Name: אפיון מוטציות הקשורות למחלות של חיל המשפחה באמצעות קבוצה של שיטות מעשיות ושימושיות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: למד אפיון מוטציות RAF הקשורות למחלות באמצעות שיטות ביוכימיות מתקדמות. טכניקות אלה כוללות מבחני קינאזה בתאים ומבחני לוציפראזה מפוצלים לזיהוי אינטראקציות חלבוניות ב-293T.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להכיר את המענק לוקמיה של תאים שעירים לתמיכה של יואן Jimin. עבודה זו נתמכה על ידי אסיה קרן מחקר הסרטן (AFCR2017/2019-JH), דוכס-נוס Khoo גשר מימון פרס (דוכס-נוס-KBrFA/2018/0014), מענק הגישור של NCFF (NCCRF YR2018-יולי-BG4), המענק של NCCRF מענק (NCCRF YR2017-יולי-PG3), ו- מענק מחקר (AM/TP011/2018).

1. מתוך שיטת חוץ גופית קינאז למדידת הפעילות הקטליטית של מוטציות חיל הים
<ol><li>בניית וקטורים קידוד מוטציות חיל הו (איור 1א) עם דגל (DYKDDDDK) תג ב C-טרמינוס על ידי שימוש בעצרת גיבסון או שיבוט המולקולרי המסורתי שיטות.
	<ol>
<li>הציגו את תג הדגל והמוטציות לתוך רצפי הקידוד של חיל הבדיקות, ולאחר מכן הכניסו רצפים שלמים לתוך pCDNA 3.1 (+) וקטור באמצעות הרכבת גיבסון או ליטל ה-DNA של T4 ובעקבות פרוטוקולי הייצור. השתמש בתנאים הבאים לתגובות ה-PCR: (1) 95 ° c, 2 דקות; (2) 95 ° c, 30 ס מ; (3) 59 ° c, 30 ס מ; (4) 68 ° c, 3 דקות; (5) 20 מחזורים של (2 עד 4); (6) החזקת 4 ° c. הערה: ה-PCR התחל לשכפול: 5-העתק של מרכז המידע-3 ו-5-4-שלושה מתוך שלוש שלוש.</li>
		<li>הכנס את רצף הקידוד של GT במעלה רצפים של קוד מוטציה של חיל ה, כדי ליצור וקטורים קידוד מוטציות התמזגו GT-מותע על ידי שימוש בשיטות אותן כמתואר בשלב 1.1.1.</li>
		<li>אמת את כל הווקטורים באמצעות הזגים של דנ א לפני ההעברה.</li>
	</ol></li>
	<li>הלוח 293T תאים ב 6-היטב צלחות בצפיפות של 5 x 105 תאים/גם יום אחד לפני הזיהום. כאשר צפיפות התא מגיע 80 ~ 90% המפגש ביום השני, transfect עם וקטורים קידוד דגל מתויג חיל השמש או המוטנטים שלהם משלב 1.1 לתוך התאים על ידי ביצוע הפרוטוקול של הייצור של ריאגנטים החצייה (טבלת חומרים).</li>
	<li>החליפו את מדיום התרבות 24 שעות לאחר החצייה.</li>
	<li>מנושף את התרבות בינונית 48 h לאחר הגידול ולהוסיף 400 μL/הבאר של מאגר לפירוק (25 מ"מ טריס · HCl, 150 מ"מ היום, 1 מ"מ מילימטר (EDTA), 0.25% NP-40, pH 7.2) שיושלם עם פרוטאז ו פוספספטאז מעכבי כדי lyse תאים על הקרח. הערה: הריכוז של NP-40 במאגר הליזה הוא קריטי לגילוי הפעילות הקטליטית של מוטציות חיל-הים הבריטי עם זיקה מתונה של דימר/יציבות בתוך מבחנה. ריכוז גבוה של חומרי ניקוי או חומר ניקוי חזק במאגר הליזה עשוי לשבור את הדימרס ובכך להרוג את הפעילות הקטליטית של החיל המלכותי או המוטציות שלהם.</li>
	<li>העבר את lysates תא לצינור 1.5 mL, ספין למטה על ידי 12,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° צ' כדי פסולת תא מרוקן.</li>
	<li>העברת 300 μL לכל מדגם של ליטים תאים שלמים נקיים לצינורות mL, 1.5 להוסיף 20 μL לכל מדגם של חרוזי אהדה נגד דגל, ולסובב בחדר קר (4 ° c) עבור 1 h. גם לקחת 40 μL לכל מדגם של התאים השלם נקי מחוץ לזיהוי הביטוי והפעילות (פוספאו-ERK1/2) של המוטציות המלכותי על ידי חיסוני כמתואר להלן.</li>
	<li>לשטוף את החרוזים נגד הדגל פעם אחת עם מאגר הליזה, ואז פעם עם מאגר התגובה קינאז (20 מ"מ HEPES, 10 מ"מ MgCl2, 0.5 mm Na3VO4, 0.5 mm dtt, pH 7.2), ולהוסיף 20 μl של תערובת התגובה קינאז (2 μg של MEK1 (K97A) ו100 μm ATP ב 20 מאגר פעולה) לכל מדגם. הערה: יש להשלים את שטיפת החרוזים בעדינות ובמהירות, החוצץ השיורי צריך להיות מוקשה לחלוטין לפני הוספת תערובת התגובה של קינאז, וכל הפעולות בשלב זה אמורות להתבצע ב -4 ° c בחדר קר.</li>
	<li>להטיל את התגובות קינאז בטמפרטורת החדר (25 ° c) עבור 10 דקות, ולהפוך את הצינורות המכילים התגובות קינאז עם אצבעות בכל דקה אחרת במהלך הדגירה.</li>
	<li>הוסף 5 μL של מאגר לדוגמה של 5x SDS (375 mM טריס · HCl, 9% נתרן dodecyl סולפט (SDS), 50% גליצרול, 0.03% ברומרופנול כחול) לכל מדגם כדי להפסיק את התגובות קינאז, ולאחר מכן לחמם את הדגימות ב 90 ° c עבור 5 דקות.</li>
	<li>הפעל את הדגימות ב 9 ~ 12% פוליאקרילמיד ג'ל אלקטרופורזה (PAGE) עם 0.1% SDS, להעביר את החלבונים כדי ניטרוגליצרין הקרום התאית, ולזהות את רמות של פוספהו-מק ו חיל המוטציות המלכותי בדגימות על ידי חיסוני. הערה: פוספהו-מק יכול גם להיות כימות באמצעות γ32P-ATP התאגדות. בקצרה, 10 μm γ32P-ATP מתווסף למאגר התגובות קינאז, וכמות ה-מק זרחנית מכמת לאחר הפרדת העמוד באמצעות האדיגרפיה האוטומטית הסטנדרטית, הפוספורימטר, או הקלוריות הנוזלית שיטות הספירה כ מתאים.</li>
</ol>2. הפעלת שיתוף הפעולה של החברה להערכת פעילות האלוסטריה של קינאז-חיל המוטציות המת
<ol><li>בניית וקטורים קידוד המקלט של חיל הנחתים המלכותי (מתחם craf קינאז עם מוטיב של נ. ת. ע בלתי ניתן לתרגום) או מפעילי החיל המלכותי המלח קינאז (חיל הנחתים קינאז, הקמת מוטיב של ת. ד. נ. ד. פ.,האיור 1א) כ מתואר בשלב 1.1.</li>
	<li>Transfect 293T תאים עם שני וקטורים קידוד הן המקלט המלכותי ואת הראשון קינאז-המלח המלכותי activator או קידוד וקטורי יחיד אחד של חלבונים כמתואר בשלבים 1.2 ו 1.3.</li>
	<li>החלף את בינונית התרבות ב 24 שעות לאחר החצייה, ו 293T הקציר הטרנספלרים ב 48 h כדי להכין את כל lysates תא כמתואר בשלבים 1.4 ו 1.5.</li>
	<li>מערבבים את התאים הנקיים שלמים עם מאגר המדגם 5x SDS במהירות בטמפרטורת החדר (25 ° c) ולאחר מכן מרתיחים ב 90 ° c עבור 5 דקות.</li>
	<li>הפעל את הדגימות תא שלם מבושל בשנת 9 ~ 12% עמוד עם 0.1% SDS, להעביר את החלבונים כדי ניטרוצלולוזה קרום, ולזהות את רמות של פוספאו-ERK1/2 וחלבונים לשלוט על ידי חיסוני.</li>
</ol>3. בחינם מפוצל לוציפראז שיטת למדידת אהדה Dimer היחסי/יציבות של חיל המוטציות
<ol><li>בניית וקטורים קידוד דגל-מתויג חיל המוטאס מוטציות התמזגו N-טרמינוס של Nluc (N-טרמינוס של גחלילית לוציפראז, aa2-416) או C-טרמינוס של Cluc (C-טרמינוס של גחלילית לוציפראז, aa398-550) כמתואר בשלב 1.1.</li>
	<li>Transfect 293T תאים עם זוג וקטורים קידוד שונים Nluc-המוטנטים מוטציות ו Cluc-חיל המוטציות כמתואר בשלב 1.2.</li>
	<li>ב -24 שעות לאחר החצייה, replate 293T מעבר תאים לתוך לוחות תמונה שחורה שחור בצפיפות התא של 2x105 לכל טוב עם בינונית ללא צבע (כלומר, DMEM גברת ללא פנול אדום).</li>
	<li>24 שעות מאוחר יותר, להוסיף D-לluciferin (0.2 mg/mL) 293T הטרנספררים תא, מודטה עבור 30 דקות, ולמדוד את האותות לוציפראז באמצעות מערכת זיהוי רב (טבלת חומרים).</li>
	<li>לאחר מדידת אותות לוציפראז, מתיף את המדיום ואת lyse 293T הטרנספררים עם מאגר לפירוק להכין את כל lysates תא כמתואר בשלבים 1.4 ו 1.5.</li>
	<li>הפעל את כל הדגימות של התא בתוך 9 ~ 12% עמוד עם 0.1% SDS ולזהות את רמות הביטוי של מוטציות Nluc-חיל ה, מוטציות Cluc-חיל ידי אנטי דגל כמתואר בשלב 2.5. רמות הביטוי היחסיות הן של המוטציות Nluc-סי והן של המוטציות ה-Cluc-293T מוטצות באמצעות התמונה J מתוך הכתמים האימונוגנטים שלהם.</li>
	<li>לנרמל את האותות לוציפראז של 293T תא הטרנספררים על פי רמות הביטוי של המוטציות Nluc-חיל ו מוטציות Cluc-. בקצרה, זה מושגת על ידי חלוקת האות הלוציפראז raw על ידי רמות הביטוי היחסי של מוטציות Nluc-חיל ה, מוטציות Cluc-חיל משלב 3.6.</li>
</ol>

<ol><li>Chong, H., Vikis, H. G., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+regulating+the+Raf+kinase+family%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Signalling%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of regulating the Raf kinase family.</a> Cellular Signalling. 15 (5), 463-469 (2003).</li>
<li>Wellbrock, C., Karasarides, M., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RAF+proteins+take+center+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The RAF proteins take center stage.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (11), 875-885 (2004).</li>
<li>Baccarini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+nature%3A+biological+functions+of+the+Raf-1+%22kinase%22%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letter%22%5BJournal%5D)">Second nature: biological functions of the Raf-1 "kinase".</a> FEBS Letter. 579 (15), 3271-3277 (2005).</li>
<li>Lavioe, H., Therrien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+RAF+protein+kinases+in+ERK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of RAF protein kinases in ERK signaling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (5), 281-298 (2015).</li>
<li>Schreck, R., Rapp, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raf+kinases%3A+oncogenesis+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Raf kinases: oncogenesis and drug discovery.</a> International Journal of Cancer. 119 (10), 2261-2271 (2006).</li>
<li>Roberts, P. J., Der, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+Raf-MEK-ERK+mitogen-activated+protein+kinase+cascade+for+the+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Targeting the Raf-MEK-ERK mitogen-activated protein kinase cascade for the treatment of cancer.</a> Oncogene. 26 (22), 3291-3310 (2007).</li>
<li>McCubrey, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+the+Raf%2FMEK%2FERK+pathway+in+cell+growth%2C+malignant+transformation+and+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+Biophysics+Acta%22%5BJournal%5D)">Roles of the Raf/MEK/ERK pathway in cell growth, malignant transformation and drug resistance.</a> Biochemistry Biophysics Acta. 1773 (8), 1263-1284 (2007).</li>
<li>Schubbert, S., Shannon, K., Bollag, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperactive+Ras+in+developmental+disorders+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Hyperactive Ras in developmental disorders and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 7 (4), 295-308 (2007).</li>
<li>Davies, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+of+the+BRAF+gene+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mutations of the BRAF gene in human cancer.</a> Nature. 417 (6892), 949-954 (2002).</li>
<li>Garnett, M. J., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guilty+as+charged%3A+B-RAF+is+a+human+oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Guilty as charged: B-RAF is a human oncogene.</a> Cancer Cell. 6 (4), 313-319 (2004).</li>
<li>Pandit, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gain-of-function+RAF1+mutations+cause+Noonan+and+LEOPARD+syndromes+with+hypertrophic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Gain-of-function RAF1 mutations cause Noonan and LEOPARD syndromes with hypertrophic cardiomyopathy.</a> Nature Genetics. 39 (8), 1007-1012 (2007).</li>
<li>Mason, C. S., Springer, C. J., Cooper, R. G., Superti-Furga, G., Marshall, C. J., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serine+and+tyrosine+phosphorylations+cooperate+in+Raf-1%2C+but+not+B-Raf+activation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Serine and tyrosine phosphorylations cooperate in Raf-1, but not B-Raf activation.</a> EMBO Journal. 18 (8), 2137-2148 (1999).</li>
<li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+activation+of+functionally+asymmetric+RAF+kinase+dimers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Allosteric activation of functionally asymmetric RAF kinase dimers.</a> Cell. 154 (5), 1036-1046 (2013).</li>
<li>Desideri, E., Cavallo, A. L., Baccarini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alike+but+different%3A+RAF+paralogs+and+their+signaling+outputs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Alike but different: RAF paralogs and their signaling outputs.</a> Cell. 161 (5), 967-970 (2015).</li>
<li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dimer-dependent+catalytic+activity+of+RAF+family+kinases+is+revealed+through+characterizing+their+oncogenic+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The dimer-dependent catalytic activity of RAF family kinases is revealed through characterizing their oncogenic mutants.</a> Oncogene. 37 (43), 5719-5734 (2018).</li>
<li>Wan, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+activation+of+the+RAF-ERK+signaling+pathway+by+oncogenic+mutations+of+B-RAF%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanism of activation of the RAF-ERK signaling pathway by oncogenic mutations of B-RAF.</a> Cell. 116 (6), 855-867 (2004).</li>
<li>Shaw, A. S., Kornev, A. P., Hu, J., Ahuja, L. G., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinases+and+pseudokinases%3A+lessons+from+RAF%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Kinases and pseudokinases: lessons from RAF.</a> Molecular and Cellular Biology. 34 (9), 1538-1546 (2014).</li>
<li>Taylor, S. S., Shaw, A. S., Hu, J., Meharena, H. S., Kornev, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudokinases+from+a+structural+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Pseudokinases from a structural perspective.</a> Biochemistry Society Transactions. 41 (4), 981-986 (2013).</li>
<li>Rajakulendran, T., Sahmi, M., Lefrançois, M., Sicheri, F., Therrien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dimerization-dependent+mechanism+drives+RAF+catalytic+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A dimerization-dependent mechanism drives RAF catalytic activation.</a> Nature. 461 (7263), 542-545 (2009).</li>
<li>Heidorn, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinase-dead+BRAF+and+oncogenic+RAS+cooperate+to+drive+tumor+progression+through+CRAF%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Kinase-dead BRAF and oncogenic RAS cooperate to drive tumor progression through CRAF.</a> Cell. 140 (2), 209-221 (2010).</li>
<li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+mutations+in+MEK1+enhance+homodimerization+and+promote+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Activating mutations in MEK1 enhance homodimerization and promote tumorigenesis.</a> Science Signaling. 11 (554), 6795(2018).</li>
<li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+AMPK+inhibitor+overcomes+the+paradoxical+effect+of+RAF+inhibitors+through+blocking+phospho-Ser-621+in+the+C+terminus+of+CRAF%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The AMPK inhibitor overcomes the paradoxical effect of RAF inhibitors through blocking phospho-Ser-621 in the C terminus of CRAF.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (37), 14276-14284 (2018).</li>
<li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinase+regulation+by+hydrophobic+spine+assembly+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Kinase regulation by hydrophobic spine assembly in cancer.</a> Molecular and Cellular Biology. 35 (1), 264-276 (2015).</li>
<li>Poulikakos, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAF+inhibitor+resistance+is+mediated+by+dimerization+of+aberrantly+spliced+BRAF%28V600E%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RAF inhibitor resistance is mediated by dimerization of aberrantly spliced BRAF(V600E).</a> Nature. 480 (7377), 387-390 (2011).</li>
<li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+that+blocks+ATP+binding+creates+a+pseudokinase+stabilizing+the+scaffolding+function+of+kinase+suppressor+of+Ras%2C+CRAF+and+BRAF%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mutation that blocks ATP binding creates a pseudokinase stabilizing the scaffolding function of kinase suppressor of Ras, CRAF and BRAF.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6067-6072 (2011).</li>
<li>Taylor, S. S., Kornev, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinases%3A+evolution+of+dynamic+regulatory+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochemistry+Sciences%22%5BJournal%5D)">Protein kinases: evolution of dynamic regulatory proteins.</a> Trends Biochemistry Sciences. 36 (2), 65-77 (2011).</li>
<li>Farrar, M. A., Alberol-Ila, J., Perlmutter, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+Raf-1+kinase+cascade+by+coumermycin-induced+dimerization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin-induced dimerization.</a> Nature. 383 (6596), 178-181 (1996).</li>
<li>Luo, Z., Tzivion, G., Belshaw, P. J., Vavvas, D., Marshall, M., Avruch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+activates+c-Raf-1+through+a+Ras-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oligomerization activates c-Raf-1 through a Ras-dependent mechanism.</a> Nature. 383 (6596), 181-185 (1996).</li>
<li>Weber, C. K., Slupsky, J. R., Kalmes, H. A., Rapp, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+Ras+induces+heterodimerization+of+cRaf+and+BRaf%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Active Ras induces heterodimerization of cRaf and BRaf.</a> Cancer Research. 61 (9), 3595-3598 (2001).</li>
<li>Garnett, M. J., Rana, S., Paterson, H., Barford, D., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild-type+and+mutant+B-RAF+activate+C-RAF+through+distinct+mechanisms+involving+heterodimerization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Wild-type and mutant B-RAF activate C-RAF through distinct mechanisms involving heterodimerization.</a> Molecular Cell. 20 (6), 963-969 (2005).</li>
<li>Hatzivassiliou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAF+inhibitors+prime+wild-type+RAF+to+activate+the+MAPK+pathway+and+enhance+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth.</a> Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).</li>
<li>Poulikakos, P. I., Zhang, C., Bollag, G., Shokat, K. M., Rosen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAF+inhibitors+transactivate+RAF+dimers+and+ERK+signalling+in+cells+with+wild-type+BRAF%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RAF inhibitors transactivate RAF dimers and ERK signalling in cells with wild-type BRAF.</a> Nature. 464 (7287), 427-430 (2010).</li>
<li>Kolch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meaningful+relationships%3A+the+regulation+of+the+Ras%2FRAF%2FMEK%2FERK+pathway+by+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+Journal%22%5BJournal%5D)">Meaningful relationships: the regulation of the Ras/RAF/MEK/ERK pathway by protein interactions.</a> Biochemistry Journal. 351, Pt 2 289-305 (2000).</li>
<li>Cseh, B., Doma, E., Baccarini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22RAF%22+neighborhood%3A+protein-protein+interaction+in+the+Raf%2FMek%2FErk+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">"RAF" neighborhood: protein-protein interaction in the Raf/Mek/Erk pathway.</a> FEBS Letters. 588 (15), 2398-2406 (2014).</li>
<li>García-Gómez, R., Bustelo, X. R., Crespo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-Protein+Interactions%3A+Emerging+Oncotargets+in+the+RAS-ERK+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cancer%22%5BJournal%5D)">Protein-Protein Interactions: Emerging Oncotargets in the RAS-ERK Pathway.</a> Trends Cancer. 4 (9), 616-633 (2018).</li>
<li>Luker, K. E., Smith, M. C., Luker, G. D., Gammon, S. T., Piwnica-Worms, H., Piwnica-Worms, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+regulated+protein%E2%80%93protein+interactions+revealed+with+firefly+luciferase+complementation+imaging+in+cells+and+living+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Kinetics of regulated protein–protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (33), 12288-12293 (2004).</li>
<li>Chen, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+BRAF+deletions+that+function+as+homodimers+and+are+sensitive+to+inhibition+by+RAF+dimer+inhibitor+LY3009120%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Oncogenic BRAF deletions that function as homodimers and are sensitive to inhibition by RAF dimer inhibitor LY3009120.</a> Cancer Discovery. 6 (3), 300-315 (2016).</li>
<li>Foster, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+mechanism+of+oncogenic+deletion+mutations+in+BRAF%2C+EGFR%2C+and+HER2%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Activation mechanism of oncogenic deletion mutations in BRAF, EGFR, and HER2.</a> Cancer Cell. 29 (4), 477-493 (2016).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

במאמר זה, הצגנו שלוש שיטות לאפיון מוטציות הקשורות למחלות, אשר כוללות את שיטת הפעולה הבין-גופית, שיתוף הפעולה של החיל המלכותי הבריטי ושיטת לוציפראז מפוצלת בחינם. מאז חיל הים הבריטי יש גם פעילות קטליטית ו אלוסטריה פעילות, מוטציות מסוגים שונים של חיל הים יכול להפעיל את הזרם איתות דרך שני מנגנונים ברורים13,14,16,17 , 18. המוטנטים הפעילים מבחינה חוקתית באופן ישיר מ...

משפחת חיל-ההים הבריטי מהווה רכיב מרכזי בדירוג של ras/מק מ, אשר משדרים אות מראס כדי להפעיל את מיאוגן-פרוטאין קינאז (מק ג)1,2,3,4. משפחה זו של קינסים משחק תפקיד מכריע צמיחת תאים, הישרדות ובידול, ושינויים שלהם לגרום למחלות רבות, בעיקר סרטן5,6,7,8. לאחרונה, הסקוויה גנומית זיהה מוטציות רבות הקשורות למחלות חיל הים המוצג מאפיינים שונים בשידורי האות של ראס/מט/מק/שמונה מדורגת9,10,11. אפיון קפדני של מוטציות החיל הרחב יעזור לנו להבין את המנגנונים המולקולריים של כיצד מוטציות חיל הדרכים לשנות את תפוקת האות של RAS/הפלא/מק/לבין המפל, בסופו של דבר לבחור גישות מתאימות לטיפול במחלות שונות בעלי מוטציות של חיל הים.
כולל שלושה חברים, craf, braf, ו araf, אשר יש מבנים מולקולריים דומים אבל יכולות שונות כדי להפעיל את הזרם איתות1,2,3,4. בקרב הפראלוגים הללו, בראב יש את הפעילות הגבוהה ביותר בזכות המוסריות החוקתית של נ. ת. ע. (N-tמ acidic)12,13,14, בעוד araf יש את הנמוך ביותר פעילות הנובעת מוטיב APE לא קאנוני15. זה עשוי להסביר את תדרי מוטציה שונים של חיל הים paralogs במחלות: BRAF > CRAF > ARAF. יתר על כן, בתוך אותו paralog החיל המלכותי הבריטי, מוטציות באתרים שונים עלולים לעורר אותות במורד הזרם באופן מובהק, אשר מוסיף שכבת מורכבות נוספת לוויסות משפחת חיל-החוץ. מחקרים שנעשו לאחרונה הוכיחו כי כל מדעי החיל יש הן קטליטי ו אלוסטריה פעילויות13,14,16,17,18. מוטציות של חיל-הקצה הפעיל מבחינה חוקתית מפעילים את המטה איתות ישירות על-ידי מק זרחנית, בעוד שמוטציות מסוג קינאז-מתים מסוגלים להפעיל את עמיתיהם הפראיים באמצעות הדימריזציה מצד לצד ולהפעיל איתות של מק-טיפשה באורך16 ,19,20. האהדה והיציבות של דימר הוא פרמטר מפתח שלא רק קובע את הפעילות האלומית של המוטציות המתות-מוות של קינאז, אלא גם משפיע על הפעילות הקטליטית של מוטציות מוטאיות באופן קונסטיטואליות15,21, 22. המוטנטים בעלי החיים המתים בקינאז עם זיקה דימר גבוהה/יציבות יכולים להפעיל את הרדוגני בעלי סוג פראי באופן ישיר15, בעוד אלה עם זיקה דיימר ביניים/יציבות דורש תיאום של ראס פעיל או מ רמה גבוהה של מולקולות חיל הפרא מסוג פראי לתפקד13,15,20,21,23. באופן דומה, המוטנטים הפעילים ביותר של חיל-החוץ הינם בעלי התלות העצמית של המאה התשעים, ואלה עם אהדה מזיקה נמוכה/יציבות מאבדים את פעילות הקטליטית שלהם בimmunoprecipitation שוברת את החלשים של חיל הה14, 21,22. הזיקה הדימאר/יציבות קובעת גם את רגישות המוטציות של חיל ה, המוטאנטים, ומהווה באופן חיובי את העמידות של מעכבי החיל המלכותי24. לכן, כדי לאפיין את המוטציות הקשורות במחלות, יש למדוד את פעילותם הקטליטית והאלוסטרואית, ואהדה ויציבות.
בשנים האחרונות, המעבדה שלנו ואחרים פיתחו שיטות שונות כדי לאפיין את הקינטיות של משפחת חיל הו ואת המוטציות שלהם. על-פי המעבדה שלנו והניסיון של אחרים, אנו סבורים ששלושת הנושאים הבאים מחייבים יתרונות בהגדרת מוטציות של חיל-החוץ הבריטי: (1) בשיטת הספז שניתן לבצע בקלות כדי לזהות את הפעילות הקטליטית של החוקה המוטנטים הפעילים בחיל המלכותי15; (2) הפעלה משותפת שיתוף הפעולה הינה שיטה אמינה ונוחה כדי למדוד את הפעילות אלוסטריה של המוטנטים המתים של קינאז,13,15,21,22,23, עשרים וחמש; (3) מפוצל לוציפראז מפוצלת שהוא בעל רגישות גבוהה הרבה יותר במדידת אהדה דיימר יחסי/יציבות של מוטציות חיל ההים הבריטי בניגוד לimmunoprecipitation המסורתית שיתוף, והוא מסוגל לבצע ללא ציוד מתקדם ב בניגוד לשיטות אנליטיות כמותיים כגון spr (Surface Pלזניה Resonance) ניתוח15,22. שילוב שלושת הנושאים האלה, אנו יכולים להבין בקלות כיצד מוטציה הקשורות במחלות חיל הזרם משנה את איתות במורד ובכך לנצל את האסטרטגיה הטיפולית המתאימה לטיפול במחלה הנגרמת על ידי המוטציה הזאת חיל הים.

<table><tbody><tr><td>אנטי-פוספוERK1/2</td><td>טכנולוגיות איתות תאים</td><td>4370</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-פוספוMEK1/2</td><td>טכנולוגיות איתות תאים</td><td>9154</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-ERK1/2</td><td>AB שיבוט</td><td>A0229</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-MEK1/2</td><td>טכנולוגיות איתות תאים</td><td>9124</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-FLAG (עכבר)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-HA</td><td>Novus Biologicals</td><td>MAB6875</td><td></td></tr><tr><td>anti-FLAG (ארנב)</td> <td>Cell Signaling Technologies</td><td>14793</td><td></td></tr><tr><td>anti-&beta;-actin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2228</td><td></td></tr><tr><td>חרוזים נגד FLAG (M2)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A4596</td><td></td></tr><tr><td>HRP מצומד נגד עכבר IgG</td><td>Jackson Laboratories</td><td>115-035-003</td><td></td></tr><tr><td>HRP מצומד מעבדות IgG ג'קסון נגד ארנב</td><td></td><td>111-035-144</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1(+)</td><td>בvitrogen</td><td>V79020</td><td></td></tr><tr><td>שיבוט הרכבה גיבסון&nbsp; ערכה</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>E5510</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>ליפופקטמין 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Fugene 6</td><td>Roche</td><td>11 814 443 001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM w/o פנול אדום</td><td>Invitrogen</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>D-luciferin&nbsp;</td><td>GoldBio</td><td>LUCK-100</td><td></td></tr><tr><td>6xhis-tagged MEK1 (K97A)</td><td>&nbsp; הוכן בלימודינו הקודמים</td><td>נ.א.</td><td>התייחסות 15.</td></tr><tr><td>מערכת גילוי GloMax-Multi.</td><td>פרומגה</td><td>E7041</td><td></td></tr></tbody></table>

אפיון מוטציות הקשורות למחלות של חיל המשפחה באמצעות קבוצה של שיטות מעשיות ושימושיות

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

במהירות מואצת פיברוסרקומה (חיל הים) המשפחה משחק תפקיד מרכזי בביולוגיה התא ותפקוד שלהם מוביל סרטן הפרעות התפתחותיות. אפיון של מוטציות הקשורות למחלות, יסייעו לנו לבחור אסטרטגיות טיפוליות מתאימות לטיפול במחלות אלה. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי משפחת החיל המלכותי מקיימים פעילויות קטליטי ו אלוסטריה, אשר מוסדרים באופן הדוק על ידי דימרזציה. כאן, בנינו קבוצה של שיטות מעשיות ובעלות הבנה כדי לקבוע את הפעילויות הקטליטיות והאלוסטרואיות והאהדה היחסית/יציבות של משפחת חיל-החוץ והמוטציות שלהם. ראשית, תוקנו הקלאסי בתוך שיטת החוץ מבחנה על ידי הפחתת הריכוז של חומרי ניקוי במאגרים, ניצול הליך שטיפה עדין מהיר, ושימוש בפיוז של גלוטתיון S-transferase (GT) כדי למנוע מהחיל המלכותי לנתק במהלך טיהור. הדבר מאפשר לנו למדוד את הפעילות הקטליטית של מוטציות באופן מכונן, הפועלים כראוי. שנית, פיתחנו רומן הפעלה שיתוף הספר של חיל הם כדי להעריך את הפעילות אלוסטריה של המוטציות המלח מתים של קינאז באמצעות N-terminal החלבונים מעוגלים, ביטול הדרישה של ראס פעיל בפרוטוקולים הנוכחיים ובכך להשיג גבוה יותר רגישות. לבסוף, יצרנו ייחודי מפוצל לוציפראז המשלים למדוד את היחס היחסי דיימר/יציבות של המוטציות השונות של חיל ההים, אשר אמין יותר ורגיש לעומת הimmunoprecipitation המסורתית שיתוף. לסיכום, לשיטות אלה יש את היתרונות הבאים: (1) ידידותי למשתמש; (2) מסוגל לבצע ביעילות ללא ציוד מתקדם; (3) חסכוני; (4) מאוד רגיש ומלא הבחנה.

משפחת חיל-ההים הבריטי הינם בעלי פעילויות קטליטי ו-אלוסטריה, המאפשרות למוטציות הקשורות במחלות שלהם להפעיל את איתות הזרם דרך מנגנונים שונים13,14,16,17 ,18. המוטנטים הפעילים מבחינה חוקתית באופן ישיר מזטים את מצעים שלהם, בעוד המוטציות המתות-ה, ממלאות את תפקידם באמצעות הפעלת מקבילים מסוג פראי. כפי שמוצג באיור 1ב', הן ...

במאמר זה, הצגנו מערכת של שיטות מעשיות ושימושיות לאפיון מוטציות הקשורות למחלות של משפחת חיל-החוץ, הכוללים בתוך שיטת ההפעלה המבחנה, שיתוף הפעולה של החיל המלכותי הבריטי, ובחינה משלימה של פיצול לוציפראז.

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

שיטה זו מקלה על האפיון היעיל של שיטות הקשורות למחלות הקשורות לחיל האוויר המלכותי. טכניקה זו רגישה מאוד ובלתי ניתנת לשחזור, חסכונית, ידידותית למשתמש, ואינו דורש ציוד מתקדם. כדי למדוד את הפעילות הקטיטית של מוטציות חיל האוויר המלכותי, הכניסו מוטציות טכנולוגיות דגל לרצף הקידוד של חיל האוויר המלכותי על ידי PCR, לפני הכנסת רצפים שלמים לווקטור המתאים על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.הכנס את הגלוטתיון כרצף קידוד transferase במעלה הזרם של רצפי קידוד מוטנטים RAF, כדי ליצור וקטורים קידוד גלוטתיון כמו transferase התמזגו מוטציות חיל האוויר המלכותי, באותו אופן. חוצים 80%-90%confluent 293T תרבויות תאים עם הווקטורים קידוד הדגל מתויגים KINASEs חיל האוויר המלכותי או המוטנטים שלהם, על פי פרוטוקולי סטנדרטים. לאחר 24 שעות של תרבות, להחליף את המדיום בכל תרבות.לאחר 48 שעות של תרבות, להוסיף 400 microliters של חיץ תיזה בתוספת מעכבי פרוטאז ופוספטאז, לכל באר על קרח. לאחר חמש עד 10 דקות להעביר את התא lysates לצינור 1.5 מיליליטר עבור צנטריפוגה כדי להכביד על פסולת התא. להעביר 300 microliters של כל מדגם לתוך צינורות בודדים 1.5 מיליליטר מיקרו צנטריפוגה.הניחו בצד 40 מיקרוליטרים לדגימה עבור lysate מאובנים סיטונאיים במורד הזרם אותות תאיים נוספים מוסדר קינאז אחד ושתיים ביטוי ופעילות ניתוח כתם אמינו. הוסיפו 20 מיקרוליטרים של בחנורי זיקה נגד דגל לכל צינור, לדגירה של שעה עם סיבוב בחדר קר של ארבע מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה במהירות בעדינות לשטוף את גם נגד דגל פעם אחת עם חיץ תזה בחדר הקר ופעם אחת עם חיץ תגובת קינאז לפני הוספת 20 microliters של תערובת תגובת קינאז.מוטנטים גרף עם זיקה דימה נמוכה עלולים לאבד את הפעילות הקטלטית שלהם במבחנה בגלל דיסוציאציה דימה. לכן, הכביסה המהירה והעדינה היא קריטית. לאחר 10 דקות בטמפרטורת החדר עם היפוך כל דקה שנייה, לעצור את התגובות קינאז עם חמישה microliters של חמישה חיץ מדגם XSDS, לכל מדגם להרתיח את הדגימות ב 90 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.בסוף הדגירה, הפעל את הדגימות על ג'ל אלקטרופורזה פוליאקרילמיד 9 עד 12% עם 0.1% SDS, ולאחר מכן העבר את החלבונים לממברנה ניטרוסלולוס כדי לאפשר זיהוי של רמות קינאז חלבון המופעל על ידי זרחן ו- RAF בכל דגימה, על ידי נפיחות חיסונית. כדי להעריך את הפעילות Allosteric של מוטציות חיל האוויר המלכותי מת kinase, לבנות וקטורים קידוד מקלט חיל האוויר המלכותי או מפעילי חיל האוויר המלכותי מת kinase. רוחב 293 תאי T עם שני וקטורים המנקים הן את מקלט חיל האוויר המלכותי והן את מפעיל חיל האוויר המלכותי המת kinase, או וקטור יחיד הממקד את אחד החלבונים כפי שהוכח.לקצור את התא כולו lysates לאחר 48 שעות של תרבות כפי שהוכח, במהירות לערבב את התא כולו נקי lysate עם חמישה חיץ מדגם XSDS בטמפרטורת החדר, לפני רותחים את lysates במשך חמש דקות ב 90 מעלות צלזיוס. לאחר מכן להפעיל את כל התא מבושל lysate דגימות על 9 עד 12%polyacrylamide אלקטרופורזה ג'ל זה 0.1% SDS ולהעביר את החלבונים קרום nitrocellulose לגילוי רמות של פוספו אותות סלולריים נוספים מוסדר קינאז אחד ושתיים ולשלוט חלבונים על ידי כתמים חיסוניים כפי שהוכח. כדי למדוד את הזיקה העמומה יחסית ואת היציבות של מוטציות חיל האוויר המלכותי לבנות וקטורים קידוד דגל טק טיוטה מוטנטים התמזגו לטרמינוס של Firefly luciferase או C Terminus לוציפראז גחליל אש.Transvect 293 תאי T עם זוג וקטורים קידוד שונה ו Terminus של מוטציות חיל האוויר המלכותי גחליל לוציפראז ו C Terminus מוטציות חיל האוויר המלכותי גחליל כפי שהודגם. 24 שעות לאחר טרנסווט replate פעמיים 10 כדי החמישי 293 עסקאות תא T לתוך גם לתוך לוחות תמונה שחור קריסטל במדיום צבע חינם. 48 שעות לאחר transvestion להוסיף את luciferin כדי 293 T רוחבי תא דגירה במשך 30 דקות.לפני מדידת אותות הלוציפראז במערכת זיהוי מרובה. בסוף המדידה שאפו את העל-טבעיים, והתעלו על תאי 293 T המהומשים עם מאגר ליזות כפי שהוכח. הפעל את כל תא lysate דגימות על ג'ל אלקטרופורזה 9 עד 12%polyacrylamide עם 0.1%SDS.לזהות את רמות הביטוי של שליחות קטלנית של מוטציות חיל האוויר המלכותי פיירפלי לוציפראז, או את המינוח C של מוטציות RAF פיירפליי לוציפראז על ידי כתם אמינו אנטי דגל כפי שהוכח. ואז לנרמל את אותות luciferase של 293 T transvectants תא על פי רמות הביטוי של שליחות הסופית של Firefly luciferase ו C שליחות קטלנית של מוטציות חיל האוויר המלכותי פיירפלי לוציפראז. ניתן להשתמש ב- in vitro kinase asa כדי לחקור ביעילות את הפעילות הקטליטית של כמה מוטנטים פעילים R-spine, אך לא של מוטציות מתות קינאז עם עמוד שדרה C מותך.הפעילות הקטאליטית של מוטציות חיל האוויר המלכותי פעילים באופן מכונן עם זיקה עמומה חלשה או יציבות עם זאת, לא יכול להיות נבדק באמצעות אס"א זה כמו עמעום שלהם שבורים במהלך תהליך הטיהור. כדי למנוע אובדן של פעילות קטיטית של מוטציות חיל האוויר המלכותי עם זיקה עמומה חלשה או יציבות, מוטנטים אלה יכולים להיות התמזגו עם העברת glutothionas כדי להציל את הפעילות הקטיטית של המוטנטים. ASA שיתוף הפעלה חיל האוויר המלכותי יכול לשמש כדי להעריך את הפעילות allosteric של מוטציות חיל האוויר המלכותי מת קינאז.כפי שמודגם מוטציות מתות קינאז עם מוטיב מסוף קצה חומצי והיתוך עמוד השדרה C, לתפקד כמפעילים allosteric לעורר את הפעילות הקטלטית של מוטנטים עם מוטיב מסוף קצה חומצי שאינו זרחן, כאשר co לידי ביטוי בתאי 293T. עוד יותר לוציפראז פיצול חינם SA יכול לשמש למדידת הזיקה העמומה יחסית או יציבות של kinases משפחת חיל האוויר המלכותי ואת המוטנטים שלהם. שימוש במאגר ליססה עם ריכוז נמוך של חומר ניקוי, והליך שטיפה עדין ומהיר במהלך טיהור הדגימה חיוני ל- SA מוצלח במבחנה. טכניקה זו תסייע לחוקרים לקבוע בדיוק כיצד המחלה מעבירה את המוטנטים של חיל האוויר המלכותי, מפעילה את מסלול במורד הזרם, ומקלה על בחירת אסטרטגיות טיפוליות מתאימות לטיפול במחלות.

characterize-disease-related-mutants-raf-family-kinases-using-set

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

קינאז leucine חזור ריץ' 2 הוא קינאז multidomain גדול, מוטציות שהן הגורם הגנטי השכיח ביותר של מחלת פרקינסון. ניתוח של פעילות קינאז של החלבון הזה הוכיחה להיות כלי חיוני בהבנת הביולוגיה תפקוד של חלבון זה. במאמר...

Assaying פעילות קינאז של LRRK2 במבחנה</em

הופעתה של התנגדות גנטית נגד טיפול במעכבי קינאז מציבה אתגר משמעותי לטיפול בסרטן יעיל. זיהוי ואפיון של מוטציות עמידות נגד סמים חדשים שפותח מסייע בניהול טוב יותר קליני ועיצוב תרופת הדור הבא. כאן אנו מתארים הפרוטוקול שלנו להקרנה ואימות של מוטציות עמידות במבחנה.

שיטה להקרנה ואישור של מוטציות עמידות נגד קינאז המעכבים

קינאזות חלבון מתפתחות מאוד אנזימים איתות פיגומים קריטיים עבור התמרה אות בין תאיים בין תאיים. אנו מציגים פרוטוקול למדידת פעילות קינאז באמצעות שימוש ב- triposphate אדנוזין רדיולאבל ([γ- 32 P] ATP), שיטה אמינה לסיוע בהבהרת רגולציה של אותות סלולריים.

Assaying חלבון פעילות עם Kinase Radiolabeled

המחקר הנוכחי מתאר שיטה פשוטה של גילוי רמות אנדוגני של זרחון Rab10 על ידי לאוצין-עשיר אני חוזר קינאז 2.

Rab10 זיהוי זרחון על-ידי פעילות LRRK2 באמצעות מרחביות-דף עם תג מחייב פוספט

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור מערכים נוגדנים לזהות שינויים איתות המסלולים במודלים שונים של הסלולר. שינויים אלה, הנגרם על ידי תרופות/היפוקסיה/אולטרא-violet אור/קרינה, או על ידי ביטוי/downregulation/הסתרה, חשובים עבור מודלים שונים של המחלה, ניתן לציין אם טיפול יהיה יעיל או ניתן לזהות מנגנונים של סמים . התנגדות.

הערכה של התנגדות מעכבי טירוזין קינאז על ידי חקירה של האות התמרה חושית מסלולים על-ידי מערכים נוגדן

אנו מאופיינים חלבון קינאז חדש באמצעות גישות ביוכימיים חזקים: ניתוח כתמי אבן מערבית עם נוגדן ספציפי ייעודי על קווי תאים שונים ורקמות, אינטראקציות על ידי ניסויים coimmunoprecipitation, הפעילות של קינאז שזוהו על ידי המערב כתם באמצעות נוגדן ספציפי פוספהו ועל ידי γ [32P] ATP תיוג.

אפיון ברמה המולקולרית באמצעות גישות ביוכימיות איתנות של חלבון קינאז חדש

פרוטוקול מפורט ליצירת מיקרומערכים של חלבון אנושי מורכב באמצעות הקרנת מעכבי הסרט מוצג.

הקרנת מעכבי קינאז במיקרוערכים של חלבון אנושי מורכב בעצמו

פרוטוקול זה מתאר בדיקה מבוססת BRET למדידת האינטראקציות של קינאז CRAF עם 14-3-3 חלבונים בתאים חיים. הפרוטוקול מתאר שלבים להכנת התאים, קריאת פליטות BRET וניתוח נתונים. מוצגת גם תוצאה לדוגמה עם זיהוי בקרות מתאימות ופתרון בעיות עבור מיטוב מבחן.

Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) - בדיקה מבוססת למדידת אינטראקציות של CRAF עם 14-3-3 חלבונים בתאים חיים

גנטיקה כימית כוללת החלפה של שאריות שוער בחומצת אמינו המכילה שרשרת צדדית שונה במוקד המטרה. כאן, יצרנו טפיל מוטנטי המכיל אלל היפומורפי של cdpk1 וזיהינו מסלולי פיצוי שאומצו על ידי הטפיל ברקע המוטנטי.

הבנת התפתחותם של מסלולי פיצוי בטפיל מלריה מוטנטי בעל אלל היפומורפי של קינאזות דמויות צמחים

פרוטוקול זה מתאר את התכנון, היצירה והיישום של פוספטאזות מווסתות רפמיצין. שיטה זו מספקת ספציפיות גבוהה ובקרה זמנית הדוקה של הפעלת phosphatase בתאים חיים.

פיתוח ויישום של טירוזין פוספטאזים מווסתים רפמיצין

RASopathies הן תסמונות גנטיות רב-מערכתיות הנגרמות על ידי היפראקטיביזציה של מסלול RAS-MAPK. וריאנטים פתוגניים פוטנציאליים הממתינים לאימות מופיעים ללא הרף בעוד ראיות פרה-קליניות גרועות מגבילות את הטיפול. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול ה-in vivo שלנו לבדיקה ואימות צולב של רמות הפעלת ERK הקשורות ל-RASopathy ואת האפנון הפרמקולוגי שלו במהלך האמבריוגנזה על ידי הדמיית FRET חיה בדג זברה Teen-reporter.

פרוטוקול יעיל להערכת אפנון פעילות ERK במודלים מוקדמים של תסמונת נונן של דג הזברה באמצעות מיקרוסקופ FRET חי ואימונופלואורסצנציה

למד אפיון מוטציות RAF הקשורות למחלות באמצעות שיטות ביוכימיות מתקדמות. טכניקות אלה כוללות מבחני קינאזה בתאים ומבחני לוציפראזה מפוצלים לזיהוי אינטראקציות חלבוניות ב-293T.

אפיון מוטציות הקשורות למחלות של חיל המשפחה באמצעות קבוצה של שיטות מעשיות ושימושיות

גלה סרטונים נוספים