Name: טיהור חלבון המסה המולקולרי הגבוה בסטרפטוקוקוס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: למד שיטה לטיהור חלבוני ממברנה וחלבוני מסה מולקולרית גבוהה ב-Streptococcus mutans באמצעות PCR וכרומטוגרפיית IMAC. שיטה זו מספקת חלופה יעילה לטיהור חלבונים הקשים לביטוי ב-E. coli.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי האגודה היפנית לקידום המדע (JSPS) (להעניק מספרים 16K15860 ו 19K10471 ל T. M, 17K12032 ל-M. I., ו 18K09926 ל N. H.) וקרן המדע והטכנולוגיה SECOM (SECOM) (גרנט מספר 2018.09.10 מס ' 1).

הערה: דור של S. mutans gtfc, שבו כל אזור הקידוד של הג gtfc מוחלף עם spcr, יש להשלים לפני ביצוע פרוטוקולים אלה. עיין במאמר המתפרסם לקבלת פרטים על דור5.
1. פריימר עיצוב
<ol><li>
הכן את התחל לבניית S. מוסטנים שלו-gtfc. הערה: הרצפים הפריימר המשמשים בפרוטוקול זה מוצגים בטבלה 1. שיטת ה-PCR של שני השלבים עבור הדור של S. מוזטאן שלו-gtfc מומחש באיור 2.<ol>
<li>עיצוב התחל (gtfc-הפוכה ו- spcr-קדימה) עבור הקובץ המצורף שלו-תג-קידוד רצף, מהתערב בין הגנים gtfc ו- spcr (איור 2a).<ol>
<li>כלול מקשר GS ו-תג שלו-coding רצף לתוך שניהם Gtfc-הפוכה ו spcr-קדימה התחל, שבו 24 בסיסים באזורים 5 ' משלימים אחד את השני. הערה: רצף חומצת האמינו של GS המקשר והתג שלו (בסדר-בסדר-מאוד-מאוד-שלו-שלו-שלו-שלו) מחובר ל-C הטרמינוס של GTF-SI באמצעות תרגום גנטי.</li>
			<li>עיצוב gtfc-קדימה לכוון את הגן Gtfc ב -S. מוסטטאן הגנום > 1 kb במורד הגן ו- spcr-הפוך פריימר למקד את אזור במורד הזרם של spcr ב -S. מוסטנים ∆gtfc. הגדר את טמפרטורת ההיתוך8 (Tm) של gtfc-קדימה ו- spcr-הפוך התחל להתאים עם טמפרטורות ההיתוך של gtfc-הפוכה ו- spcr- התחל קדימה, בהתאמה.</li>
		</ol>
</li>
		<li>עצב צבעי יסוד מקוננים (מקוננים קדימה והפוך מקונן) עבור ה-PCR השני (איור 2B).</li>
		<li>עיצוב התחל (Gtfc-קדימה והמושבה-הפוך) מיוחד עבור ה-DNA הגנומי של הטרנספורנט (איור 2c; התחל משמש למושבה ה-PCR). הערה: הגברה על הגבול בין Gtfc ו- spcr. ניתן להחיל את התחל הקדמי של Gtfcבתור התחל הקדמי.</li>
		<li>עיצוב התחל (למעלה-קדימה ולמטה לאחור) לקבלת אישור סופי של הדור של ס. מוסיקה שלו-gtfc (איור 2c; מוצר ה-PCR המוגדל על ידי התחל משמש לרצפי DNA).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. הפקת דנ א גנומית מ -S. מוסטנים
הערה: מאמץ של כל S. מוסטנים צריך להיות מתורבת בינוני בלב המוח (bhi) בינונית ב 37 ° c בתנאים אנאירובית. זנים מוטציה של s. מוסטנים ∆Gtfc ו ס מוסטנים שלו-gtfc הם מתורבתים ב bhi בתוספת עם 100 μg/mL spectinomycin.
<ol><li>פס s. mutans WT ו -s. מוסטנים ∆gtfc בנפרד על כל הצלחות bhi אגר. מודאת אותם הלילה. ב-37 ° c</li>
	<li>בחר מושבות יחיד של s. mutans WT או s. מוסטנים ∆gtfc באמצעות קיסם שיניים מעוקר לתוך 1.5 mL של ציר bhi. מודאת אותם הלילה. ב-37 ° c הערה: ניתן להשתמש במושבות כמקור ל-DNA של תבנית עבור ה-PCR הראשון (שלב 3.1).</li>
	<li>העבר 1 מ ל של כל תרבות בקטריאלי לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL. צנטריפוגה את התרבות עבור 1 דקות ב 15,000 x g.</li>
	<li>הסר את supernatant ולהוסיף 1 מ ל של מאגר טריס-EDTA (pH 8.0) כדי להשעות מחדש את הגלולה התא.</li>
	<li>צנטריפוגה את ההשעיה עבור 1 דקות ב 15,000 x g. . הסר את הסופרנטאנט להשעות מחדש את הגלולה תא ב 50 μL של מאגר טריס-EDTA (pH 8.0).</li>
	<li>לחמם את ההשעיה באמצעות אינקובטור בלוק עבור 5 דקות ב 95 ° c. צנטריפוגה את ההשעיה עבור 5 דקות ב 15,000 x g.</li>
	<li>העבר את הסופרנטאנט לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש 1.5 mL (הסופרנטאנט ישמש כ-DNA תבנית עבור ה-PCR הראשון).</li>
</ol>3. הגברה של הPCR
הערה: טבלה 1, טבלה 2 ושולחן 3 מסכמים את מחזורי התחל, הריאגנטים והגברה של ה-PCR, בהתאמה.
<ol><li>לבצע את ה-PCR הראשון באמצעות s. mutans WT ו -s. מוסטנים ∆gtfc הגנום כמו תבניות ה-PCR. הגבר את האזורים המהווים מחסה לחלק הזרם של גן Gtfc ואלה המהווים מחסה ב- spc באמצעות התחל המתואר בשלב 1.1.1.2 (איור 2a).</li>
	<li>כל מוצר של ה-PCR ב-1% העלה ג'ל. בלו את שברי ה-DNA הרצויים של כ 1,000 bp ו 2,000 bp. לטהר את השברים מן הג באמצעות ממברנה סיליקה מבוססי ג'ל שיטת החילוץ. הערה: ההליכים הבסיסיים של PCR9, ה-dna ג'ל אלקטרופורזה10, ו-DNA טיהור11 מפורטים במקום אחר.</li>
	<li>לבצע ה-PCR השני באמצעות המוצרים של ה-PCR הראשון (כ equimolar) כמו תבניות PCR עם ההתחלה המקוננת קדימה והמקוננת הפוכה (איור 2B).</li>
	<li>אלקטרופורסה עשירית מתערובת ה-PCR על ג'ל הצמח. לאשר את הדור של אמפליקון המתאים של כ 3,000 bp.</li>
	<li>
מזרז את מוצר ה-PCR הנותר. הערה: הטיהור של מוצר ה-pcr אינו הכרחי, משום שהגברה שאינה ספציפית שנוצרת על ידי ה-pcr השני אינה מפריעה לשילוב מחדש של הומוולוגי.<ol>
<li>הוסף nuclease-מים חינם לתערובת ה-PCR ולהביא את הנפח הכולל ל 100 μL, ואחריו 0.1 נפח (10 μL) של 3 מז נתרן אצטט (pH 5.2) ו 2.5 אמצעי אחסון (250 μL) של אתנול מוחלט. לערבב ולאחסן את התערובת עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT).</li>
		<li>צנטריפוגה את המדגם עבור 20 דקות ב 15,000 x g ב 4 ° c. . מחק את הסופרנטאנט להוסיף 1 mL של 70% אתנול כדי לשטוף את הגלולה DNA.</li>
		<li>צנטריפוגה את המדגם עבור 5 דקות ב 15,000 x g ב 4 ° c. . מחק את הסופרנטאנט האוויר יבש ולפזר את הגלולה DNA עם 10 μL של nuclease-מים ללא תשלום.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. המרת תאים
<ol><li>הכנת המוצרים המוסמכים של s. mutans כדי להציג את מוצר ה-PCR השני על-ידי ביצוע השלבים המתוארים בפרסום הקודם5. אחסן את התאים בשעה-80 ° c. הערה: לניסוי זה, התאים המוסמכים s. mutans WT כבר נשמרו ב-80 ° c כדי לייצר S. מוסטנים ∆gtfc.</li>
	<li>מערבבים 5 μl של המוצר השני מרוכז PCR כדי 50 μl סדרת מחלקים של תאים קר קרח מוסמך קפואים בעבר. הוסיפו את התערובת לתוך כימיקלים אלקטרופורציה. לתת פולס חשמלי יחיד (1.8 kV, 2.5 ms, 600 Ω, 10 μF) לתאים באמצעות מנגנון אלקטרופורציה.</li>
	<li>השהה מחדש את התאים ב-500 Μi של ציר BHI. מיד, להפיץ 10 – 100 μL של ההשעיה אל BHI אגר צלחות המכילות spectinomycin. מודיית את הצלחות עבור 2 – 6 ימים ב 37 ° צ' עד המושבות גדלו מספיק כדי לקבל.</li>
</ol>5. אימות של GEnome שילוב ואחסון
<ol><li>בצעו את המושבה ה-PCR באמצעות gtfC-פורוורד והמושבה-היפוך התחל על המסך עבור השילוב החוזר. אלקטרופורז כל מושבה מתוצרת ה-PCR על ג'ל שנוצר. אשר את רסיס ה-DNA של כ 1,500 bp.</li>
	<li>בחר אחת המושבות החיוביות באמצעות קיסם ומתת תת התאים הלילה ב 2 מ ל של ציר BHI המכיל spectinomycin.</li>
	<li>מערבבים 0.8 mL של התרבות החיידקית עם 0.8 mL של מערך סטרילי 50% גליצרול ומלאי ב-80 ° c או-20 ° c.</li>
	<li>העבר את הנותרים 1 mL של השעיית התא לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL. חזור על שלבים 2.3 – 2.7 כדי לחלץ את ה-DNA גנומית מן התאים.</li>
	<li>לבצע ה-PCR באמצעות למעלה-קדימה ולמטה לאחור ולמטה DNA גנומית כתבנית. חזור על שלב 3.2 כדי לטהר את מוצר ה-DNA הוגבר מן הג.</li>
	<li>לקבוע את רצף ה-dna של אמפליקון מטוהרים על ידי רצפי DNA. הערה: הקפד לאשר את הדור של ה-S. השיזוף שלו-gtfc על ידי רצפי DNA.</li>
</ol>6. טיהור של פוליהיסטידין-מתויג GTF-SI
<ol><li>פס המכיל את ה -gtfc שלו לצלחת מspectinomycin המכילה את הלוח bhi אגר. מודאת אותם הלילה. ב-37 ° c</li>
	<li>להרים מושבה אחת באמצעות שיניים מעוקר ותאי תת-תרבות ב 3 מ ל של ציר BHI. המלון משלב בין לילה ב-37 ° c.</li>
	<li>להכין שני מבחנות חרוט עם 1 L של ציר BHI ללא spectinomycin. החזר 1 מ ל של תרבות הלילה ההשעיה לתוך 1 L של ציר BHI. המלון משלב בין לילה ב-37 ° c.</li>
	<li>לרכז חלבונים מן התרבות על ידי משקעים אמוניום גופרתי. הערה: לחלץ מגופי תא אם חלבון היעד הוא תאיים. ההליכים הבסיסיים עבור משקעים אמוניום גופרתי מפורטים במקומות אחרים12.<ol>
<li>צנטריפוגה את השעיית התרבות החיידקית במשך 20 דקות ב-10,000 x g ב -4 ° c. לשחזר את התרבות הסופרנטית לתוך מיכל זכוכית 3 L.</li>
		<li>הוסף 1,122 גרם של אמוניום גופרתי ל -2 ליטר של סופרנאטנט (80% רוויה) עם ערבוב נמרץ באמצעות מערבב מגנטי. הניחו לזרז להיווצר 4 שעות או יותר ב -4 ° c עם ערבוב. הערה: ניתן להמשיך את היווצרות הזרז למשך הלילה.</li>
		<li>צנטריפוגה את הפתרון אמוניום סולפט-זירז ב 15,000 x g עבור 20 דקות ב 4 ° c. . בסדר.</li>
		<li>לאסוף את הזרז עם מרית ולהעביר לתוך גביע זכוכית 200 mL. השהה מחדש את כדורי 35 mL של מאגר כריכה (50 mM נה2PO4, 300 מ"מ הנאל, 5 מ"מ הסרביאזול, pH 8.0).</li>
		<li>Dialyze ההשעיה נגד 2,500 mL של מאגר הכריכה באמצעות צינור דיאליזה שנוצר מחדש התאית, ב 4 ° c, עם ערבוב. החליפו את פתרון הדיאליזה לאחר 2 שעות והמשיכו בדיאליזה לילה.</li>
		<li>החלף שוב את פתרון הדיאליזה. המשך לdialyze עבור 2 שעות נוספות.</li>
	</ol></li>
	<li>צנטריפוגה את ההשעיה דיאליזה ב 20,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c. מסננים את הסופרנטנט דרך מסנן קרום באמצעות ציוד סינון יניקה. העבר את פילטרט לבקבוקון 75 ס מ2 .</li>
	<li>אנגיופלסטיקה הפוליהיסטידין-מתויג GTF-SI מההשעיה המלאכותית על ידי קיבוע כרומטוגרפיה של זיקה מתכת (IMAC).
	<ol>
<li>העברה 2 מ ל של משקע ה-IMAC הטעון Ni (כ-1 מ ל שרף) ועד לטור כרומטוגרפי שהפורקן שלו מותאם לצינור סיליקון. הסר את פתרון האחסון על-ידי זרימת כבידה. זהירות: אל תאפשר שרף להתייבש ברחבי IMAC.</li>
		<li>הוסף 3 מ ל של מים מזוקקים לתוך הטור כדי לשטוף את שרף. הוסף 5 מ ל של מאגר הכריכה כדי לבטלת את השרף.</li>
		<li>תכבה את הזרם. עם הזין של הופמן הוסף 5 מ ל של ההשעיה מסוננים משלב 6.5 כדי להפוך את השאיפה.</li>
		<li>מוסיפים את כל השאיפה להשעיה המסוננת הנותרת. מערבולת בעדינות את התערובת למשך 30 דקות ב -4 ° c.</li>
		<li>העמיסו את התערובת בחזרה על הטור. להסיר את ההשעיה על ידי זרם הכבידה. שטוף את שרף ה-IMAC עם 20 מ ל של מאגר מחייב. הערה: להתאים את קצב הזרימה כ 2 מ ל/דקה עם הזין קמצוץ הופמן לאורך ה-IMAC הבא.</li>
		<li>אליוט רקומביננטי GTF-SI עם 20 מ ל של מאגר להתחמק (50 mM נה2PO4, 300 מ"מ הנאל, 500 מ"מ הסרמאזול, pH 8.0). הערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן. יש לאחסן את החומק ב-4 ° c. שרף IMAC ניתן לשימוש חוזר. עיין בהוראות של שרף ה-IMAC.</li>
	</ol></li>
	<li>החלף את מאגר האגירה עם מאגר האחסון (מאגר פוספט 50 מ"מ, pH 6.5) ורכז את הפתרון רקומביננטי GTF-SI כ-1 mL באמצעות יחידת אולטרה-מיון צנטריפוגליים. אחסן את התמיסה הרקומביננטי GTF-SI ב -4 ° c. הערה: לאשר את polyhistidine-מתויג GTF-SI טיהור באמצעות SDS-עמוד13 ו בלוק מערבי14 על ידי שימוש בחזרת peroxidase-מעלה מעלה אנטי פוליהיסטידין נוגדן חד שבטיים. תוספת של בחורים (ריכוז סופי, 0.1%) כדי למנוע את הצורך להימנע ספיחה ספציפי ליחידה, בהתאם חלבון היעד.</li>
</ol>7. שחזור פונקציונלי על ידי רקומביננטי GTF-SI
<ol><li>רצף כל s. mutans המתח על צלחת bhi אגר בנפרד. מודאת הצלחות לילה. ב-37 ° c</li>
	<li>באמצעות קיסם שיניים מעוקר, לאסוף מושבה אחת כדי לחסן ל 2 מ ל של ציר BHI. המלון משלב בין לילה ב-37 ° c.</li>
	<li>השתמש 20 μL של תרבות הלילה של S. mutans gtfc כדי לחסן 2 מ ל של ציר bhi המכיל 1% סוכרוז ללא אנטיביוטיקה בצינור מבחן זכוכית. הוסף את GTF-SI או נפח שווה ערך של הרכב ל -S. mutans gtf תרבות, ותרבות את התאים עם הצינור ממוקם בתנוחה נוטה לילה. הערה: לחטא את הפתרון GTF-SI עם פילטר מזרק סטרילי ולקבוע ריכוז חלבונים באמצעות שימוש בחלבון חומצות בתוך שיטת הפרוטאין15 לפני השימוש.</li>
	<li>מתפרעים את השעיות בתרבות עם מערבל מערבולת במשך 10 ס מ. הדנט את השעיות. רוחצים את צינורות הבדיקה בכמות מספקת של מים מזוקקים.</li>
	<li>הכתם את ביומאמים על קיר הצינור עם 1 מ ל של 0.25% Coomassie כחול מבריק (CBB).</li>
	<li>Decant הפתרון המכתים אחרי 1 דקות. שטוף את צינורות הבדיקה עם כמות מספקת של מים מזוקקים. . האוויר מתייבש את צינורות הבדיקה</li>
</ol>

<ol><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual+3rd+Edition%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Edition</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).</li>
<li>Murata, T., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+functional+analysis+of+a+gene+of+interest+in+Streptococcus+mutans%3A+gene+disruption+followed+by+purification+of+a+polyhistidine-tagged+gene+product%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Method for functional analysis of a gene of interest in Streptococcus mutans: gene disruption followed by purification of a polyhistidine-tagged gene product.</a> Journal of Microbiological Methods. 155, 49-54 (2018).</li>
<li>Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+splicing+by+overlap+extension%3A+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).</li>
<li>Murata, T., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+chloride+channel+permease+to+fluoride+resistance+in+Streptococcus+mutans%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans.</a> FEMS Microbiology Letters. 363 (11), 101(2016).</li>
<li>Murata, T., Okada, A., Matin, K., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+gene-disrupted+Streptococcus+mutans+strain+without+gene+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Generation of a gene-disrupted Streptococcus mutans strain without gene cloning.</a> Journal of Visualized Experiments. (128), (2017).</li>
<li>Hanada, N., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+the+Streptococcus+mutansgtfC+gene%2C+coding+for+synthesis+of+both+soluble+and+insoluble+glucans%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of the Streptococcus mutansgtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans.</a> Infection and Immunity. 56 (8), 1999-2005 (1988).</li>
<li>LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+nucleotide+base+sequence+analysis+of+a+spectinomycin+adenyltransferase+AAD%289%29+determinant+from+Enterococcus+faecalis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 35 (9), 1804-1810 (1991).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).</li>
<li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR%3A+The+Polymerase+Chain+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">PCR: The Polymerase Chain Reaction.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
<li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">DNA Gel Electrophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
<li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel+Purification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Gel Purification.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
<li>Wingfield, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+precipitation+using+ammonium+sulfate%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Protein precipitation using ammonium sulfate.</a> Current Protocols in Protein Science. 84 (1), (2016).</li>
<li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separating+Protein+with+SDS-PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Separating Protein with SDS-PAGE.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
<li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Western+Blot%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The Western Blot.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li>
<li>Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+putative+cariogenic+properties+in+Streptococcus+mutans%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans.</a> Infection and Immunology. 41 (2), 722-727 (1983).</li>
<li>Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+ligation+mutagenesis+in+transformable+streptococci%3A+application+and+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency.</a> Journal of Microbiological Methods. 49 (2), 193-205 (2002).</li>
<li>Ge, X., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+gene+deletions+in+Streptococcus+sanguinis+by+high+throughput+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

עיצוב התחל הוא הצעד הקריטי ביותר בפרוטוקול. רצפי של Gtfc-הפוכה ו- spcr-קדימה נקבע באופן אוטומטי על בסיס רצפים של שניהם אזור סוף 3 ′ של gtfc ו 5 ′ קצה אזור של spcr. כל פריימר כולל 24 בסיסים משלימים הקודדים מקשר GS ורצף התגים שלו-coding באזורים 5 ' שלהם. שיבוש רצפי הרגולציה הילידים הממוקמים באזורים הנמצאים במעלה הזרם ניתן להימנע על ידי הוספת שלו-tag-קידוד רצפים לסוף 3 ′. את ה-DNA לעצור קודון יש להסיר מתוך ההילוך האחורי gtfcוהוסיף ל- spcr...

ניתוח של הפונקציה של הגן בדרך כלל כרוך השוואה של תכונות פנוטיפ של זנים מסוג פראי לזנים בהם הגן של העניין שובשו. ברגע שהוא מופק זן גנטי, תוספת אקסוגני של המוצר הגן מאפשר שיקום פונקציונלי.
השיטה הנפוצה ביותר להשגת מוצרי גנים מטוהרים הנדרשים עבור שחזור שלאחר השחזור הוא על ידי ביצוע ביטוי הטרוולוגי בשנת הכלאיים קולי1. עם זאת, הביטוי של חלבונים הממברנה או חלבונים מסה גבוהה המולקולרי הוא לעתים קרובות קשה באמצעות מערכת זו1. במקרים אלה, חלבון היעד מבודד בדרך כלל מן התאים המהווה באופן מקורי את החלבון באמצעות סדרה מורכבת של צעדים, אשר עשוי להוביל לאובדן מוצר הגן. כדי להתגבר על בעיות אלה, הליך פשוט פותחה עבור טיהור מוצר גנטי בעקבות הפרעה גנטית שיטה2, pcr מבוססי DNA שילוב שיטה3 (המיועד היתוך שני שלבים PCR), ו אלקטרופורציה גנטית טרנספורמציה בתוך סטרפטוקוקוס. תוספת של תג polyhistidine (שלו-tag) כדי C-הטרמינוס של המוצר הגן מקלה על טיהור שלה על ידי קיבוע מתכת כרומטוגרפיה של זיקה (IMAC).
כדי לבודד את הטאג ' שלו-הבעת מאמץ, את ה-DNA כל גנומית של הגן של עניין (בתוך זה שלו-tag-הבעת זן גן שיבשו) מוחלף גנים סמן אנטיביוטי עמידים. ההליך ליצירת התגים שלו-ביטוי שהוניס כמעט זהה לזה ליצירת זן גנים שיבשו כפי שמתואר קודם לכן4,5. לכן, השיטות עבור שיבוש גנים ובידוד המוצר הגנטי יש לבצע כניסויים סדרתיים עבור ניתוח פונקציונלי.
בעבודה הנוכחית, רצף polyhistidine-קידוד מצורף לקצה של 3 ′ של Gtfc (מקום genbank תג SMU_1005) גן, קידוד glucosyltransferase-SI (gtfc-si) ב S. מוסטנים6. לאחר מכן, בוצעו לימודי ביטויים במינים מסוג streptococcal. השגת ביטוי הטרוולוגי ב- E. coli קשה, כנראה בגלל המסה המולקולרית הגבוהה של gtfc-SI. הנבגהזה נקרא . אס. תרשים סכמטי המתאר את הארגון של ה- gtfc וspectinomycin ההתנגדות הגנטית( spcr)7 הבית בסוג פראי . מוסטנים והנגזרים שלו מוצג ב איור 1. GTF-SI הוא חלבון הסוד שתורם להתפתחות של ביוגניים שיניים מקרגני6. תחת נוכחותו של סוכרוז, הארגון משקיף על משטח זכוכית חלק במתח של WT, אבל לא ב-s. המתח המובש(Δ gtfc)2,5 . היווצרות ביוגניים משוחזר ב -S. mutans gtfc בתוספת אקסוגני של רקומביננטי gtfc-SI. המתח, S. mutans שלו-gtfc, משמש לאחר מכן כדי לייצר את gtfc-SI.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Nippon Genetics</td><td>NE-AG02</td><td>לאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז</td></tr><tr><td>Anaeropack</td><td>מיצובישי גז כימי</td><td>A-03</td><td>מערכת תרבית אנאירובית</td></tr><tr><td>נוגדן חד שבטי אנטי-His-Tag MBL</td><td></td><td>D291-7</td> ערכת בדיקת חלבון BCA <td>מצומד HRP</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td>מדידת ריכוז</td></tr> <tr><td>החלבוןמרק עירוי לב מוח</td><td>Becton, Dickinson</td><td>237500</td><td>מדיום תרבית חיידקים</td></tr><tr><td>CBB R-250</td><td>Wako</td><td>031-17922</td><td>לצביעת ביופילם</td></tr><tr><td>יחידת אולטרה סינון צנטריפוגלית</td><td>Sartorius</td><td>VS2032</td><td>החלפת חיץ וריכוז חלבון</td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Kubota</td><td>7780II</td><td></td></tr><tr><td>עמודה כרומטוגרפית</td><td>Bio-Rad</td><td>7321010</td><td>עבור מהדק</td></tr><tr><td>ממברנה דיאליזה</td> IMAC <td>מותג פישר</td><td>21-153-100</td><td></td></tr><tr><td>צינורות דיאליזה</td><td>כאחד</td><td>2-316-06</td><td></td></tr><tr><td>DNA פולימראז</td><td>Takara</td><td>R045A</td><td>נאמנות גבוהה DNA פולימראז</td></tr><tr><td>ריצוף DNA</td><td>Eurofins גנומיקה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ECL מצע</td><td>Bio-Rad</td><td>170-5060</td><td>לכתמים מערביים</td></tr><tr><td>EDTA (0.5 M pH 8.0)</td> <td>Wako</td><td>311-90075</td><td>Tris-EDTA הכנת חיץ</td></tr><tr><td>קובטה אלקטרופורציה</td><td>Bio-Rad</td><td>1652086</td><td>פער של 0.2 ס"מ</td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>Bio-Rad</td><td>1652100</td><td></td></tr><tr><td>EtBr תמיסת</td><td>Nippon Gene</td><td>315-90051</td><td>לאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז</td></tr><tr><td>חותך להקת ג'ל</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-830</td><td></td></tr><tr><td>ג'ל ערכת מיצוי</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-91202</td><td>מיצוי DNA מג'ל אגרוז</td></tr><tr><td>Imager</td><td>GE Healthcare</td><td>29083461</td><td>עבור SDS-PAGE וכתמים מערביים</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Wako</td><td>095-00015</td><td>הכנת מאגר מחייב ופליטה</td></tr><tr><td>חממה</td><td>Nippon Medical & מכשירים כימיים</td><td>EZ-022</td><td>הגדרת טמפרטורה: 4 מעלות; חממת C</td></tr><tr><td></td><td>Nippon Medical & מכשירים כימיים</td><td>LH-100-RDS</td><td>הגדרת טמפרטורה: 37 & deg; מסנן C</td></tr><tr><td>ממברנה</td><td>Merck Millipore</td><td>JGWP04700</td><td>0.2 ומיקרו; </td></tr><tr><td>קוטר m מיקרוצנטריפוגה</td><td>Kubota</td><td>3740</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Wako</td><td>191-01665</td><td>הכנת מאגר מחייב ומאגר פליטה</td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot; 2H2O</td><td>Wako</td><td>192-02815</td><td>הכנת מאגר מחייב ומאגר פליטה</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Wako</td><td>198-13765</td><td>הכנת מאגר מחייב ומאגר פליטה</td></tr> <tr><td>(NH4)2SO4</td><td>Wako</td><td>015-06737</td><td>משקעים של אמוניום גופרתי</td></tr><tr><td>שרף טעון Ni</td><td>Bio-Rad</td><td>1560133</td><td>עבור IMAC</td></tr><tr><td>פריימרים PCR</td><td>Eurofins Genomics</td> חלבון <td>בהזמנה</td><td></td>אישית</tr><tr><td>תקן</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0381</td><td>עבור SDS-PAGE ו-Western Blotting</td></tr><tr><td>מנגנון סינון ממס</td><td>כאחד</td><td>FH-1G</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycin</td><td>Wako</td><td>195-11531</td><td>אנטיביוטיקה; שימוש ב-100 &mu; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>מסנן מזרק סטרילי</td><td>Merckmillipore</td><td>SLGV004SL</td><td>0.22 ומיקרו; m קוטר</td></tr><tr><td>Streptococus mutans &#916; gtfC</td><td>זן מלאי במעבדה.</td><td></td><td>gtfC הוחלף ב-spcr</td></tr><tr><td>Streptococus mutans UA159</td><td>Stock במעבדה.</td><td></td><td>S. mutans ATCC 700610, זן מסוג פרא</td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>Wako</td><td>196-00015</td><td>לפיתוח ביופילם</td></tr><tr><td>TAE (50 ופעמים; )</td><td>Nippon Gene</td><td>313-90035</td><td>לאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז</td></tr><tr><td>ציקלר תרמי</td><td>Bio-Rad</td><td>PTC-200</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (1 M, pH 8.0)</td> <td>Wako</td><td>314-90065</td><td>הכנת מאגר Tris-EDTA</td></tr></tbody></table>

טיהור חלבון המסה המולקולרי הגבוה בסטרפטוקוקוס

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

ההסבר של הפונקציה של הגן בדרך כלל כרוך השוואה של תכונות פנוטיפ של זנים סוג פראי וזנים שבו הגן של העניין שובשו. אובדן של פונקציה בעקבות הפרעה גנטית שוחזר לאחר מכן על ידי תוספת אקסודוגני של המוצר של הגן שיבש. זה עוזר לקבוע את התפקיד של הגן. שיטה שתוארה בעבר כרוכה ביצירת מתח Gtfc שיבש סטרפטוקוקוס השיזוף . כאן, שיטה בלתי תובענית מתוארת לטיהור המוצר הגנטי Gtfc מן המתח החדש שנוצר בעקבות הפרעה גנטית. זה כרוך תוספת של רצף polyhistidine-קידוד בסוף 3 ′ של הגן של עניין, אשר מאפשר טיהור פשוט של המוצר הגן באמצעות כרומטוגרפיה של זיקה מתכת ללא קיבוע. אין תגובות אנזימטיות מלבד ה-PCR נדרשים לשינוי גנטי בשיטה זו. השחזור של מוצר הגן על ידי התוספת אקסוסוגני לאחר הפרעה גנטית היא שיטה יעילה לקביעת פונקציה גנטית, אשר עשוי גם להיות מותאם למינים שונים.

איור 3 מציג את הגודל של כל אמפליצין מ-pcr הראשון (איור 3a) ו-Pcr השני (איור 3a). הגודל של כל אמפליקון התכתב עם הגודל החזוי, כפי שמתואר בטבלה 1. איור 4A הופעות S. מושבות מוסדרות שינתה את המוצר השני של ה-PCR ומצופה בלוחות bhi אגר המכילים spectinomycin. מוצרי ה-PCR הושבה לאחר מכן הופעל על ג'ל הצמח (איור 4B). כל אמפליקו...

מתוארים כאן היא שיטה פשוטה לטיהור של מוצר הגן ב סטרפטוקוקוס מויזוף. טכניקה זו עשויה להיות יתרון על טיהור של חלבונים, בעיקר חלבונים הממברנה וחלבונים המוניים גבוה המולקולרי, והוא יכול לשמש עם מינים שונים חיידקים אחרים.

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המיקרוביולוגיה כגון, כיצד מוצר גנים שקשה לבטא ב- E.Coli מטהר. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם כי אין תגובה אנזימטית, מלבד PCR, הוא המוביל, ויישומים נפוצים לטיהור חלבונים ניתן להשתמש. למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לטיהור חלבון במוטנים סטרפטוקוקוס, זה יכול להיות גם apprised למינים אחרים של מיקרוביוטה.הדגמת ההליך תהיה ד"ר ממיקו ימאשיטה, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלנו. לאחר תכנון פריימר והפקת דנ"א גנומי מסטרפטוקוקוס מוטנס, בצע את ה- PCR הראשון באמצעות מוטנים סטרפטוקוקוס מסוג פראי ו- GFC שיבשו את הגנום של סטרפטוקוקוס מוטנס כתבניות PCR. הגבר את האזורים המטפחים את החלק במורד הזרם של הגן gtfC ואת אלה המטפחים את גן ההתנגדות לספקטינומיצין באמצעות gtfC-forward המוכן והתקדמות הפוכה ו- spc r-forward ו- reverse primer.לאחר מכן, אלקטרופורזה כל מוצר PCR על 1%agarose ג'ל. השתמש ב bandcutter ג'ל כדי למלמל את שברי ה-DNA הרצויים של כ 1, 000 זוגות בסיס ו 2, 000 זוגות בסיס מן הג'ל לתוך צינורות microcentrifuge. מוסיפים 500 מיקרוליטרים של חיץ מנוכר לתוך כל צינור ו דגירה אותם במשך 10 דקות ב 56 מעלות צלזיוס כדי להמיס את פרוסות הג'ל.לטהר את השברים באמצעות שיטת מיצוי ג'ל מבוססת ממברנה סיליקה. בצע PCR שני באמצעות המוצרים של PCR הראשון כתבניות PCR עם פריימרים מקוננים קדימה וקונן לאחור. כאשר מוצר PCR השני לא יכול להיות מאושר על ידי אלקטרופורזה, זוג פריימר מקונן אחר צריך להיות מתוכנן.אלקטרופורזה חמישה מיקרוליטרים של תערובת PCR על ג'ל אגרוז. אשר את הדור של אמפייקון המתאים של כ 3, 000 זוגות בסיס על ידי אתידיום ברומיד ג'ל כתמים תמונה ולהמשיך על פי כתב היד. עכשיו, לערבב חמישה microliters של מוצר PCR השני מרוכז אל אלוציוט 50 מיקרוליטר של קר כקרח, סוג פראי מוסמך סטרפטוקוקוס מוטאן תאים, קפוא בעבר.מוסיפים את התערובת לקובט אלקטרופולציה וממקמים את הקוט בתא הקוט של מנגנון האלקטרופוטם. תן פעימה חשמלית אחת של 1.8 קילו-וולט, 600 אוהם ו-10 מיקרופאראדות ל-2.5 אלפיות שנייה לתאים. הוסיפו 500 מיקרוליטרים של מרק עירוי לב-מוח לקובט.מיד להפיץ 10 עד 100 microliters של ההשעיה על המוח-לב עירוי auger צלחות המכילות spectinomycin. הדגירה את הצלחות במשך יומיים עד שישה ימים ב 37 מעלות צלזיוס עד המושבות גדלו מספיק כדי להיות הרים. לאחר הדור של סטרפטוקוקוס מוטנס פוליהיסטידין רצף קידוד משולב זן וחיסון לילה ללא spectinomycin על פי כתב היד, צנטריפוגה ההשעיה תרבות חיידקי במשך 20 דקות ב 10, 000 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס.מעבירים את תרבות העל-טבעית לתוך זכוכית באורך שלושה ליטרים. כדי לרכז את החלבונים מן התרבות supernatant, מניחים את שני ליטר על טבעי על ערבוב מגנטי ולהתחיל ערבוב נמרץ. מוסיפים 1, 122 גרם של אמוניום גופרתי ומאפשרים לזרז להיווצר עם ערבוב נמרץ בארבע מעלות צלזיוס על פני תקופה של ארבע שעות או לילה. הבא.צנטריפוגה אמוניום סולפט זירז פתרון ב 15, 000 פעמים גרם במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. תפענח את העל-טבעי. עם מרית, לאסוף את המשקע ולהעביר אותו לתוך זכוכית 200 מיליליטר.תן שימוש חוזר לכדורים ב-35 מיליליטר של חיץ מחייב. לאחר מכן, להעביר כל כ 25 מיליליטר של ההשעיה לתוך צינורות דיאליזה תאית מחדש. מניחים את צינורות הדיאליזה לתוך 2.5 ליטר של חיץ קשירה ערבוב על stirrer בארבע מעלות צלזיוס כדי להנייד את ההשעיה.החלף את פתרון הדיאליזה לאחר שעתיים והמשך בדיאליזה במהלך הלילה. לאחר מכן להעביר את ההשעיה דיאליזה מן הצינורות צינורות צנטריפוגה למקם את הצינורות בצנטריפוגה ב 20, 000 פעמים גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. בעזרת ציוד סינון מקטעים, יוצקים את העל-טבעי מעל מסנן קרום 0.2 מיקרומטר כדי לסנן.מעבירים את הסינון לבקבוק 75 מיליליטר. כדי לשבר את gtfSI מתויג פוליהיסטין מן ההשעיה filtrated, תחילה להכין כרומטוגרפיה זיקה מתכת משותקת. לאחר שיווי המשקל של השף על פי כתב היד, סגור את תרנגולי הצביטה של הופמן.הוסף חמישה מיליליטר של ההשעיה המסוננת לתוך העמודה כדי להפוך תרחיף. לאחר מכן, מעבירים את כל תרחיף ההשעיה המסונן הנותרים ומערבבים את התערובת בעדינות במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. טוענים את התערובת בחזרה לעמודה.פתח את התרנגול צביטה הופמן כדי להסיר את ההשעיה על ידי זרימת הכבידה. לשטוף את שף IMAC עם 20 מיליליטר של מאגר איגוד ולאחר מכן, elute 20 מיליליטר של מאגר אלוטיום כדי להשיג את gtfSI רקומביננטי. לאחר מכן, לטעון את eluate לתוך צינור סינון אולטרה צנטריפוגלי צנטריפוגה הפתרון ב 2, 000 פעמים g במשך 1 עד 5 דקות כדי לרכז את הפתרון.רוקנו את מיכל הסינון והוסיפו 15 מיליליטר של מאגר אחסון לצינור. צנטריפוגה המדגם שוב לחזור על התהליך פעמיים נוספות. פתרון gtfSI רקומביננטי מרוכז סוף סוף כמיליליטר.מעבירים את התרכיז לצינור מיקרוצנטריפוגה ומאחסנים בארבע מעלות צלזיוס. המשך עם פרוטוקול השחזור הפונקציונלי של השאר. בפרוטוקול זה, אלקטרופורזה ג'ל agarose מראה כי הגודל של כל אמפייקון מן PCR הראשון PCR השני התכתב עם הגודל החזוי.מושבות סטרפטוקוקוס מוטנס השתנו עם מוצר PCR השני מצופה על המוח-לב עירוי auger צלחות המכיל ספקטינומיצין. מוצרי PCR מושבה לרוץ על ג'ל אגרוז מראה כי כל אמפייקון היה בגודל החזוי. חלבון מטוהר עם כרומטוגרפיה זיקה מתכת משותק נצפתה כמו להקה אחת על ידי SDS-PAGE.כתם מערבי, שבוצע באמצעות נוגדן אנטי פוליהיסטידין, אישר כי הלהקה שנצפו היה החלבון המתויג פוליהיסטידין הצפוי של 160 קילודלטון. יכולת יצירת הביופילם שמקורה בסוכרוז נראתה רק עם סטרפטוקוקוס מוטנס פראי מסוג וסטרפטוקוקוס מוטנס His-gtfC, שיצר ביופילם חסיד על קיר הצינור בנוכחות 1% סוכרוז. זה לא נצפה סטרפטוקוקוס מוטנס דלתא GTFC.עם זאת, התוספת של 25 מיקרוגרם של gtfSI רקומביננטי שחזר את יכולת היווצרות ביופילם חסיד סטרפטוקוקוס mutans דלתא GTFC. מאז ההצלחה של שיטה זו תלויה הגברה PCR השני, המוצר PCR השני חייב להיות מאושר על ידי אלקטרופורזה. כבר עכשיו, חלבון מסוג היסטידין המתקבל בשיטה זו מתכנס גם לחומצות פונקציונליות, כגון אינטראקציות חלבון-חלבון.לאחר התפתחותה, טכניקה זו, בשילוב עם שיבוש גנים, סללה את הדרך לחוקרים בתחום המיקרוביולוגיה לחקור את תפקוד הגנים.

purification-of-a-high-molecular-mass-protein-in-streptococcus-mutans

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

אמא הוא חלבון ייחודי הקשור Magnetosome אשר הוצגה להיות מעורב ההפעלה magnetosome. כאן אנו מציגים את הפרוטוקול טיהור של אמא המחיקה מוטציה (MamAΔ41)...

טיהור של מ magneticum מסננים השגריר-1 Magnetosome חלבון Associated MamAΔ41

טיהור זיקה של חלבונים מתויגים בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (APMS) היא שיטה רבה עצמה למיפוי השיטתי של רשתות אינטראקצית חלבון ועל חקירת הבסיס המכאני של תהליכים ביולוגיים. כאן, אנו מתארים פפטיד הליך אופטימיזציה רציפת זיקה (SPA) APMS פתח...

זיהוי של קומפלקסי חלבונים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות טיהור זיקת פפטיד סדרתית בשילוב עם טנדם המוני ספקטרומטריית

מקור: Murata, T., et al. טיהור חלבון בעל מסה מולקולרית גבוהה בסטרפטוקוקוס מוטנס. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים הליך שלב אחר שלב לטיהור חלבון מתויג פוליהיסטידין המופרש מסטרפטוקוקוס מוטנס.

נוהל לטיהור חלבון מתויג פוליהיסטידין מסטרפטוקוקוס מוטנס

גישת יוכימיים מתוארת לזהות באינטראקציות vivo חלבונים (PPI) של חלבונים בממברנה. השיטה משלבת צלב המקשר חלבון, טיהור זיקה וספקטרומטריית מסה, וניתנת להתאמה כמעט לכל סוג תא או האורגניזם. עם גישה זו, גם זיהוי של PPI החולף הופך לאפשרי.

קרום עמוד שדרה: ביוכימית כלי לזיהוי חלבונים אינטראקציות של חלבונים בממברנה בVivo

שיטה מתוארת לניקוי יעיל של חלבוני תאום סטרפטוקוקוס מתויג היתוך והמתחמים הספציפיים שלהם על streptavidin הותאם שרף (סטרפטוקוקוס-Tactin) קוולנטית צולבים עם Bis suberate (sulfosuccinimidyl) (BS3). יש שיטת היתרונות של מהירות מהירה, התאוששות חלבון מטרה טובה וטוהר גבוהים, והוא תואם את ניתוח שלאחר מכן על ידי ספקטרומטריית מסה.

טיהור צעד אחד של חלבונים מתויגים-Twin-סטרפטוקוקוס והמתחמים שלהם בSuberate (BS3) שרף סטרפטוקוקוס-Tactin הצולב עם Bis (sulfosuccinimidyl)

פוליפפטידים דמויי אלסטין הם biopolymers גירוי מגיב עם יישומים החל טיהור חלבון רקומביננטי לאספקת סמים. פרוטוקול זה מתאר את הטיהור ואפיון של פוליפפטידים כמו אלסטין והתכת פפטיד או חלבון שלהם מחיידקי Escherichia באמצעות שלב טמפרטורת פתרון מעבר ההתנהגות הקריטית נמוך יותר שלהם כאלטרנטיבה פשוטה לכרומטוגרפיה.

טיהור ללא chromatographic של פוליפפטידים דמויי אלסטין רקומביננטי וFusions עם פפטידים וחלבונים מן<em&gt; חיידקי Escherichia</em

פרולין-פרולין אנדופפטידאז-1 (PPEP-1) הוא מטאלופרוטיאז מופרש ויעד תרופה מבטיח מהפתוגן האנושי קלוסטרידיום דיפיצילה. כאן אנו מתארים את כל השיטות הדרושות לייצור וקביעת המבנה של חלבון זה.

הפקה, התגבשות וקביעת מבנה<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 באמצעות Microseeding ואבץ-SAD

פרוטוקול זה מתאר שיטת טיהור ל-רקומביננטי הסידן מחייב חלבון בחינם S100A12 והוא המושרה היונים שלה עבור גירוי מונוציט אנושי.

טיהור של האדם S100A12 ואת היונים שלה הנגרמת Oligomers עבור גירוי תא החיסון

מאמר זה מתאר מתודולוגיה לביטוי יתר של Nsp15 רקומביננטי, נוקלאז רעיל, במערכת ביטוי C41(DE3), ואחריה טיהור החלבון המתויג באמצעות כרומטוגרפיה של זיקה והדרת גודל. ניתן להתאים את הפרוטוקולים האלה לחלבונים רעילים מאתגרים אחרים.

שאיבת יתר וטיהור נוקלאז רעיל מ-Escherichia coli

פרוטוקול זה מתאר שיטת חילוץ והשקעה מהירה וניתנת לשחזור מבוססת ממס אורגני לטיהור פוליפפטיד דמוי אלסטין (ELP) מ-Escherichia coli, ומספק חלופה ניתנת להרחבה פוטנציאלית לשיטות טיהור ELP קונבנציונליות.

טיהור יעיל של פוליפפטידים דמויי אלסטין (ELPs) מ-E. coli באמצעות שיטת חילוץ והשקעה מבוססת ממס אורגני

למד שיטה לטיהור חלבוני ממברנה וחלבוני מסה מולקולרית גבוהה ב-Streptococcus mutans באמצעות PCR וכרומטוגרפיית IMAC. שיטה זו מספקת חלופה יעילה לטיהור חלבונים הקשים לביטוי ב-E. coli.

טיהור חלבון המסה המולקולרי הגבוה בסטרפטוקוקוס

גלה סרטונים נוספים