחלת עיכול העורקים לבידוד תאי אנדותל.</td></tr><tr><td>צלחת תרבית רקמות פלקון, 6 בארות, תחתית שטוחה עם מכסה אידוי נמוך&nbsp;</td><td>קורנינג</td><td>353046</td><td>לשימוש עם מחקרים הכוללים תאים מתורבתים וטיפולים מרובים</td></tr><tr><td>פרוטאז ניטרלי/דיספאז</td><td>וורת'ינגטון ביוכימי</td><td>10 מ"ג-LS02100 50 מ"ג - LS02104</td><td>אנזים המשמש במעבדה שלנו בקוקטייל עם אלסטאז להתחלת עיכול העורקים לבידוד תאי אנדותל</td></tr><tr><td>SylGard&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td>אלסטומר סיליקון להדבקת החלקת הכיסוי המלבני לחלקי תא הזרימה MPP C ו-E (איור 1)</td></tr> <tr><td>Tygon ND 10-80 צינורות</td><td>Microbore AAQ04133</td><td></td><td>מזהה: 0.05 אינץ', OD: 0.09 אינץ', צינורות זלוף כניסה לניהול זרימה לתא</td></tr></tbody></table>

הקלטות אלקטרופיזיולוגיות של זרמי יונים של תא בודד תחת לחץ הטיה מוגדר היטב

Electrophysiological Recordings of Single-cell Ion Currents Under Well-defined Shear Stress

מתח הטיית נוזלים ידוע לשחק תפקיד מרכזי בפונקציה אנדותל. ברוב מיטות כלי הדם, מתח הטיה מוגבר מגדילה חריפה בזרימת הדם מעורר אשד איתות וכתוצאה מכך ובכך מקלה על לחץ מכני על הקיר כלי הדם. הדפוס של מתח הטיה ידוע גם להיות גורם קריטי בפיתוח טרשת עורקים עם מלבינו להטות את הלחץ להיות atherop, מופרע להטות מתח להיות pro-atherגנטית. בעוד יש לנו הבנה מפורטת של מסלולים שונים של תא ביניים איתות, הקולטנים הראשונים לתרגם את הגירוי המכני לתוך מגשרים כימיים לא מובנים לחלוטין. ערוצי יונים מכניתרגישים באופן קריטי לתגובה להטיה ולוויסות איתות התא המושרה להטיה ובכך שליטה בייצור מגשרים של vasoactive. ערוצים אלה הם בין הרכיבים המוקדמים ביותר המופעל איתות כדי להטות וקושרו המושרה להטות הנגרמת באמצעות קידום הייצור תחמוצת החנקן (g., מבפנים לתקן K+ [קיר] פוטנציאל קולטן ארעי [trp] ערוצים) ו מקדם היפרפרזת היתר (למשל, קיר והפעלת סידן K+ [kca] ערוצים) ו להטות המושרה באמצעות מנגנון לא נקבע המערבת ערוצי piezo. הבנת המנגנון הביופיזיקלי שדרכו ערוצים אלה מופעלים על-ידי כוחות הטיה (כלומר, ישירות או באמצעות קולטן מכונאי ראשי) יכול לספק מטרות חדשות פוטנציאליות כדי לפתור את הפתופסולוגיה הקשורים בתפקוד האנדותל ו atherogenesis. זה עדיין האתגר העיקרי להקליט הפעלת זרימה המושרה של ערוצי יון בזמן אמת באמצעות אלקטרופיזיולוגיה. השיטות הסטנדרטיות לחשוף תאים למתח הטיה מוגדר היטב, כגון חרוט ולוחית הצלחת ומתח מקביל לוחית הלוח לא מאפשרים מחקר בזמן אמת של הפעלת ערוץ יונים. המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר תא זרימה שונה של הלוח המקביל המאפשר הקלטה בזמן אמת אלקטרופיסיולוגית של ערוצי יון מכונאי מוגדר תחת לחץ הטיה מוגדרים היטב.

תצלומים מרובים המציגים תצוגות שונות של תא הזרימה MPP על הבמה המיקרוסקופ (הפאנל העליון) וייצוג סכמטי של תא הזרימה MPP (הפאנל התחתון) מוצגים באיור 1. הסכמטי מפרט את הממדים של המתקן כולו ותאי הזרימה. איור 2 מראה תצלום של מערכת הכבידה של המערכת לחדר הזרמת MPP במעבדה שלנו (הפאנל העליון). המוצג גם הוא ייצוג סכמטי של מערכת הזרימה (הפאנל התחתון) נועד להדגיש את השלבים אשר לבודד את התאים בחדר הזרימה מן העומס של הפתרון מן המערכת זלוף ואת הכ...

המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר את חדר הזרימה המקביל של לוח הצלחת לשימוש בחקירת הפעלה בזמן אמת של ערוצי יונים מכניטיים הרגישים על ידי הטיית מתח.

Fluid shear stress is well known to play a major role in endothelial function. In most vascular beds, elevated shear stress from acute increases in blood ...

השימוש בתא זרימת הלוח המקביל שונה יכול לעזור לחוקרים לענות על שאלות מפתח הנוגעות לתגובה תפקודית של ערוצי יון מכניים כדי להפיג מתח. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לחקירה בזמן אמת להזרים תעלות יון מופעלות בתא זרימת לוח מקבילי קל להרכבה לשימוש חוזר. כדי להתחיל את ההליך, להחיל שכבה דקה של פתרון אלסטומר סיליקון סביב הקצוות של החלל המלבני של חתיכת C, בעדינות למקם את זכוכית כיסוי מלבני, חתיכת D, ישירות על פתרון אלסטומר כדי לכסות לחלוטין את החלל המלבני הפתוח של חתיכת C.בזהירות למחוק עודף סיליקון אלסטומר פתרון.לאחר מכן, חזור על ההליך להקפדה על זכוכית הכיסוי המלבנית, חתיכת F, לתחתית חתיכת E ולאפשר פתרון אלסטומר סיליקון לרפא לילה בטמפרטורת החדר. עכשיו, להרכיב את תא הזרימה MPP על ידי הצבת ברצף כל חתיכה על גבי הקודם, החל התא התחתון, חתיכה E, אז חתיכה C, חתיכה B, ואחריו חתיכה A בחלק העליון. לאחר מכן, ליישר את חורי הבורג של כל חתיכה בפינות בחוזקה לדפוק את החלקים יחד כדי למנוע דליפות להתרחש בעת מתן זרימה לתא הזרימה MPP.בצלחת שש בארות, מניחים ארבעה עד חמישה, 12 מילימטר לכסות עיגולי זכוכית בכל באר. שמור את התאים בין 10% ל- 30%confluency, כך שניתן יהיה לגשת לתאים בודדים עבור הקלטות אלקטרופיזיולוגיות. לאחר מכן, הדגירה את התאים בתנאי תרבות סטנדרטיים במשך לא פחות משעה כדי לאפשר לתאים לדבוק, ולא יותר מ 24 שעות, כמו תאים אנדותל יהפוך שטוח וקשה לתקן כאשר זרע בתת מודע במשך יותר מ 24 שעות.לאחר מכן, להסיר כיסוי המכיל את התאים דבק מ באר של צלחת שש באר במהירות לשטוף PBS. לאחר מכן, להעביר את זכוכית הכיסוי עם תאים לצלחת פטרי 35 מילימטר המכיל שני מיליליטר של פתרון BAF אלקטרופיזיולוגי. מיד להעביר את זכוכית הכיסוי עם תאים לתא הזרימה MPP.מעבירים את עיגול זכוכית הכיסוי לזכוכית הכיסוי המלבנית, חתיכת D, אשר דבק חתיכת C של תא זרימה MPP. הוסף את פתרון BAF כדי להטביע לחלוטין את מעגל הזכוכית המכסה ואת התאים. לאחר מכן, למקם את עיגול זכוכית כיסוי על חתיכת D כך התאים יהיו בקו אחד עם פתחי חריץ של חתיכת B.ודא כי מעגל זכוכית כיסוי דבק חתיכת D באמצעות הידבקות זכוכית פתרון, כדי למנוע שיבוש של המיקום של עיגול זכוכית הכיסוי על ידי יישום הזרימה.לאחר מכן, להרכיב את תא הזרימה MPP על ידי בורג החלקים יחד בסדר המתאים. מעבירים את התא לשלב המיקרוסקופ ומעבירים מיד את התא בתתא BAF. לאחר מכן, לזהות תא בריא עם גבול כהה וגרעין ברור לניסוי.הימנע מתאים שנראים כמו בלוף או תאים במגע עם תאים אחרים. כדי לשלוט בלחץ גזירה, להגדיר מערכת חיסון כבידה על ידי חיבור 30 מיליליטר סיים צילינדר מזרק למנעול לואר משולש מצויד צינורות microbore. לאחר מכן, חבר את הצילינדר המסוים לכלוב פאראדיי המקיף את אסדת האלקטרופיזיולוגיה באמצעות קלטת דו-צדדית.לפני החדרת הצינורות בתא MPP, למלא מראש את המזרק צינורות עם פתרון BAF. לאחר מכן, הכנס את הצינורות לתוך חור הכניסה תא זרימה MPP של חתיכת A.Pre-למלא את תא הזרימה MPP עם פתרון, כך שהוא מוסר במאגר ואקום. עצרו את הזרימה לתא ומילוי הצילינדר המסוים לסימן העליון.חשב את קצב הזרימה באופן ידני באמצעות שעון עצר בכך שתאפשר לפתרון לזרום דרך התא בגובה גליל מזרק נתון. הרם או הנך את המזרק כדי לשנות את הזרימה ולחשב את הלחץ הגזירה בתא מקביל באמצעות משוואה זו. חזור על תהליך זה עד שנמצאת רמה רצויה של מתח גזירה.לאחר מכן, להעביר תא מורכב המכיל תאים דבקים לשלב המיקרוסקופ של אסדת האלקטרופיזיולוגיה. ולהכניס את הצינור, מלא מראש עם פתרון BAF, לתוך החור של חתיכת A.Then, למלא את התא ולשטוף את התאים עם 10 מיליליטר של פתרון BAF, בו זמנית. לאחר שתצורת התיקון הרצויה מתקבלת בהצלחה, אפשרו לזרמים בתעלה להתייצב באמבטיה סטטית בטמפרטורת החדר.ברגע שהזרמים התייצבו, יש למרוח את ההמהר בצורה צעדית, ולאפשר לזרם המוגבר להתייצב לפני השלב הבא של עליית הלחץ. הסר את החשיפה הגזירה לתאים על ידי עצירת הזרימה לתא, המאפשר זרמי ערוץ מכני לחזור זרמים בסיסיים שנצפו באמבטיה הסטטית. מוצג כאן הוא הקלטה גולמית מייצגת של זרם קיר מתא אנדותל קסנתל עכבר ראשי עם זרם דליפה חיצונית ליניארית בולטת.רמפה של 140 עד 40 מילי-וולטים חיוביים הוחלה על התיקון מעל 400 אלפיות שנייה. זרם הדליפה מונע ניתוח של פעילות ערוץ קיר אמיתית. כדי להפחית את זרם הדליפה, חשב תחילה את מוליכות השיפוע ליניארי של זרם הדליפה.שיפוע G מרובים על ידי מתחים מתאימים של כל עקבות גלם כדי להתוות זרם דליפה על הנתונים הגולמיים. הקו צריך כיסוי הדליפה ליניארית כלפי חוץ בדיוק. לאחר מכן, הפחת את זרם הדליפה המותווה מכל העקבות כך שהזרם החיצוני ליניארי יהיה בערך אפס פיקומפר לכל פיקופראד, ו ניתן לנתח את זרם הקיר האמיתי.הדבר החשוב ביותר שיש לזכור בעת ניסיון הליך זה הוא למקם כראוי את זכוכית הכיסוי בתא, כך התאים נגישים לניסויים. בנוסף, ודא כי להחליק את הכיסוי הוא דבק כראוי חתיכת D, כך זרימת נוזלים אינו משבש את זכוכית הכיסוי המכיל תאים.

electrophysiological-recordings-single-cell-ion-currents-under-well

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

וידאו זה מציג את התהליך של כל תא מהדק הקלטות מתח הפרוסה הרשתית של נמר מימיים סלמנדרה. אנו מדגימים את הכנת הפרוסה וכן כיצד לבצע הקלטות מהדק תיקון במהלך גירוי ויזואלי של הרשתית.

שלמות התא הקלטות של אור עורר זרמים Synaptic מעוררים פורסים את רשתית

בסרטון זה, תרביות תאי כליה עובריים המבטאים חלבוני תעלות יונים תלויי אור המאוחים עם כתב פלואורסצנטי מדגימות את השפעת האור על תנועת היונים. מהדק טלאי תא שלם משמש לניטור תנועת היונים.

רישום אלקטרופיזיולוגיה אופטוגנטית של תאים עם תעלות יונים תלויות אור

אנו מתארים את ההכנה של פרוסות רשתית דקות ממימיות נמר סלמנדרות...

כל תא הקלטות בו זמנית מקולטני אור ועל נוירונים מסדר שני בהכנה פורסים רשתית אמפיבי

אנו מתארים את בידודו של myocytes פרוזדורי אדם אשר יכול לשמש לתאיים...

בידוד של myocytes פרוזדורי אדם למדידות בו זמנית של Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; ארעי וזרמים הממברנה

פרוטוקול זה מתאר צעדים פרוצדורליים בסיסיים לביצוע הקלטות תיקון- clamp כל תא. טכניקה זו מאפשרת חקר ההתנהגות החשמלית של נוירונים, וכאשר ביצע פרוסות המוח, מאפשר הערכה של פונקציות עצביים שונים מתא עצב שעדיין משולבים מעגלים במוח השתמרות טוב יחסית.

הקלטות תיקון מהדק כל תא פרוסות המוח

כתב יד זה מספק פרוטוקולים המשתמשים ב electroporation ברחם (IUE) כדי לתאר את הקישוריות המבנית של נוירונים ברמת התא בודד ועל הרגישויות של נוירונים שכותרתו fluorescently. היסטולוגיה משמש כדי לאפיין הדנדריטים ותחזיות axonal. הקלטה כל התא פרוס חריפה משמשת לחקור רגישות.

ברחם Electroporation גישות לחקר רגישות של העצבית subpopulations וקישוריות תא יחיד

כאן, אנו מתארים את השלבים החיוניים להקלטות תאים כל תיקון-קלאמפ זני הסובסטנציה gelatinosa (SG) נוירונים בתוך הפרוסה חוט שדרה במבחנה . שיטה זו מאפשרת את מאפייני קרום פנימי, הסינאפסית ואפיון מורפולוגי של ס ג נוירונים שילמדו.

הכנה של חוט השדרה חריפה פרוסות תאים כל תיקון-קלאמפ הקלטה בנוירונים הסובסטנציה Gelatinosa

מוצגת כאן שיטה לפנוטיפ מכני של תאים בודדים באמצעות פלטפורמה מיקרופלואידית מבוססת אלקטרוניקה הנקראת חישת נקבוביות מכאנו-צומת (mechano-NPS). פלטפורמה זו שומרת על תפוקה מתונה של 1-10 תאים לשנייה תוך מדידת התכונות הביופיזיות האלסטיות והצמיגיות של התאים.

חישת נקבוביות Mechano-node: פלטפורמה מהירה ונטולת תוויות למדידות ויסקואלסיות של תאים בודדים מרובי פרמטרים

פרוטוקול זה מתאר את כימות התכונות המכניות של קווי תאים סרטניים ולא סרטניים במבחנה. הבדלים שמורים במכניקה של תאים סרטניים ונורמליים יכולים לשמש כסמן ביולוגי שעשוי להיות בעל השלכות על הפרוגנוזה והאבחנה.

פרוטוקול בדיקת גזירה לקביעת תכונות חומר חד-תאי

פרוטוקול זה מתאר שיטה מהירה ויעילה לבידוד תאי שריר חלק מהעורק הבסיסי של החולדה ורישום זרמי תעלת אשלגן מיישרים פנימה בתאים אלה באמצעות טכניקת מהדק תיקון של תא שלם. הוא מציע גישה חדשה לחוקרים החוקרים את העורק הבסיסי ותעלות היונים.

רישום זרמי K+ מיישרים פנימה בתאי שריר חלק של העורקים הבסיסיים המבודדים הטריים בטכניקת Patch Clamp

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצור מכשיר מיקרופלואידית דו-שכבתי ייחודי לחקר הוויסות האלקטרומכני של הומאוסטזיס של רקמת האפיתל. המכשיר מפעיל זרמים חשמליים פיזיולוגיים סטטיים בניצב למישור הרקמה, ומשפיע על הידבקות תאים, התפשטות ושחול. הדמיית תאים חיים ומדידות מתח מכני חושפות מנגנונים של תהליכים אלה.

חשיפת בקרה אלקטרומכנית של הומאוסטזיס רקמות באמצעות מכשיר מיקרופלואידית דו-שכבתי

למדו לחקור תעלות יונים מכנו-רגישות בזמן אמת באמצעות תאי בודדים תחת לחץ גזירה מבוקר. שיטת תאי הזרימה המקבילים המשופצרת מאפשרת מעקב אלקטרופיזיולוגי מדויק של תגובות תאיות למכאניות.

הקלטות אלקטרופיזיולוגיות של זרמי יונים של תא בודד תחת לחץ הטיה מוגדר היטב

גלה סרטונים נוספים