שעתוק מיפוי אתר התחל באמצעות כלוב קלט-נמוך-Super-נמוכה

שיטה זו יכולה לסייע לענות על שאלות מפתח בתחום ויסות הגנים, מכיוון מאפשרת יחצ"ן ליבה וגילוי משפר באמצעות כמויות נמוכות של חומר התחלתי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת מיפוי רזולוציית נוקלאוטיד יחיד נוקלאוטיד בלתי משוחדת, כלל-גנומית, של אתרי התחלה שעתוק RNA polymerase II באמצעות רק 10 ננוגרם של RNA הכולל. CAGE הוא להוכיח להיות לא יסולא בפז לחשיפת אתרי התחלת שעתוק הקשורים למחלות שיכולים לשמש סמני אבחון.

SLIC-CAGE מרחיב תגליות אלה כדי להגדיל דגימות כגון ביופסיות רקמות. SLIC-CAGE מתאים באופן אידיאלי לניתוח מקדם מעמיק וברזולוציה גבוהה של סוגי תאים שבריריים, כולל שלבים התפתחותיים עובריים מוקדמים או רקמה עוברית ממגוון רחב של אורגניזמים מודל. מאז ישנם צעדים רבים בפרוטוקול זה, חשוב למזער את אובדן המדגם בכל שלב על ידי טיפול כדי לאחזר חומר רב ככל האפשר בעת העברה בין צינורות.

התחל בהכנת תמהיל PCR עבור כל תבנית. שלב חיץ, dNTPs, פריימר קדמי ייחודי, פלסמיד תבנית עם גן המוביל הסינתטי ופולימראז היתוך בהתאם לכיווני כתב היד. מערבבים רייגנטים על ידי צינורות.

הוסיפו 90 מיקרוליטרים של תערובת ה-PCR ל-10 מיקרוליטרים של כל פריימר הפוך וערבבו. עיין בכתב היד לתנאי התרמוצ'יקלינג. בצע שעתוק הפוך או RT על RNA של עניין.

שלב מיקרוליטר אחד של פריימר שעתוק הפוך, 10 ננוגרם של RNA, ו 4, 990 ננוגרם של תערובת נושא בנפח כולל של 10 microliters. מערבבים על ידי צינור למעלה ולמטה. מחממים את התערובת ל-65 מעלות במשך חמש דקות ומיד מניחים אותה על קרח.

מכינים את תערובת RT בהתאם לכיווני כתב היד ומוסיפים 28 מיקרוליטרים של התערובת ל-10 מיקרוליטרים של רנ"א. מערבבים את תכולת הצינור על ידי צינורות עד הומוגני. הפעל RT בתרמוציקלר.

לאחר השלמת שעתוק הפוך, לטהר את המוצר עם DNase ו RNase ללא SPRI חרוזים מגנטיים. מוסיפים את חרוזים לתערובת RT ביחס נפח של 1.8 לאחד ומערבבים היטב על ידי צינור. תן לתערובת לשבת בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות.

לאחר מכן, מניחים את חרוזים על מעמד מגנטי ולתת להם להפריד במשך חמש דקות. השליכו את העל-טבעי והוסיפו 200 מיקרוליטרים של אתנול טרי 70% לחרוזים. אין לערבב את חרוזים או להוריד אותם מהעמוד המגנטי ולהסיר את האתנול מיד לאחר ההוספה.

שמור את הצינור על מעמד מגנטי ולהסיר את כל העקבות של אתנול על ידי דחיפת כל טיפות שנותרו החוצה עם פיפטה P10. מיד להוסיף 42 microliters של מים, פיפטה למעלה ולמטה 60 פעמים כדי לחמק מדגם, דואג לא לגרום קצף. דגירה הצינור ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות ללא המכסה ולאחר מכן להפריד את חרוזים על הדוכן המגנטי.

לאחר מכן, להעביר את supernatant לקבוצה חדשה של צינורות, דואג לאחזר את כל על טבעי אבל למנוע נשיאת חרוזים. לאחר הטיפול RNase I, מערבבים 45 מיקרוליטרים של מדגם עם 105 מיקרוליטרים של חרוזים סטרפטבידין מוכנים ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. במהלך הדגירה, פיפטה המדגם כל 10 דקות לערבב.

לאחר מכן, להפריד את חרוזים על מעמד מגנטי ולהסיר את supernatant. לשטוף את חרוזים עם חוצצים A, B, ו C.החל חיץ A, resuspend את חרוזים ב 150 microliters של חיץ. נפרדים על מעמד מגנטי במשך שתיים עד שלוש דקות, ולאחר מכן להסיר את supernatant.

מחממים מאגרים B ו- C ל-37 מעלות צלזיוס וחוזרים על שלבי הכביסה. כדי להסיר את כל RNA שאינו כתרים, חשוב לשטוף את חרוזי סטרפטבידין וקירות הצינור ביסודיות כדי להסיר לחלוטין את מאגר לשטוף לפני הוספת הבא. כדי לשחרר את cDNA, להשתמש מחדש את חרוזים 35 microliters של חיץ RNase I 1X ודגירה ב 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.

לאחר הדגירה, מיד מניחים את חרוזים על קרח במשך שתי דקות. מפרידים את חרוזים על מעמד מגנטי ומעבירים את העל-טבעי לסט חדש של צינורות. תן שימוש חוזר בחרוזים ב-30 מיקרוליטרים של חיץ RNase I 1X ולאחר מכן הפרד על מעמד מגנטי.

שלבו את העל-טבעי עם העל-טבעי שנאסף בעבר לקבלת נפח כולל של כ-65 מיקרוליטרים. בצע qPCR כדי לקבוע את מספר מחזורי PCR עבור הגברה בספריית היעד. הכינו את התערובות הראשיות של qPCR להגברת ספריות שלמות של דנ"א מהנשא.

קבעו את תנאי התרמוצ'יקלינג בהתאם לכיווני כתב היד והעצמו את הדגימה המוכנה. פרוטוקול SLIC-CAGE מאפשר להשיג ספריות מוכנות ל רצף מננוגרם של חומר RNA התחלתי. אורך הקטע בספרייה הסופית נע בין 200 ל-2,000 זוגות בסיסים.

קטעים קצרים יותר הם ממצאים של PCR והם עלולים לגרום לבעיות רצף לאורך הקו. ניתן לבצע סבבים נוספים של בחירת גודל כדי להסיר אותם. בהשוואה NanoCAGE, SLIC-CAGE מציג ביצועים טובים יותר באופן משמעותי בזיהוי אתר התחלת שעתוק, אשר ניכר מן המקלט פועל עקומות אופייניות של שתי טכניקות שבוצעו על כמויות שונות של S.cerevisiae הכולל RNA.

בעת ביצוע פרוטוקול זה, חשוב לזכור כי אובדן מדגם עלול להוביל לספריות בעלות מורכבות נמוכה. כדי למנוע זאת, יש להשתמש בטיפים ובצינורות של פיפטה עם כריכה נמוכה. ללא SLIC-CAGE, ניתוח מקדם של סוגי תאים שונים היה עד כה בלתי נגיש.

זה כולל ניתוח של שלבים התפתחותיים עובריים או רקמה עוברית ממגוון רחב של אורגניזמים מודל.