איתור של Extravascular טריאנוסומה טפילים על ידי שאיפה מחט פיין

ציטולוגיה של שאיפת מחט עדינים היא טכניקה זולה, פשוטה, מהירה ופולשנית מינימלית בה אנו משתמשים כדי לאסוף טריפנוזומים מנגעים מוחשיים באיברים בעכברים חיים. בהתחשב בכך שאיפת מחט בסדר הוא הליך שאינו סופני, זה מאפשר דגימה חוזרת ונשנית באותה חיה לאורך זמן. אם ניתן לתרגם ממצאים אלה לבקר, שיטה זו תהיה שימושית מאוד עבור וטרינרים לאבחן טריפנוסומיאזיס בבקר בחווה.

הפגנת הליך הכתמת ההכפשה תהיה אנה מרגרידה סנטוס, עוזרת טכנולוג מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, לאשר הרדמה עם שיטת קמצוץ בוהן. כאשר הרפלקס של נסיגת הרגל נעדר, למקם את העכבר ב recumbency הגב.

בזהירות למחוץ את האשכים כדי לקבוע את הגודל והמרחק מן העור overlying ולאחר מכן לרסן אותו בין האינדקס לאצבע האמצעית או בין האצבע והאגודל המורה. כדי לשתק עוד יותר את המטרה, למתוח את העור overlying בחוזקה ולנקות את פני השטח עם מגבונים אלכוהול. לאחר מכן, הכנס את קצה המחט של מחט 23 מד מחובר מזרק חמישה מיליליטר לתוך היעד לוודא הבוכנה היא במצב שאר.

כדי להחיל יניקה, לחזור בוכנה מזרק לסימני שלושה עד ארבעה מילימטר פעמיים עד שלוש פעמים. כדי להגדיל את ההסתברות של קבלת מדגם מייצג של מיקוד מבנים קטנים יותר כמו epididymis, להפנות את המחט בתוך האיבר או בקו ישר או לאורך כמה משיקים שונים. שחרר את היניקה ולאחר מכן למשוך את המחט.

מחט ניתן להסיר רק לאחר הלחץ השלילי הוא שוחרר על ידי להרפות הבוכנה. אחרת, האספירטה נשאבת לתוך המזרק והיא בלתי בלתי הפיך. החל לחץ עם ספוג גזה סטרילי באתר לנקב כדי לשלוט בכל דימום.

נתק את המזרק מהמחט ומלא אותו באוויר. לחבר מחדש את המחט, למקם את קצה המחט קרוב מאוד או אפילו על השקופית בעדינות להוציא את התוכן של המחט על השקופית. כדי להבטיח שכפול דגימה, בצע לפחות שאיפה נוספת אחת לכל איבר ובעלי חיים.

לאחר החזרת הרדמה עם זריקה תת עורית של 200 microliters של מיליגרם אחד לקילוגרם Atipamezole מלוחים, להחזיר בעלי חיים לכלוב הבית שלהם להחלמה. באמצעות היד הלא דומיננטית, הרם את השקופית שיש לה טיפת שאפתן צובטת את הקצה הקפוא בין האגודל לאצבע המורה. באמצעות היד הדומיננטית, להרים שקופית מפזר נקי למקם אותו חלקה קצה נקי על פני השקופית השנייה רק על החלק העליון של הירידה בזווית של כ 30 מעלות.

כדי לקבל סרט דק, החלק את השקופית קדימה בתנועה רציפה ויציבה קלה אחת. הנח את השקופית ואפשר ייבוש אוויר מלא ומהיר של החומר. סמן את הקצה הקפוא של השקופית בעיפרון.

לפרוטוקול הכתמים של Giemsa, תקן מריחות מיובשות באוויר על ידי טבילת המגלשות בצנצנת קופלין המכילה 100% מתנול למשך חמש דקות. לאחר מכן מעבירים את המגלשות לצנצנת קופלין המכילה תמיסת גימסה 20% ומים מזוקקים למשך 30 דקות. יש לשטוף את המגלשות במי ברז ולטבול בנייר טישו לייבוש יסודי.

תוך החזקת השקופית אופקית, החל מספר טיפות של מדיום הרכבה לא רעיל על המריחה. מניחים את קצה זכוכית הכיסוי על השקופית, מנמיך אותה ולחץ בעדינות כדי להסיר בועות אוויר. עבור אימונוציטוכימיה, לתקן כתמים מיובשים באוויר 100% מתנול בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.

לשטוף את השקופית במשך חמש דקות בצנצנת Coplin עם PBS 1X חוזר על שלב זה שלוש פעמים באמצעות PBS 1X טרי בכל פעם. לאחר הסרת השקופיות מהגנצנת Coplin, יש לנגב חיץ עודף מבלי לגעת במריחה ולשרטט קו סביב ההכפשה בעט דוחה מים. תוך החזקת השקופית אופקית, יש למרוח 150 מיקרוליטרים של תותב נוגדנים ראשוני מדולל על כל מריחה ודגירה למשך שעה בטמפרטורת החדר.

לאחר הדגירה, לשטוף את השקופיות במשך חמש דקות בצנצנת Coplin עם PBS 1X חוזר על שלב זה שלוש פעמים באמצעות PBS 1X טרי בכל פעם. בעת החזקת השקופית אופקית, להחיל 150 microliters של מערכת ויזואליזציה צנון סוס זמין מסחרית peroxidase DAB על כל מריחה ולאחר מכן דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את השקופיות שוב שלוש פעמים במשך חמש דקות PBS.

ואז לנטרל על ידי טבילת השקופיות לתוך צנצנת קופלין המכיל hematoxylin האריס במשך 10 שניות. יש לשטוף במי ברז ולטבול בנייר לייבוש יסודי. תוך החזקת השקופית אופקית, החל מספר טיפות של מדיום הרכבה לא רעיל על המריחה.

מניחים את קצה זכוכית הכיסוי על השקופית, מנמיך אותה ולחץ בעדינות כדי להסיר בועות אוויר. מריחה באיכות טובה התאפיינה במונולייה של תאים בעלי צפיפות טובה ותכונות מורפולוגיות משומרות המאפשרות זיהוי של רקמת המוצא שלהם ואת הפרופורציה היחסית ביניהם. יתר על כן, טפילים היו מוכתמים ביעילות, ניתנים לזיהוי וניתן לספור אותם.

תוצאות השאיפה מחט בסדר עניים או שליליים עשויים להיות בשל חומר קטן מדי ולכן תחת נציג של המסה או האיבר. זה יכול להיות גם בגלל יותר מדי חומר על שקופית אחת עושה מריחות עבות מדי ופגיעה בהערכה ציטולוגית. מה שנקרא חפץ כתוש קורה בשל יותר מדי כוח להיות מיושם בעת ביצוע ההכפשה עוזב לתאים משובשים וכתוצאה מכך הרבה גרעינים עירומים פסים DNA.

כאשר לא מוחל מספיק כוח במהלך הכנת מריחה, התאים אינם מתפרקים וכתוצאה מכך שכבה מרובדה המ מעכבת הערכה של התכונות המורפולוגיות של התאים. השוואה של ציטופתולוגיה השאיפה מחט בסדר עם היסטופתולוגיה, ציטופתולוגיה היה היתרון של מורפולוגיה הסלולר השתמר טוב יותר הערכה טובה יותר של פרופורציות יחסיות וספירת תאים. אימונוציטוכימיה היא פשוטה יותר, מהירה יותר וקלה יותר למיטוב מאשר אימונוהיסטוכימיה.

עבור שאיפת מחט בסדר, תמיד להבטיח קיבוע טוב של החיה, ייצוב האיברים או המסה להיות שאפתן, ויישום ואקום מתואם ושחרור. לאחר מכן עבור מריחות באיכות גבוהה, מיד התפשט לאחר החומר הונח על הזכוכית להיות עדין על הכוח להחיל כדי להפוך את ההכפשה כדי למנוע תא ריסוק חפצים. בנוסף למיקרוסקופיה שגרתית ואימונוציטוכימיה, חומר זה יכול לשמש גם עבור מיקרוסקופ אלקטרונים, ניתוח ביוכימי, ציטומטריית זרימה, ביולוגיה מולקולרית, או אפילו עבור בדיקות במבחנה.

טכניקה זו אפשרה לנו להוכיח כי שאיפת מחט בסדר יכול לשמש כדי לאבחן וללמוד מחלות בבעלי חיים ניסיוניים. הצלחנו לאבחן טרופוליזם של טפילי טריפאנוסומה לאברי הרבייה הגבריים החיצוניים וגם לאפיין מחלה זו במהלך הזיהום.