Name: ניתוח של לוקליזציה של הספולקסיזומאואליזציה של האדם בתאי הלה באמצעות מיקרו הזרקה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-06T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: חקור את מנגנוני הלוקליזציה של snRNA ספליצוזומאלי בתאי HeLa באמצעות מיקרו-הזרקה של RNA מתויג בפלואורסצנציה. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר תנועת RNA לגופי קאחל וזיהוי רצפים חיוניים ללוקליזציה נכונה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי הקרן המדע הצ (18-10035S), התוכנית הלאומית לקיימות I (LO1419), תמיכה מוסדית (RVO68378050), הקרן האירופית לפיתוח אזורי (COM. 02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775) וסוכנות המענק של אוניברסיטת צ'רלס (GAUK 134516). אנו מכירים בנוסף את מתקן הליבה של מיקרוסקופ האור, IMG CAS, פראג, צ'כיה (נתמך על ידי מענקים (צ'כית-Bioimaging-LM2015062).

1. הכנת מיקרונס למיקרו-מזרקה
<ol><li>הכנת תבנית DNA המכילה את הגירסה באורך מלא או מעוגל/מוטציה של snRNA על ידי ה-PCR באמצעות ההתקנה הבאה PCR: 98 ° c עבור 60 s, 98 ° צ' עבור 15 s, 68 ° c עבור 30, 72 ° c עבור 1 דקות, 98 ° צ' עבור 15 s עבור 35x , ו 72 ° c עבור 5 דקות.</li>
	<li>התחל הקדמי חייב להכיל רצף מיזם עבור שעתוק מבחנה בדיוק במעלה הזרם של הנוקלאוטיד הראשון ששועתק. החזק U2 ברצף snRNA באמצעות פריימר קדימה המכיל את היזם T7 ואת פריימר הפוכה, אשר מסתיים עם נוקלאוטיד האחרון העתק (ראה טבלת חומרים לפרטים).</li>
	<li>סינתזה snRNA באמצעות ערכה עבור סינתזה RNA קצר (ראה טבלת חומרים לפרטים) המכיל T7 RNA פולימראז. להוסיף 1 מ"מ ATP, 1 מ"מ CTP, 1 מ"מ GTP, 0.8 mM UTP, 0.2 mM UTP-Alexa488, 1.8 mM trimethylguanosine כובע אנלוגי (m32, 2, 7G) ppp (5 ') G), 1 מ ל של מעכב RNA ו 500-700 של תבנית ה-DNA לתערובת התגובה והדגירה ב 37 ° c לילה.</li>
	<li>הוסף 1 μL (2U) של DNase לתוך התגובה ואת הדגירה עבור 15 דקות נוספות ב 37 ° c.</li>
	<li>בודד snRNA על ידי מיצוי פנול חומצי/כלורופורם. להסיר את שלב המים העליון ולהוסיף 1/10 של הנפח המקורי של 3 מז נתרן אצטט (pH = 5.2), 3 μL של גליקוגן עבור הדמיית גלולה טובה יותר ו 2.5 כרכים של 100% אתנול. דגירה עבור 1 h ב-80 ° צ', צנטריפוגה עבור 10 דקות ב 14,000 x g ו 4 ° c.</li>
	<li>לשטוף את הגלולה עם 70% אתנול ולפזר 12 μL של מים חינם של nuclease. התשואה הרגילה של RNA הייתה סביב 600 ng/mL. חנות ב-80 ° c.</li>
	<li>עקוב אחר היושרה של העתק מחוץ למבחנה באמצעות מוצרי החשמל של agarose.</li>
	<li>לפני microinjection, לדלל RNA לריכוז הסופי 200 ng/mL במים המכילים 10 μg/μL dextran-TRITC 70 kDa.</li>
</ol>2. תאים
<ol><li>לפני השימוש, לטפל coverslips עם הHCl 1 M עבור 1 h, לשטוף ביסודיות מים מזוקקים ולאחסן ב 100% אתנול. טיפול חומצי מקדמת תאים הדבקה כדי למנוע פילינג תא במהלך או לאחר ההזרקה. לזיהוי קל יותר של תאים מוזרק, להשתמש coverslip עם רשת.</li>
	<li>זרע חלה או תאים חסיד אחרים 1 יום לפני מיקרוהזרקה על 12 מ"מ coverslips (מס ' 1 או no. 1.5) כדי להגיע 50% השטף בזמן מיקרוהזרקה.</li>
</ol>3. הזרקה
הערה: תאי הלה הוזרקו במדיום הנשר השונה של Dulbecco (D-הגברת, 4.5 g/L D-גלוקוז הכולל אדום פנול ואנטיביוטיקה). הזריקה בוצעה באמצעות מזרק ומיקרומניפולציה מצויד במחט סטרילית (ראה טבלת חומרים לפרטים). מערכת מיקרוסקופית/מיקרומניפולציה שלמה הייתה מחוממת מראש עד 37 ° c לפחות 4 שעות כדי למנוע תנודות של חלקים בודדים של המיקרוסקופ והמיקרו-מזרק.
<ol><li>שים את צלחת פטרי (30 מ"מ) המכיל 2 מ ל של מדיית תרבות עם שמיכות באמצע למחזיק של המיקרוסקופ. טען 3 μL של תערובת snRNA לתוך המחט באמצעות microloader. התקינו את המחט למחזיק המיקרו מזרק ב 45 ° ביחס למשטח של צלחת פטרי.</li>
	<li>כדי למצוא את המחט, להשתמש ביעד 10x במרחק רב. ראשית, להגדיר את מהירות גסה על מזרק ולהוריד את המחט עד שהוא נוגע במדיום התרבות. באמצעות משקפת המיקרוסקופ, למצוא את הנקודה הבהירה, אשר הוא המקום שבו המחט נוגעת במדיום התרבות.</li>
	<li>לשנות את המהירות לקנס ועוד להנמיך את המחט תוך כדי להסתכל לתוך המיקרוסקופ עד קצה המחט הוא נצפתה. להעביר את המחט באמצע השדה החזותי ולעבור ליעד 40x במרחק רב.</li>
	<li>לאחר שינוי המטרה, בחר את התא והזז את המחט מעל תא זה. הגדר את הלחצים והזמן עבור איש הקשר של התא (ראה עצות ופתרון בעיות בדיון).</li>
	<li>הזז את המחט אל התא ולאחר מכן הגדר את המגבלה הנמוכה על המיקרומניפולציה. להיזהר לא להזיז את המחט מתחת לתא.</li>
	<li>לאחר הגדרת הגבול התחתון, להזיז את המחט בחזרה מעל התא ולחץ על כפתור ההזרקה על מוט ההיגוי של מזרק. המחט נעה באופן אוטומטי בתוך התא למקום שבו המגבלה מוגדר מזריק את תערובת RNA.</li>
	<li>כדי לסיים, ללחוץ על תפריט הלחצן על מזרק ולהסיר את המחט מן המחזיק. ואז לנתק את הצינורית מן הזרק לפני החלפת מזרק ומיקרומניפולציה.</li>
</ol>4. קיבוע תא וצביעת
<ol><li>לאחר המיקרו הזרקה, להחזיר את התאים לתוך CO2 אינקובטור ו-דגירה ב 37 ° c עבור 1 h.</li>
	<li>לאחר הדגירה, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם התמיסה מלוחים באגירה פוספט (PBS) בטמפרטורת החדר, לתקן עבור 20 דקות עם 4% פאראמפורמלדהיד ב 0.1 M צינורות pH 6.9, ולשטוף שלוש פעמים עם טמפרטורת החדר PBS. אם רק snRNA לוקליזציה מנותח, בקצרה לשטוף את התאים במים להר במדיום הרכבה עם DAPI.</li>
	<li>במקרה של לוקליזציה נוספת של חלבון, החדיר את התאים עם 0.5% טריטון-X100 ב-PBS במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שלושה טיפות עם PBS, מודיית את התאים עם נוגדנים הראשי והמשני לאחר שוטף הסופי ב-PBS ושטיפה קצרה במים, הר במדיום גובר עם dapi.</li>
</ol>5. מיקרוסקופיה
<ol><li>אם לא מתמונה מייד לאחר הטעינה, אחסן את השקופיות ב-4 ° צ' עד להדמיה.</li>
	<li>לרכוש תמונות באמצעות מערכת מיקרוסקופיים פלואורסצנטית high-end מצויד מטרה טבילה (60X או 100x/1.4 NA).</li>
	<li>לאחר תאים מיקרו מוזרק מזוהים, לאסוף ערימה של 20 z-סעיפים עם 200 ננומטר z שלבים לכל מדגם ובכפוף לפירוק מתמטי. הוצגו לאחר מכן בתחזיות מכסימלי או בערימות בודדות של z.</li>
	<li>כדי לכמת את האות פלורסנט, לצייר את אזור הריבית (ROI) סביב גוף Cajal המזוהה על ידי הצווארון החיסוני. למדוד את עוצמת האות snRNA ב-ROI מוגדר האוסף. הבא לקבוע את עוצמת הזריחה snRNA ב ROI באופן אקראי ממוקם בתוך הנואופלזמה ולחשב את היחס של האות RNA של הגוף Cajal ו נוקלאואופלזיה.</li>
</ol>

<ol><li>Ishikawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+truncated+forms+of+U1+snRNA+reveals+a+novel+RNA+degradation+pathway+during+snRNP+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of truncated forms of U1 snRNA reveals a novel RNA degradation pathway during snRNP biogenesis.</a> Nucleic Acids Research. 42 (4), 2708-2724 (2014).</li>
<li>Stanek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cajal+bodies+and+snRNPs+-+friends+with+benefits%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Cajal bodies and snRNPs - friends with benefits.</a> RNA Biology. 14 (6), 671-679 (2017).</li>
<li>Stanek, D., Fox, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+bodies%3A+news+insights+into+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curentr+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nuclear bodies: news insights into structure and function.</a> Curentr Opinion in Cell Biology. 46, 94-101 (2017).</li>
<li>Novotny, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SART3-Dependent+Accumulation+of+Incomplete+Spliceosomal+snRNPs+in+Cajal+Bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">SART3-Dependent Accumulation of Incomplete Spliceosomal snRNPs in Cajal Bodies.</a> Cell Reports. 10, 429-440 (2015).</li>
<li>Roithova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sm-core+mediates+the+retention+of+partially-assembled+spliceosomal+snRNPs+in+Cajal+bodies+until+their+full+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The Sm-core mediates the retention of partially-assembled spliceosomal snRNPs in Cajal bodies until their full maturation.</a> Nucleic Acids Research. 46 (7), 3774-3790 (2018).</li>
<li>Fischer, U., Sumpter, V., Sekine, M., Satoh, T., Luhrmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleo-cytoplasmic+transport+of+U+snRNPs%3A+definition+of+a+nuclear+location+signal+in+the+Sm+core+domain+that+binds+a+transport+receptor+independently+of+the+m3G+cap%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Nucleo-cytoplasmic transport of U snRNPs: definition of a nuclear location signal in the Sm core domain that binds a transport receptor independently of the m3G cap.</a> EMBO Journal. 12 (2), 573-583 (1993).</li>
<li>Shukla, S., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+control+of+assembly-defective+U1+snRNAs+by+decapping+and+5%27-to-3%27+exonucleolytic+digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Academy+of+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Quality control of assembly-defective U1 snRNAs by decapping and 5'-to-3' exonucleolytic digestion.</a> Proceeding of the National Academy of U S A. 111 (32), E3277-E3286 (2014).</li>
<li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+the+message+clear%3A+visualizing+mRNA+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Making the message clear: visualizing mRNA localization.</a> Trends in Cell Biology. 20 (7), 380-390 (2010).</li>
<li>Klingauf, M., Stanek, D., Neugebauer, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+U4%2FU6+small+nuclear+ribonucleoprotein+particle+association+in+Cajal+bodies+predicted+by+mathematical+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhancement of U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein particle association in Cajal bodies predicted by mathematical modeling.</a> Molecular Biology of the Cell. 17 (12), 4972-4981 (2006).</li>
<li>Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tRNA-linked+molecular+beacons+for+imaging+mRNAs+in+the+cytoplasm+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

אנו המועסקים מיקרוהזרקה של המסומנת מתויג snRNAs כדי לקבוע רצפים חשובים עבור snRNA לוקליזציה לתוך הגופים הגרעיניים Cajal. בשל הכנה מהירה ופשוטה למדי של RNAs מתויג (הכנת תבנית ה-DNA על ידי PCR ואחריו שעתוק מבחנה) השיטה מציעה ניתוח אפקטיבי של איך רצפים שונים תורמים ללוקליזציה של RNA. בזמן קצר יחסית, הצלחנו לנתח עשרה מחיקות שונות או החלפות של U2 snRNA (התייחסות5 ונתונים לא הראו). עבור RNAs עם מסלול biogenesis מורכבים, גישה זו גם מאפשרת רצפי בדיקות כי הם חיוניים להבשלה. במקרה של snRNAs, מחיקה של רצפי כ...

שחבור ה-RNA הוא אחד השלבים הקריטיים בביטוי הגנים, אשר מזרז על ידי מתחם ribonucleoprotein גדול הנקרא מתחת לתחתית. בסך הכל, יותר מ 150 חלבונים ו-5 RNAs גרעיני קטן (snRNAs) משולבים לתוך מתחת שלבים בשלבים שונים של המסלול השחבור. U1, U2, U4, U5 ו U6 snRNAs משתתפים בהשתתפות של introns הגדולות גו-AG. SnRNAs אלה להצטרף המאחדים כמו טרום בנוי חלקיקים גרעיניים גרעינית קטנה (Snrnas) המכילים snRNA, שבעה חלבונים Sm הקשורים snRNA (או כמו-Sm חלבונים, אשר מקשרים עם U6 snRNA) ו 1-12 חלבונים ספציפיים עבור כל Snrnas.
הרכבת של snRNPs כוללת cytoplasmic ושלבים גרעיניים. שופץ לאחרונה snRNA מיוצא אל הציטופלסמה שבו הוא רוכש טבעת שנאספו מתוך שבעה חלבונים Sm. הטבעת Sm משמש לאחר מכן כאות לייבא snRNA מחדש חזרה לגרעין. SnRNAs פגומים שאינם משייכים עם חלבונים Sm נשמרים בציטופלסמה1. מיובא snrnps החדש להופיע לראשונה בגוף cajal שבו הם פוגשים snrnps-ספציפיים חלבונים ולסיים את ההבשלה שלהם (נבדקו בהתייחסות2,3). לאחרונה הראינו כי עיכוב של שלבי ההבשלה הסופי תוצאות בקיבוע על של snrnps בוגר בגוף cajal4,5. הצעת מודל שבו ההבשלה snRNP הסופי הוא תחת שליטה איכותית כי מפקחת תוספת של חלבונים ספציפיים snRNP והיווצרות Snrnp פעיל. עם זאת, פרטים מולקולריים של האופן שבו תאים מבחינים בין חלקיקים בוגרים שאינם מפותחים בצורה נכונה, נותרים חמקמקים.
כדי לקבוע רצפים snRNA כי הם חיוניים עבור המיקוד והצטברות של snRNAs בגופים הגרעין Cajal, החלטנו להעסיק מיקרוהזרקה של הסימון מתויג של snRNAs. מיקרוהזרקה היתה שיטה של בחירה כי: 1) זה לא דורש תג רצף נוסף כדי להבחין snRNAs סינתטי טופס עמיתיהם האנדוגניים שהוא חשוב במיוחד עבור RNAs קצר עם מעט מקום להוספה של רצף תג נוסף; 2) הוא מאפשר ניתוח רצפים החשובים עבור biogenesis. לדוגמה, רצף Sm חיוני להרכבת הטבעת Sm ולייבא מחדש לתוך הגרעין6. כאשר snRNAs מבוטא בתא, snRNAs חסר הרצף Sm מושפל בציטופלסמה ולא להגיע הגרעין הגופים Cajal7. עם זאת, snRNAs ללא רצף Sm יכול להיות ישירות מיקרו לתוך הגרעין ולכן תפקיד פוטנציאלי של רצף Sm ב Cajal לוקליזציה של הגוף.
כאן, אנו מתארים בפירוט שיטת מיקרו הזרקה שאנו מיושמים כדי לקבוע רצפים snRNA הנחוצים למקד snRNAs לתוך הגוף Cajal5. הראנו כי האתרים מחייב Sm ו SMN הם ביחד הכרחי ומספיק כדי להתאים לא רק snRNAs, אך שונים RNAs ללא קידוד קצר לתוך הגוף Cajal. מבוסס על הזרקת מיקרו כמו גם ראיות אחרות, הציעו כי טבעת Sm התאספו על האתר מחייב Sm הוא אות הגוף Cajal לוקליזציה.

<table><tbody><tr><td>ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP</td><td>ThermoFisher</td><td>C11403</td><td>ריכוז מלאי 1 מ"מ</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle בינוני - גלוקוז גבוה</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td>מכיל 4.5 גרם&frasl; L D-גלוקוז, פנול אדום ואנטיביוטיקה</td></tr><tr><td>FemtoJet אקספרס מזרק</td><td>Eppendorf</td><td>5247000013</td><td></td></tr><tr><td>Femtotips II</td><td>Eppendorf</td><td>930000043</td><td>מחט מיקרו-הזרקה של 0.5 ומיקרו; M פנימי ו-0.7 ומיקרו; m קוטר חיצוני</td></tr><tr><td>Fluoromont G עם DAPI</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>גליקוגן</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9510</td><td>ריכוז מלאי 5 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>כיסויי זכוכית מרושתת</td><td>Ibidi</td><td>10817</td><td>כיסויים עם רשת, ללא ניסיון ישיר איתם</td></tr><tr><td>InjectMan NI 2 Micromanipulator</td><td>Eppendorf</td><td>5181000017</td><td></td></tr><tr><td>m3-2,2,7G(5')ppp(5')G אנלוגי כובע טרימתילד</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-853-1</td><td>ריכוז מלאי 40 מ"מ</td></tr><tr><td>ערכת תמלול MEGAshortscript T7</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1354</td><td></td></tr><tr><td>משקפי כיסוי מיקרוסקופ 12 מ"מ, מס' 1</td><td>Paul Marienfeld GmbH</td><td>111520</td><td>לעבודה שגרתית</td></tr><tr><td>משקפי כיסוי מיקרוסקופ 12 מ"מ, מס' 1.5</td><td>Paul Marienfeld GmbH</td><td>117520</td><td>לגבוה תמונות רזולוציה</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ DeltaVision</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>לרכישת תמונה</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ DMI6000</td><td>Leica</td><td></td><td>למיקרו-הזרקה</td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד 32% תמיסה EM כיתה</td><td>EMS</td><td>15714</td><td>מומס בצינורות לריכוז הסופי 4%</td></tr> <tr><td>פנול: כלורופורם 5: 1</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P1944</td><td></td></tr><tr><td>פריימרים להגברת U2: קדימה: 5'-TAATACGACT CACTATAGGGATCGCTTCT CGGCCTTTTGG, גב: 5&חריף; TGGTG CACCGTTCCTGGAGGT</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td></td><td>T7 רצף מקדם בכתב נטוי</td></tr><tr><td>Phusion High Fidelity DNA פולימראז</td><td>BioLab</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>RNasin Plus</td><td>Promega</td><td>N2615</td><td>ריכוז מלאי 40 מ"מ</td></tr><tr><td>טטרמתילרודמין איזותיוציאנט דקסטרן 65-85 kDa</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T1162</td><td>מומס במים, ריכוז מלאי 1 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Serva</td><td>37240</td><td>מומס במים, ריכוז מלאי 10%</td></tr></tbody></table>

ניתוח של לוקליזציה של הספולקסיזומאואליזציה של האדם בתאי הלה באמצעות מיקרו הזרקה

Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection

ביוגנזה של snRNAs התחתית הוא תהליך מורכב הכרוך הן בשלבים גרעינית, cytoplasmic והשלב האחרון מתרחש בתוך תא גרעיני בשם הגוף Cajal. עם זאת, רצפים הישירים לוקליזציה snRNA למבנה זה תת גרעיני לא ידוע עד לאחרונה. כדי לקבוע רצפים חשובים עבור הצטברות של snRNAs בגופים Cajal, אנו המועסקים מיקרוהזרקה של מתויג באמצעות שלהם snRNAs ואחריו הלוקליזציה שלהם בתוך תאים. ראשית, הכנו snRNA מוטנטים מוטציות, מסונתז תבניות דנ א עבור תמלול ושעתוק והעתק snRNAs בנוכחות של UTP ביחד עם Alexa488. מתויג snRNAs היו מעורבים עם 70 kDa-Dextran מצועם TRITC, ו מיקרווזרק לגרעין או ציטופלסמה של תאי הלה האדם. תאים היו מודבטים עבור 1 h ו קבוע את הסמן הגוף Cajal לאסוף היה דמיינו על ידי immunofluorescence עקיף, בעוד snRNAs ו dextran, אשר משמש כסמן של הזרקה גרעינית או cytoplasmic, נצפו ישירות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטית. שיטה זו מאפשרת בדיקה יעילה ומהירה של איך רצפים שונים להשפיע לוקליזציה RNA בתוך תאים. כאן, אנו מראים את החשיבות של רצף מחייב-Sm ללוקליזציה יעיל של snRNAs לתוך הגוף Cajal.

כדי לנטר snRNA לוקליזציה ואת התפקיד של האתר מחייב Sm מיקוד הגוף Cajal, הכנו תבנית DNA המכילה את היזם T7 או באורך מלא U2 snRNA או U2 snRNA חסר שבעת נוקלאוטידים (AUUUUUG) להרכיב את האתר מחייב Sm. , מבודדים ומעורבבים בעזרת טריTC. עם דקטרן-70kDa אנו מזריקים את התערובת המכילה בתוך מבחנה מתורבת snRNA לתוך הגרעין או ציטופלסמה של תאי הלה.
כבר הוכח בעבר כי האתר מחייב Sm הוא הכרחי עבור ייבוא גרעיני6. כדי לבדוק אם האתר Sm חשוב גם עבור הצטברות הגוף Cajal, אנו מזריקים snRNA חסר באתר Sm ישירות לת...

ביוגנזה של snRNAs של הספנסאוסיס הוא תהליך מורכב הכולל תאים סלולריים שונים. כאן, אנחנו המועסקים מיקרוהזרקה של מתויג באמצעות שוכרים snRNAs כדי לפקח על ההובלה שלהם בתוך התא.

Biogenesis of spliceosomal snRNAs is a complex process involving both nuclear and cytoplasmic phases and the last step occurs in a nuclear compartment ...

כאן יישמו microinjection של RNAs שכותרתו פלואורסצנטי לזהות רצפי RNA אשר חיוניים לוקליזציה של RNAs גרעיניים קצרים לתוך מבנים גרעיניים הנקראים גופים Cajal. לטכניקה זו יש שני יתרונות עיקריים. ראשית, ניתן להחיל אותו על RNAs קצרים שאחרת קשה לסמן ולעקוב אחריהם.ושנית, זה מאפשר סינון מהיר של רצפים שונים ובדיקת תפקידם לוקליזציה RNA. יום אחד לפני microinjection, זרעי HeLa או תאים חסידים אחרים על 12 מילימטר מכסה כדי להגיע 50% confluency בזמן microinjection. כדי להתחיל, למקם כיסוי מוכן למרכז צלחת פטרי, להוסיף תאים ושני מילימטרים של מדיה תרבותית.למחרת, מניחים את צלחת פטרי מלא התא על שלב מיקרוסקופ. באמצעות microloader, לטעון שלושה microliters של תערובת snRNA לתוך המחט ולהתקין את המחט לתוך המחזיק של microinjector בזווית של 45 מעלות ביחס לפני השטח של צלחת פטרי. השתמש במטרה 10X למרחקים ארוכים כדי למצוא את המחט.ראשית, להגדיר את המהירות גסה על המזרק ולהוריד את המחט עד שהוא נוגע במדיום התרבות. באמצעות משקפת מיקרוסקופ, למצוא את נקודת האור שהוא המקום שבו המחט נוגעת באמצעי התרבות. לשנות את המהירות כדי לקנוס ולהוריד עוד יותר את המחט תוך כדי התבוננות לתוך המיקרוסקופ עד קצה המחט הוא ציין.להזיז את המחט באמצע השדה החזותי ולעבור למטרה 40X למרחקים ארוכים. לאחר מכן, בחר את התא והזז את המחט מעל התא. הגדר את הלחץ והזמן עבור איש הקשר הסלולרי.להזיז את המחט למטה לתוך התא ולאחר מכן להגדיר את הגבול התחתון של micromanipulator. הגדרת הגבול התחתון היא החלק הקריטי ביותר בפרוטוקול. בגלל משטח coverslip אינו מושלם, כי כל תא שונה, תצטרך להגדיר את הגבול התחתון מספר פעמים במהלך הפעלת ההזרקה.לאחר מכן, להזיז את המחט בחזרה מעל התא ולחץ על כפתור ההזרקה על מוט ההיגוי של המזרק. המחט תעבור באופן אוטומטי בתוך התא למקום שבו הגבול מוגדר להזריק את תערובת RNA. כדי לסיים, לחץ על כפתור התפריט על המזרק ולהסיר את המחט מהמחזיק.לאחר מכן נתק את הצינור מהמזרק לפני כיבוי המזרק והמיקרומניפולטור. לאחר המיקרו-ג'ינג'י, החזירו את התאים לאנקובטור פחמן דו-חמצני ולאנקובטה ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר מכן, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS בטמפרטורת החדר.תקן את התאים במשך 20 דקות עם 4%paraformaldehyde בצינורות טוחנים 0.1 ב- pH 6.9. ואז לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS טמפרטורת החדר. אם מנתחים רק לוקליזציה של snRNA, שטפו בקצרה את התאים במים והרו במדיום הרכבה באמצעות DAPI.במקרה של לוקליזציה נוספת של חלבונים, יש לחלחל לתאים עם 0.5% טריטון X-100 ב-PBS למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. יש לשטוף את התאים שלוש פעמים באמצעות PBS ולהכתים אותם בנוגדנים הראשוניים והמשניים המתאימים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן לשטוף שלוש פעמים עם PBS ולשטוף פעם אחת במים.לאחר מכן, תן את התאים במדיום הרכבה עם DAPI. כאשר אתם מוכנים לתמונה, השתמשו במערכת מיקרוסקופית פלואורסצנטית יוקרתית המצוידת במטרה טבילה כדי לרכוש את התמונות. לאחר זיהוי התאים microinjected, לאסוף ערימה של 20 מקטעי Z עם 200 ננומטר Z צעדים לכל מדגם בכפוף deconvolution מתמטי.לכימות אות הפלואורסצנט, פתחו תחילה את תמונת המיקרוסקופיה ב-ImageJ ופצלו ערוצים לחלונות. סנכרן חלונות לפי כלי הסינכרון של החלון. לאחר מכן, לצייר את האזור של עניין סביב גוף Cajal מזוהה על ידי כשל חיסוני coilin.למדוד את עוצמת אות snRNA בהדרת ההשקעה המוגדרת על ידי קולין. לקבוע את עוצמת הפלואורסצנטיות snRNA בהדרה חוזרת (ROI) הממוקמת באופן אקראי בגרעין. שמור ערכים נמדדים וחשב את היחס של אות RNA בגוף Cajal ונוקליופלזמה.במחקר זה, snRNAs שכותרתו פלואורסצנטי הם microinjected על מנת לפקח על התחבורה שלהם בתוך התא. כדי לבדוק אם אתר SM חשוב עבור הצטברות הגוף Cajal, snRNA חסר אתר SM הוא microinjected ישירות לתוך הגרעין. הזרקה לתוך הציטופלסמה משמשת כפקד בעוד snRNA באורך מלא הוא microinjected לשמש שליטה חיובית.לאחר הדגירה, תאים microinjected קבועים ואת קולין סמן הגוף Cajal הוא דמיין על ידי שפעת חיסונית עקיפה. snRNA באורך מלא הצטבר בגופי Cajal לאחר זריקות גרעיניות וציטופלסמיות. לעומת זאת, snRNA חסר אתר SM נשאר ציטופלסמה לאחר microinjection לתוך תא זה בעוד microinjection הגרעיני של snRNA ללא אתר SM מגלה כי רצף קשירה SM חשוב לוקליזציה הגוף Cajal כמו snRNA זה נשאר בגרעין אבל לא מצטבר בגופי Cajal.לפעמים microinjection לתוך תא סלולרי אחד בלבד נכשל מרומה Dextran 70 קילודלטון ניתן למצוא הן בגרעין ואת הציטופלסמה. תאים אלה נמחקים מניתוח נוסף. למרות העובדה כי snRNAs שכותרתו פלואורסצנטי מאוחסנים שלילי 80 מעלות צלזיוס לפני הזריקה, השפלה RNA יכול להתרחש.snRNA מושפל מוזרק לתוך הציטופלסמה אינו מועבר לתוך הגרעין ונשאר מקומי בציטופלסמה. snRNA כזה צריך להיות מושלך snRNA חדש צריך להיות מסונתז. חשוב להתאים כראוי הזרקה ולחצים מפצה עבור סוג התא שלך.וכך נאמר קודם, הגדרת הגבול התחתון הנכון להזרקת תאים היא חיונית עבור microinjection טוב. זכור כי פנול-כלורופורם המשמש במהלך בידוד RNA הוא מסוכן, כי מחט microinjection הוא אובייקט חד. היזהר בעת טיפול בחומרים אלה.

analysis-spliceosomal-snrna-localization-human-hela-cells-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

בשל האופי החולף של mRNA מראש, זה יכול להיות קשה לבודד...

שיטה מהירה תפוקה גבוהה עבור Ribonucleoproteins מיפוי (RNPs) על mRNA מראש אדם

כאן אנו מתארים assay המעסיקה את כוחו של microinjection יחד עם...

אנליזה של קינטיקה mRNA גרעיני ייצוא בתאי יונקים ידי Microinjection

RNA in situ hybridization (ISH) מאפשר הדמיה של RNA בתאים וברקמות. כאן אנו מראים כיצד ניתן להשתמש בהצלחה בשילוב של RNAscope ISH עם אימונוהיסטוכימיה או צבעים היסטולוגיים כדי לזהות mRNAs הממוקמים באקסונים בחלקים של מוחות עכברים ובני אדם.

איתור של Axonally המותאם למקום mRNAs בסעיפי מוח באמצעות ברזולוציה גבוהה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה

בחיי עיר הכלאה (איש) פרוטוקול המשתמשת oligonucleotides antisense קצר כדי לזהות דפוסים חלופיים pre-mRNA splicing בסעיפים מוח העכבר מתואר.

ניתוח כמותי של שחבור חלופי Pre-mRNA בסעיפים מוח העכבר באמצעות ה-RNA בחיי עיר הכלאה Assay

כאן, אנו מתארים בחיי עיר הכלאה assay המאפשרת זיהוי רגיש וספציפי של רצפי קצר ככל נוקלאוטידים 50 עם רזולוציה נוקלאוטיד יחיד ברמת תא בודד. וזמינותו, אשר יכול להתבצע באופן ידני או אוטומטי, באפשרותך לאפשר ויזואליזציה של גרסאות splice, רצפים קצרים מוטציות בתוך ההקשר רקמות.

וריאציות גנטיות להמחיש מטרות קצרות, מוטציות נקודה בהקשר רקמות מורפולוגי עם RNA בחיי עיר Assay הכלאה

פרוטוקול זה מתאר את השלבים הדרושים כדי ליצור מערכת מודל שבו שעתוק של גנים אנדוגני עניין יכול להיות מותנה נשלט בעלי חיים או תאים באמצעות מדכא. שבולם משופרת lac ו/או מערכות activator ט .

In vivo היישום של מערכת שליטה מרחוק עבור הביטוי מניפולציה של ג'ין אנדוגני

Reproducibly לספור את המספרים של mRNAs ב oocytes בודדים, מולקולה בודדת RNA פלורסצנטיות באתרו הכלאה (RNA-דג) היה אופטימיזציה עבור תאים שאינם מחסידי. Oocytes נאספו, hybridized עם הגששים ספציפית התעתיק, לכמת באמצעות תוכנה כימות של התמונה.

השימוש יחיד מולקולה פלורסנט ב באתרו הכלאה (SM-דג) כדי mRNAs Quantify ו Localize ב Oocytes מאתר

פרוטוקול זה מציג כלי מהיר ושימושי להערכת תפקידו של חלבון עם פונקציה לא אופיינית בוויסות חיבור חלופי לאחר טיפול כימותרפי.

שימוש בכלי המיני-דג'ן E1A לחקר שינויי ההסתבכות של mRNA

פרוטוקול זה מתאר בדיקה עיתונאית minigene כדי לפקח על ההשפעה של מוטציות באתר 5-splice באתר על חיבור ומפתח מדכא U1 snRNA להצלת עיכוב חיבור המושרה מוטציה. הכתב והמדכא U1 snRNA מבנים באים לידי ביטוי בתאי HeLa, ו splicing מנותח על ידי הרחבת פריימר או RT-PCR.

בדיקה סלולרית מבוססת כתב לניטור יעילות חיבור

פרוטוקול זה מתאר את ההכנה המפורטת של דגימות בעלות קלט נמוך לריצוף גרעין יחיד, כולל כריתה של צוואר הרחם העליון של העכבר וגרעיני סטלאט, דיסוציאציה של תאים, שימור בהקפאה, בידוד גרעין וברקוד האשטאגים.

בידוד גרעין בעל קלט נמוך וריבוב עם נוגדנים ברקודים של גרעינים סימפתטיים של עכברים לריצוף RNA של גרעין יחיד

חקור את מנגנוני הלוקליזציה של snRNA ספליצוזומאלי בתאי HeLa באמצעות מיקרו-הזרקה של RNA מתויג בפלואורסצנציה. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר תנועת RNA לגופי קאחל וזיהוי רצפים חיוניים ללוקליזציה נכונה.

ניתוח של לוקליזציה של הספולקסיזומאואליזציה של האדם בתאי הלה באמצעות מיקרו הזרקה

גלה סרטונים נוספים