הקלטות אלקטרופיזיולוגיות של זרמי יונים של תא בודד תחת לחץ הטיה מוגדר היטב

המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר את חדר הזרימה המקביל של לוח הצלחת לשימוש בחקירת הפעלה בזמן אמת של ערוצי יונים מכניטיים הרגישים על ידי הטיית מתח.

השימוש בתא זרימת הלוח המקביל שונה יכול לעזור לחוקרים לענות על שאלות מפתח הנוגעות לתגובה תפקודית של ערוצי יון מכניים כדי להפיג מתח. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לחקירה בזמן אמת להזרים תעלות יון מופעלות בתא זרימת לוח מקבילי קל להרכבה לשימוש חוזר. כדי להתחיל את ההליך, להחיל שכבה דקה של פתרון אלסטומר סיליקון סביב הקצוות של החלל המלבני של חתיכת C, בעדינות למקם את זכוכית כיסוי מלבני, חתיכת D, ישירות על פתרון אלסטומר כדי לכסות לחלוטין את החלל המלבני הפתוח של חתיכת C.בזהירות למחוק עודף סיליקון אלסטומר פתרון.

לאחר מכן, חזור על ההליך להקפדה על זכוכית הכיסוי המלבנית, חתיכת F, לתחתית חתיכת E ולאפשר פתרון אלסטומר סיליקון לרפא לילה בטמפרטורת החדר. עכשיו, להרכיב את תא הזרימה MPP על ידי הצבת ברצף כל חתיכה על גבי הקודם, החל התא התחתון, חתיכה E, אז חתיכה C, חתיכה B, ואחריו חתיכה A בחלק העליון. לאחר מכן, ליישר את חורי הבורג של כל חתיכה בפינות בחוזקה לדפוק את החלקים יחד כדי למנוע דליפות להתרחש בעת מתן זרימה לתא הזרימה MPP.

בצלחת שש בארות, מניחים ארבעה עד חמישה, 12 מילימטר לכסות עיגולי זכוכית בכל באר. שמור את התאים בין 10% ל- 30%confluency, כך שניתן יהיה לגשת לתאים בודדים עבור הקלטות אלקטרופיזיולוגיות. לאחר מכן, הדגירה את התאים בתנאי תרבות סטנדרטיים במשך לא פחות משעה כדי לאפשר לתאים לדבוק, ולא יותר מ 24 שעות, כמו תאים אנדותל יהפוך שטוח וקשה לתקן כאשר זרע בתת מודע במשך יותר מ 24 שעות.

לאחר מכן, להסיר כיסוי המכיל את התאים דבק מ באר של צלחת שש באר במהירות לשטוף PBS. לאחר מכן, להעביר את זכוכית הכיסוי עם תאים לצלחת פטרי 35 מילימטר המכיל שני מיליליטר של פתרון BAF אלקטרופיזיולוגי. מיד להעביר את זכוכית הכיסוי עם תאים לתא הזרימה MPP.

מעבירים את עיגול זכוכית הכיסוי לזכוכית הכיסוי המלבנית, חתיכת D, אשר דבק חתיכת C של תא זרימה MPP. הוסף את פתרון BAF כדי להטביע לחלוטין את מעגל הזכוכית המכסה ואת התאים. לאחר מכן, למקם את עיגול זכוכית כיסוי על חתיכת D כך התאים יהיו בקו אחד עם פתחי חריץ של חתיכת B.ודא כי מעגל זכוכית כיסוי דבק חתיכת D באמצעות הידבקות זכוכית פתרון, כדי למנוע שיבוש של המיקום של עיגול זכוכית הכיסוי על ידי יישום הזרימה.

לאחר מכן, להרכיב את תא הזרימה MPP על ידי בורג החלקים יחד בסדר המתאים. מעבירים את התא לשלב המיקרוסקופ ומעבירים מיד את התא בתתא BAF. לאחר מכן, לזהות תא בריא עם גבול כהה וגרעין ברור לניסוי.

הימנע מתאים שנראים כמו בלוף או תאים במגע עם תאים אחרים. כדי לשלוט בלחץ גזירה, להגדיר מערכת חיסון כבידה על ידי חיבור 30 מיליליטר סיים צילינדר מזרק למנעול לואר משולש מצויד צינורות microbore. לאחר מכן, חבר את הצילינדר המסוים לכלוב פאראדיי המקיף את אסדת האלקטרופיזיולוגיה באמצעות קלטת דו-צדדית.

לפני החדרת הצינורות בתא MPP, למלא מראש את המזרק צינורות עם פתרון BAF. לאחר מכן, הכנס את הצינורות לתוך חור הכניסה תא זרימה MPP של חתיכת A.Pre-למלא את תא הזרימה MPP עם פתרון, כך שהוא מוסר במאגר ואקום. עצרו את הזרימה לתא ומילוי הצילינדר המסוים לסימן העליון.

חשב את קצב הזרימה באופן ידני באמצעות שעון עצר בכך שתאפשר לפתרון לזרום דרך התא בגובה גליל מזרק נתון. הרם או הנך את המזרק כדי לשנות את הזרימה ולחשב את הלחץ הגזירה בתא מקביל באמצעות משוואה זו. חזור על תהליך זה עד שנמצאת רמה רצויה של מתח גזירה.

לאחר מכן, להעביר תא מורכב המכיל תאים דבקים לשלב המיקרוסקופ של אסדת האלקטרופיזיולוגיה. ולהכניס את הצינור, מלא מראש עם פתרון BAF, לתוך החור של חתיכת A.Then, למלא את התא ולשטוף את התאים עם 10 מיליליטר של פתרון BAF, בו זמנית. לאחר שתצורת התיקון הרצויה מתקבלת בהצלחה, אפשרו לזרמים בתעלה להתייצב באמבטיה סטטית בטמפרטורת החדר.

ברגע שהזרמים התייצבו, יש למרוח את ההמהר בצורה צעדית, ולאפשר לזרם המוגבר להתייצב לפני השלב הבא של עליית הלחץ. הסר את החשיפה הגזירה לתאים על ידי עצירת הזרימה לתא, המאפשר זרמי ערוץ מכני לחזור זרמים בסיסיים שנצפו באמבטיה הסטטית. מוצג כאן הוא הקלטה גולמית מייצגת של זרם קיר מתא אנדותל קסנתל עכבר ראשי עם זרם דליפה חיצונית ליניארית בולטת.

רמפה של 140 עד 40 מילי-וולטים חיוביים הוחלה על התיקון מעל 400 אלפיות שנייה. זרם הדליפה מונע ניתוח של פעילות ערוץ קיר אמיתית. כדי להפחית את זרם הדליפה, חשב תחילה את מוליכות השיפוע ליניארי של זרם הדליפה.

שיפוע G מרובים על ידי מתחים מתאימים של כל עקבות גלם כדי להתוות זרם דליפה על הנתונים הגולמיים. הקו צריך כיסוי הדליפה ליניארית כלפי חוץ בדיוק. לאחר מכן, הפחת את זרם הדליפה המותווה מכל העקבות כך שהזרם החיצוני ליניארי יהיה בערך אפס פיקומפר לכל פיקופראד, ו ניתן לנתח את זרם הקיר האמיתי.

הדבר החשוב ביותר שיש לזכור בעת ניסיון הליך זה הוא למקם כראוי את זכוכית הכיסוי בתא, כך התאים נגישים לניסויים. בנוסף, ודא כי להחליק את הכיסוי הוא דבק כראוי חתיכת D, כך זרימת נוזלים אינו משבש את זכוכית הכיסוי המכיל תאים.