Name: שיטת הקרנה של תא בודד לבחירת ושחזור של נוגדנים עם הצורך הרצוי מתוך זיכרון אנושי מועשר B אוכלוסיות תאים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 s
Description: למדו את שיטת BSelex לבידוד נוגדנים ספציפיים לאנטיגן מתאי B אנושיים באמצעות ציטומטריית זרימה ו-PCR של תא בודד. שיטה זו מאפשרת שחזור מהיר של שרשראות כבדות וקלות מזווגות לפיתוח נוגדנים תרפויים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות ללוסי צ'אממאס, מרתה קוסטה, ג'ולי קים, ננסי ארדיה, ויורם מקאדו עבור בדיקות נרחבות של שינויי שיטה רבים ועידון של פלטפורמת BSelex הנוכחית.

השימוש בדגימות של מתנדבים אנושיים בעקבות פרוטוקולים שאושרו על ידי מכון המחקר של סקריפס מחקר הלוח סקירה מוסדית. הסכמה מושכלת הושגה מהתורמים לפני תרומת הדם.
1. הכנה מגיב
<ol><li>
תאי דם היקפיים (PBMCs)
	<ol>
<li>שחזר את התאים ההיקפיים של דם. מתורמים אנושיים רגילים בבידוד Cryopreserve ב 50,000,000 תאים/mL ב 90% בסרום של שור עוברי (FBS) ו-10% diמתיל סולפוקסיד (DMSO). הקפא את התאים ב-80 ° צ' והעבר לחנקן נוזלי לאחסון ארוך טווח.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
תיוג היעד אנטיגן פפטידים למיון
	<ol>
<li>ליצור או להשיג פפטידים ספציפיים חלבון היעד (עד 70 שאריות ארוכים) עם biotin טרמינל.</li>
		<li>תווית 4 נמול של כל פפטיד biotinylated בודדים עם streptavidin covalently רוב מחובר PE (R-phycoמרין) או APC (allophycocyanin) בצינורות נפרדים. להכין באמצעות יחס טוחנת של 9:1 פפטיד streptavidin (SA), עם ריכוז סופי של בערך 3.2 μM עבור SA-PE ו 5.7 μM SA-APC. הכינו את ביוטין טטרמרס כשליטה שלילית.</li>
		<li>מודטה כל תערובת פפטיד בלילה, בחשיכה, ב 4 ° c עם ערבוב איטי.</li>
		<li>הסר fluorophore מאוגד על ידי העברת פפטידים המסומנים באמצעות microcolumns המכילים חרוזים פוליאקרילמיד.</li>
		<li>מאגר פפטיד הטמרס עד 2 חודשים ב 4 ° c.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. מיון תאים
<ol><li>לפחות 1 h עד 16 שעות לפני CD22 + בידוד, הפשרת PBMCs התורם ולאפשר לנוח ב 37 ° c.
	<ol>
<li>הסירו את הבקבוקונים מהמקפיא והעבירו מיד לאמבט מים ב37 ° c. , כשהבקבוקונים כמעט הופלו. העבירו לאזור העבודה</li>
		<li>העבר את התוכן של כל בקבוקון לצינורית 50 mL המכילה מדיום טרום-שחומם (שמירה על התורמים בנפרד). הוסף אמצעי בינוני לנפח סופי של 50 mL. ערבב בעדינות את התוכן.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 370 x g עבור 6 דקות בטמפרטורת החדר. להיפטר supernatant, להשעות מחדש את התאים 15 מ ל של RPMI בינונית להשלים ולבצע ספירת תאים.</li>
		<li>כוונן את ריכוז התא כדי 2.0 x 107 תאים/ML עם RPMI בינוני מלא, ותאים להעביר T75 בקבוקון או גדול יותר, מודטה ב 37 ° c עבור לפחות 1 h עד 16 h כדי לאפשר זמן ההחלמה עבור תאים המופשרים.</li>
		<li>לאסוף את התאים (לצירוף במידת הצורך) ו צנטריפוגה ב 370 x g עבור 6 דקות ב 4 ° c. להיפטר supernatant ולהשעות מחדש את התאים 5 מ ל קרח קר מאגר מקינטוש (PBS, pH 7.6 המכיל 0.5% BSA ו 2 מ"מ EDTA), להביא 50 mL עם מאגר מקינטוש ולבצע ספירת תאים.</li>
		<li>צנטריפוגה את התאים ב 400 x g עבור 7 דקות ב 4 ° c.</li>
		<li>בודד את התאים CD22+ B לפי בחירה חיובית באמצעות לכידת CD22 מיקרו חרוזי. השתמש במאגר מקינטוש עבור כל השטף. הרוזן וצנטריפוגה 400 x g עבור 7 דקות ב 4 ° c. ההחלמה הצפויה היא 5-10% מאוכלוסיית ה-PBMC הכוללת.</li>
		<li>להשעות את התאים ב 40,000,000 למאגר ה-mL FACS (מאגר טריס, pH 8.0 המכיל 0.5% BSA ו 2 מ"מ EDTA) ולהמשיך עם צביעת תאים של התורמים באופן אינדיבידואלי או כבריכה.</li>
	</ol></li>
	<li>הכתם תאים עבור מיון תא B
	<ol>
<li>הסר משתמש של תאים עבור cytometer להגדיר פיצוי עבור כל התוויות fluorophores בשימוש. כלול תאים שאינם מוכתמים כפקד.</li>
		<li>חישוב נפח הצביעת הסופי עבור מספר CD22+ תאים שהתקבלו (צביעת 2,000,000 לכל 100 μl).</li>
		<li>הוסף סמנים מסחטות עבור B תאים (CD19-PerCP-Cy 5.5), IgG (IgG-FITC), ואת תא הזיכרון (CD27-PECy7) לפי המלצות של היצרנים ' דילול, ומערבבים בעדינות. Aliquot 107 תאים לתוך צינור 1.5 ml עבור שליטה שלילית להעביר את התאים הנותרים כדי שפופרת 15 ml.</li>
		<li>הוסף את הכפולים המסומנים biotin-SA הטמרס לצינור הבקרה השלילי בריכוז הסופי של 36 ננומטר כל אחד עבור PE ו APC כפול על ידי מספר פפטידים בצינור מיון ולהביא את נפח 0.5 mL הסופי עם מאגר FACS (g., 10 פפטידים x 36 nM = 360 ננומטר).</li>
		<li>הוסף את הטטרמרים פפטיד לצינור מיון ב 36 ננומטר כל אחד עבור PE ו APC ולהביא את התאים 2x106 לכל 100 μl עם מאגר TBS. דגירה ב 4 ° צ' בחושך עם סיבוב עדין עבור 30-60 דקות.</li>
		<li>שטוף 2x ב 4 ° צ', 400 x g, 7 דקות, הסרת סדרת מחלקים לספור לפני השטיפה האחרונה. מסננים תאים באמצעות מסנני כיסוי של 5 מ"ל. הוסף DAPI (4, 6-diamidino-2-פניינילידול) הכתם לריכוז הסופי 0.3 μM רק לפני מיון כסמן של שלמות קרום התא.</li>
	</ol></li>
	<li>תא בודד מיון באמצעות cy, הזורם בזרם
	<ol>
<li>הכינו 48 בארות של 96-טוב PCR צלחות למיון.<ol>
<li>להכין לערבב הורים: (2 μL של 10x RT מאגר, 0.5 μL של RNase מעכבי, 7.5 μL של מים מעוקרים-כיתה) לכל מדגם. הורדה 10 μL לכל היותר, כריכה ואחסון ב-4 ° צ' עד מוכן למיון.</li>
		</ol>
</li>
		<li>הפעל את הפקד השלילי בסדרן התאים ונתח את המדגם כולו.<ol>
<li>הגדר את השערים cy, לנסות לבודד את אוכלוסיות התאים המתאימות למיון תא בודד.<ol>
<li>מגרש FSC לעומת אזור במרכז העיר וקבע השער R1 כדי לבודד לימפוציטים.</li>
				<li>מגרש FSC לעומת רוחב FSC ולהגדיר שער R3 לא לכלול FSC doublets.</li>
				<li>התווה את גובה היחידה לעומת מהאס.</li>
				<li>התווה גובה מערכת הנתונים לעומת DAPI וקבע את שער R5 לבידוד תאים חיים (DAPI-).</li>
				<li>העלילה IgG vs CD19 ולהגדיר שער R6 לבודד IgG+ B תאים (CD19+ igg+).</li>
				<li>העלילה IgG vs CD27 ולהגדיר שער R7 כדי לבחור בתאי זיכרון B (CD27גבוהה).</li>
				<li>העלילה אנטיגן-PE (Ag-PE) vs אנטיגן-APC (Ag-APC) ולהגדיר שער R8 כמו Ag-PE+/agt-apc+ רביע עם מספר נמוך של אירועים בשער חיובי כפול.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>לאסוף מספר שווה של תאים זיכרון מדגם אנטיגן-חיובי (Ag+) לקביעת האות לרעש.</li>
		<li>מיון תאים בודדים בעל פניטיפ CD19+ CD27+ ag-PE+ Ag-APC+ (שער R8) לתוך מוכן 96-היטב PCR צלחות.</li>
		<li>לכסות את הצלחות עם רפידות נייר אלומיניום, צנטריפוגה עבור 1 דקות ב 400 x g, ולאחסן ב-80 ° צ' לשכפול עתידי.</li>
	</ol></li>
</ol>3. שכפול תא יחיד
<ol><li>
הפוך תגובות תמלול
	<ol>
<li>הסר את לוח המיון היחיד של תא B מ-80 ° c. הפשרת קרח עבור 2 דקות. ספין הצלחת עבור 2 דקות ב 3,300 x g לתוכן המאגר בתחתית הבארות לפני הפתיחה.</li>
		<li>הכנת לערבב בסיס dNTP/מאגר עם 10% שאינו יונית לניקוי ו oligo (dT) כמו הפוכה. הוסף תמהיל אנזימים לכל המכיל את התא היחיד וללא mix.</li>
		<li>דגירה 5 דקות ב 65 ° c. הוסף שילוב מאסטר האנזים המכיל 100 mM DTT, RNase מעכב, ו הפוכה האנזים ההמרה להביא נפח הכולל ל 20 μL. דגירה 10 דקות ב 50 ° c, לאחר מכן 10 דקות ב 80 ° c.</li>
		<li>העבר לקרח לפני תחילת שלבי ה-PCR</li>
	</ol>
</li>
	<li>
תגובות PCR מקוננות מרובות שלבים
	<ol>
<li>שימוש בתגובות PCR מקוננות נפרדות משמשות עבור שרשרת כבדה (HC) והגברה של שרשרת האור (LC).</li>
		<li>לסיבוב הראשון של הגברה ה-PCR (שלב I), השתמש בבריכת התחל הקדמי ובצעד הפוך אחד כדי להגביר את אזורי המשתנה HC ו-LC בתגובות PCR נפרדות (איור 2). באמצעות העיצוב, ברכת התחל הקדמי להגביר אחוז גדול של מנהיג germline (L) רצפים ואת פריימר הפוכה היא ספציפית לאזורים הקבועים במורד הזרם של כל שרשרת, כולל הקאפה (κ) ו למדא (λ) עבור רשתות אור16.<ol>
<li>השתמש 2.5 μL של מוצר cDNA כתבנית עבור כל ה-PCR (שלב I) התגובה. הוסף התחל את ריכוז התגובה הסופי של 1 μM עבור כל. כפול מאגר 10x פולימראז לריכוז 2x, להביא את אמצעי האחסון הסופי ל 25 μL לכל תגובה. הפעל את התגובות ב-HC PCR באמצעות [94 ° c/4 דקות; 94 ° צ'/15 s, 55 ° צ'/20, 68 ° צ'/60 ס מ; 68 ° c/3 דקות] עבור מחזורים של 50. הפעל תגובות LC PCR באמצעות [98 ° צ'/4 דקות; 98 ° צ'/15 s, 72 ° צ'/20 s, 72 ° צ'/60 s; 72 ° c/3 דקות] עבור מחזורים 50.</li>
		</ol>
</li>
		<li>השתמש ב-2.5 μL של המוצר שלב I כתבנית לכל תגובת ה-PCR (Step II). הוסיפו את המאגר של מסגרת התחל הראשונה הספציפית ל-HC ו-LC (κ ו-λ) במסגרת 1 באזור ובריכת התחל הפוכה הספציפית לאזור הצומת של כל שרשרת נוגדנים. כפול החוצץ 10x פולימראז כדי ריכוז 2x, ולהפעיל את התגובות PCR 50 מחזורי כל אחד באמצעות אותם פרמטרים כמו שלב I.</li>
		<li>הפעל את התגובות PCR השלימה על 1% העלה ג'ל כדי להמחיש להיטים הגברה חיובית. לשחזר הגברה לזווג (שרשרת כבד ואור מאותו תא) ולבודד דרך חילוץ ג'ל. קביעת ריכוז קטע ה-DNA באמצעות OD260 עבור חישובים מדויקים לגבי ערבוב.</li>
		<li>שילוב שברי שרשרת כבדים וקלים עם רסיס מקשר ואת שדרה וקטור הביטוי באמצעות תגובת הקשר 4 חלקים באמצעות ערכה מסחרית.</li>
		<li>הפוך תגובות החוצה לתוך חיידקים מוכשרים כימית באמצעות ערכה מסחרית. לאחר מצופה על צלחות אנטיביוטיות, להוסיף 4 מ ל של מדיית גדילה (עם אנטיביוטיקה) לתרבות שינוי שארית, ו-דגירה 37 ° c לילה ב 250 rpm. . זו תרבות המיקס</li>
		<li>הכינו את ה-DNA miniprep מתוך התרבות ערבוב לילה לערבב באמצעות ערכת מסחרית, ולקבוע את הריכוז המתקבל של DNA באמצע.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. אליסה המסך עבור אישור אנטיגן-ספציפיות
<ol><li>
Transfect 10 μg של ה-DNA miniprep עם השומנים מבוססי ליפיד מבוסס לתוך 10 מ ל של השעיה 293 תאים, ו מודטה עבור 3-4 ימים ב 37 ° צ' (8% CO2) בעת סיבוב ב-125 rpm. לקציר, תרבות צנטריפוגה 10 דקות ב 1,000 x g ולשחזר מדיה הובהר.
	<ol>
<li>למדוד את הריכוז IgG ב סופרנטנים באמצעות אהדה ל חלבון A.</li>
		<li>מבחן כל igg (ב supernatant) ב 20 μg/mL על ידי שיטת האנזים מקושרים adsorbent (אליסה) נגד פפטידים בודדים המשמשים למיון, לכוד על צלחת streptavidin או אקטין כפקד שלילי. השתמש peroxidase עז אנטי אדם נוגדן משני נגד IgG האדם Fab לזהות שיבוטים רקומביננטי. לאחר חיסור של רקע, OD > 0.5 מוגדר חיובי מסך.</li>
		<li>אישור להיטים חיוביים מסך על ידי ביצוע אליסה נוספת, באמצעות דיעות של IgG supernatant כדי ליצור עקומת ריכוז החל 20 μg לכל mL, ו התוויית נגד OD עבור כל אנטיגן המציג פעילות מחודשת במסך הראשוני אליסה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Su, K. Y., Watanabe, A., Yeh, C. H., Kelsoe, G., Kuraoka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Culture+of+Human+Naive+and+Memory+B+Cells+for+Use+as+APCs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Efficient Culture of Human Naive and Memory B Cells for Use as APCs.</a> Journal of Immunology. 197 (10), 4163-4176 (2016).</li>
<li>Corti, D., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly+neutralizing+antiviral+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Broadly neutralizing antiviral antibodies.</a> Annual Review of Immunology. 31, 705-742 (2013).</li>
<li>Steinitz, M., Klein, G., Koskimies, S., Makel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EB+virus-induced+B+lymphocyte+cell+lines+producing+specific+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">EB virus-induced B lymphocyte cell lines producing specific antibody.</a> Nature. 269 (5627), 420-422 (1977).</li>
<li>Bloom, A. D., Nakamura, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+tetraploid%2C+immunoglobulin-producing+cell+line+from+the+hybridization+of+two+human+lymphocyte+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Establishment of a tetraploid, immunoglobulin-producing cell line from the hybridization of two human lymphocyte lines.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (7), 2689-2692 (1974).</li>
<li>Olsson, L., Kaplan, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-human+hybridomas+producing+monoclonal+antibodies+of+predefined+antigenic+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Human-human hybridomas producing monoclonal antibodies of predefined antigenic specificity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (9), 5429-5431 (1980).</li>
<li>Lechner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+Circulating+Immune+Cells+in+Neovascular+Age-Related+Macular+Degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Alterations in Circulating Immune Cells in Neovascular Age-Related Macular Degeneration.</a> Scientific Reports. 5, 16754(2015).</li>
<li>Loken, M. R., Brosnan, J. M., Bach, B. A., Ault, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+optimal+lymphocyte+gates+for+immunophenotyping+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Establishing optimal lymphocyte gates for immunophenotyping by flow cytometry.</a> Cytometry. 11 (4), 453-459 (1990).</li>
<li>Pascual, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+memory+to+hyperphosphorylated+tau+in+asymptomatic+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Immunological memory to hyperphosphorylated tau in asymptomatic individuals.</a> Acta Neuropathologica. 133 (5), 767-783 (2017).</li>
<li>van Ameijde, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+therapeutic+potential+of+a+naturally+occurring+human+antibody+targeting+a+phosphorylated+Ser%28422%29+containing+epitope+on+pathological+tau%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Enhancement of therapeutic potential of a naturally occurring human antibody targeting a phosphorylated Ser(422) containing epitope on pathological tau.</a> Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 59(2018).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Tiller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+monoclonal+antibodies+from+single+human+B+cells+by+single+cell+RT-PCR+and+expression+vector+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning.</a> Journal of Immunological Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).</li>
<li>Wrammert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+cloning+of+high-affinity+human+monoclonal+antibodies+against+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid cloning of high-affinity human monoclonal antibodies against influenza virus.</a> Nature. 453 (7195), 667-671 (2008).</li>
<li>Han, A., Glanville, J., Hansmann, L., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+T-cell+receptor+sequence+to+functional+phenotype+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Linking T-cell receptor sequence to functional phenotype at the single-cell level.</a> Nature Biotechnology. 32 (7), 684-692 (2014).</li>
<li>Apetri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+antigenic+motif+recognized+by+naturally+occurring+human+VH5-51%2FVL4-1+anti-tau+antibodies+with+distinct+functionalities%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">A common antigenic motif recognized by naturally occurring human VH5-51/VL4-1 anti-tau antibodies with distinct functionalities.</a> Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 43(2018).</li>
<li>Jones, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+recognition+of+the+central+conserved+region+of+RSV+G+by+neutralizing+human+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Structural basis for recognition of the central conserved region of RSV G by neutralizing human antibodies.</a> PLoS Pathogens. 14 (3), 1006935(2018).</li>
<li>Janssen Vaccines & Prevention B.B. US patent. , U.S. Patent Application No. 20170210787, Published July 27, 2017 (2017).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף

השיטה המוצגת כאן משלבת cy, הזרמת הזרימה ושיבוט תא בודד, ואת השיטות שאנו מתארים כאן אנו מבוססים על שיטות שפותחו בעבר על ידי ההגה ועמיתים11. עבודתם מתארת את ההחלמה והשכפול של נוגדנים חד-שבטיים כדי ללמוד את רפרטואר התא B אצל בני אדם ברמה של תאים בודדים. התאמתי את הרכיבים העיקריים של התהליך שלהם כדי לאפשר שחזור של נוגדנים חד שבטיים ספציפי אנטיגן מאוכלוסיה של תאי זיכרון B, כולל את האסטרטגיה מרובת שלב הגברה. השינוי העיקרי הוא התוספת של "פיתיון" אנטיגן מתויג. עיבודים נוספים נעשו בפרוטוקול שפורסם, כולל (אבל לא מוגבל) שינוי שידרה וקטור שיבוט לתוך ביטוי אחד פלמיד, כיסוי נוסף של הרפרטואר germline (הן רצף מנהיג מסגרת 1), הHEK293 של תאים ההשעיה עבור ביטוי גבוה יותר, ואת השימוש באיכות גבוהה פולימות במהלך הגברה PCR.
עבור השיטות המתוארות כאן, השלבים הקריטיים ביותר הם בקרבת המעבר בין cy, הזרמת הזרימה ושיבוט תא בודד. ראשית, המיקום הנכון של תאים בודדים ממוינים לתוך הלוח הוא חיוני. הגדרת ההשהיה הנפתחת כהלכה בסדרן היא שלב מפתח. גורמים סביבתיים, כגון לחות נמוכה, חייב גם להילקח בחשבון, כפי שגילינו יעילות ההחלמה שלנו ירידה באופן משמעותי, אלא אם כן אקדח סטטי משמש על צלחות מיון היעד. לאחר מיקום התא, צלחות מcentrifuged כדי להבטיח תאים יצרו קשר עם 10 μL של מאגר בחלק התחתון של הבארות. כל האמצעים הללו הם קריטיים להצלחת החלק המולקולרי של הביולוגיה המולקולרית. אם התנאים הם תת אופטימלית עבור התגובה הפוכה התעתיק של תא בודד, הגברה PCR של β-actin יכול להיות קשה. כוחה של השיטה המוצגת היא היכולת לחקור מיליוני תאים ולמיין רק את אלה התואמים את הקריטריונים לפעילות האנטיגן נגד אנטיגן הבחירה. זה דורש את האות ליחס רעש גבוה ככל האפשר, אשר נעשה על ידי אופטימיזציה ריכוזי פיתיון לפני מיון. פיתיון בעל תווית כפולה משמש כדי להפחית את ההתאוששות של תאים שווא-חיוביים, אשר יכול להתרחש אם אחד fluorophores יש רקע גבוה. באמצעות יותר מפיתיון אנטיגן אחד יכול להפוך את האות: מיטוב רעש קשה יותר, אבל היכולת לחקור פפטידים מרובים בו זמנית הוא יתרון נוסף של שיטה זו.
כאשר יעילות השחזור נמוכה, סט של מβ-actin מקונן התחל משמש כדי לאשר את התבנית cDNA קיים. החיסרון בגישה זו הוא כי קשה לקבוע אם לא היה תא מתנה בבאר או תגובת התעתיק הפוכה נכשלה, מה שהופך את פתרון התקלות לקשה. לעיתים, ההיפך יתרחש והיעילות גבוהה מהצפוי. ההתאוששות אופייני עבור שרשרת כבדה היא בין 30-45% ושרשראות אור גבוה יותר, בין 40-60%. כל תגובה PCR (שלב I & II) משתמשת 50 מחזורים כדי להגביר מתא אחד. המספר הגבוה של מחזורים כולל גם הופך שיטה זו חשופה לזיהום. ניתן להשתמש בניתוח רצף של הגברה כדי לקבוע אם הוכנסו מזהם, או ששיעור החלמה גבוה באופן חריג הושג באופן חוקי.
השירות של שיטה זו כדי לשחזר נוגדנים אנושיים מקומיים נגד אנטיגן של בחירה יש כמה מגבלות משמעותיות. ראשית, רק חלבונים מסיסים יכול להיות מתויג יכול לשמש "פיתיון" עבור cy, הזרמת הזרימה. עבור מינים שהוצגו בתוצאות הנציג, השתמשנו סדרה של פפטידים חופפים מסונתז מתוך החלבון של טאו, מאז השימוש בחלבון כולו הוכיחה קשה. השימוש בפפטידים ליניאריים הוא כנראה לא אופטימלי, שכן הוא עשוי להגביל את הזיהוי של נוגדנים נגד אפיסקופים לא ליניאריים או מבניים. עם זאת, הצלחנו לזהות מספר נוגדנים ייחודיים נגד הטאו ואלה עוברים כעת הערכה נוספת8,9. מגבלה נוספת היא תפוקה נמוכה של שחזור ביולוגיה מולקולרית ושיבוט של IgGs. אסטרטגיית המיון הראשונית מאפשרת הקרנת מיליוני תאים, אך העיבוד המולקולרי העוקב מורכב ממספר שלבים. מאמצי אופטימיזציה שוטפת לשלב טכנולוגיות חדשות יותר, כגון האסיפה גיבסון10 יש מספר שלבים מסוימים, אבל צוואר הבקבוק נשאר שיבוט בודדים כבדים שרשרת בהיר זוגות.
השיטה "bselex" מנצל את bcr המבוטא על פני השטח של תאים B זיכרון כדי לזהות תאים המציגים תגובתיות אנטיגן, ולאחר מכן לשחזר את התאים הבודדים באמצעות זרימה cy, מנסה11,12. בשל הסתמכות זו על BCR, השיטה מוגבלת לזיכרון B תא התא, ולא ללכוד הפרשה נוגדנים תאים (ASCs) כגון מחזיק הפלסטיק. עם זאת, גישה זו עשויה להיות יתרון כדי לשחזר רפרטואר רחב יותר של אימונוגלויוגלויויויולים ספציפיים אנטיגן בהשוואה ל-ASCs. מחקרים חיסונים שפעת להפגין כי בעוד ASCs תגובתי יכול להיות נשלט על ידי מספר קטן של שיבוטים המורחבת תא B, הזיכרון הספציפי אנטיגן B האוכלוסייה הנמוכה לעתים נדירות שבטיים12. קולטן תא T (TCR) על פני השטח של תאי T בעל דמיון לקולטן התא B בסידור גנים ושילוב מחדש כדי למקסם את הגיוון. מגישות תאים בודדות בדומה למה שמתואר בשיטה שהוצגה כאן פותחו להערכת רפרטואר התא T, כולל התאוששות ושכפול תא בודד של רשתות אלפא וביתא13. עם זאת, זיהוי TCR דורש פפטידים להיות מוצגים על ידי מולקולות MHC, הוספת מורכבות משמעותית לגישת פיתיון בתווית כדי לזהות תאי T ספציפיים פפטיד. בשונה מתאים B, תאי T אינם עוברים בגרות אהדה של אזור המשתנה כולו, כך שזיהוי האזור הקצר CDR3 וחלק מהרצף הוא כל מה שנדרש לזיהוי ולחוקה מחדש. לבסוף, שיטה זו מתארת את הזיהוי של מולקולות IgG באמצעות הזרימה cy, אבל זה אפשרי גם להשתמש סמנים פנוטיפים חלופיים כדי לזהות תאים B של איזוסוגים שונים.
כיום, ישנן שיטות שפותחו כדי לחבר את הכמות העצומה של הנתונים שנאספו מרצף הדור הבא עם ניתוח פונקציונלי של ספציפיות אנטיגן, אבל שיטות אלה עדיין להיות מעודן. למרות מגבלותיו, השיטה המתוארת כאן שימש לזיהוי נוגדנים עם ערך תרפויטי פוטנציאלי למחלות זיהומיות ומחלות שאינן זיהומיות8,14,15, ומייצגת מהימנות גישה לשחזר את האיגים הרלוונטיים אנטיגן ספציפיים מבני אדם, ללא מניפולציה נרחבת של תאים B או תרבות תא נרחבת.

נוגדנים הם מעמד הולך וגדל של מולקולות טיפוליות, ואת הרפרטואר הקיים של התא B בכל אדם הוא מקור פוטנציאלי של נוגדנים כאלה. כאשר התאושש מתורם אנושי, הם אינם דורשים הסתגלות או "הומניזציה", צעדים הנדרשים עבור נוגדנים שנוצרו במערכות בעלי חיים אחרים. קיימות מספר שיטות לזיהוי ובידוד של נוגדנים אנושיים, כולל B הפעלת תא והפצת1, הפצה דרך המרת ebv2,3, והדור של קווי יפידים cell4 ,5. עם זאת, כל השיטות הללו דורשות תרבות תא נרחבת למסך ולשחזר נוגדנים ספציפיים אנטיגן. מידע על הרפרטואר לנוגדן האנושי הורחב מאוד עם התפתחות של רצף הדור הבא (NGS) טכנולוגיה, המאפשר זיהוי של כמויות עצומות של רצפים בודדים נוכח דגימות התורם. עם זאת, מכיוון NGS מניב תצוגה אגנוסטי של כל הרצפים נוכח, זה לא מאפשר זיהוי ובידוד של נוגדנים ספציפיים אנטיגן, במיוחד במקרה של נוגדנים בתדר נדיר או נמוך.
מטרתו של "BSelex" השיטה היא לזהות נוגדנים ספציפיים אנטיגן מתוך במחזור דם היקפי תאים מונמונומנט בתורמים אנושיים, ולבודד ולשחזר את רצפי נוגדנים אלה לניתוח נוסף. שיטה זו מנצלת את הזרימה cy, מיון התא כדי לנצל את קולטן התא B (BCR) ביטא על פני השטח של תאי זיכרון B. מיליוני תאים B יכול להיות מוקרן עבור אנטיגן-ספציפיות דרך הזרימה cy, try לפני התפוקה נמוכה יותר ביולוגיה מולקולרית שיטות הם יזמו. לזווג זיהוי שרשרת כבדה ואור אינו אפשרי ברוב שיטות NGS, אשר לנתח רצפי תאים בכמויות גדולות. בשיטה שאנו מתארים כאן, התאים מבודדים בנפרד, ולזווג שחזור הן כבדות ושרשרת האור אפשרי, אשר מאפשר שיבוט ישירה וביטוי של IgG המלא.

<table><tbody><tr><td>MoFlo Astrio EQ, סדרן תאים</td><td>מיון תאים</td><td>MoFlo</td><td></td></tr><tr><td>פפטידים ביוטיניליים</td> ניו <td>אינגלנד פפטיד</td><td></td><td>מיון תאים "פיתיון"</td></tr><tr><td>Micro Bio-spin P30 עמודת ג'ל</td><td>BioRad</td><td>#7326223</td><td></td></tr><tr><td>סטרפטווידין (R-PE)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>SA10041</td><td></td></tr><tr><td>סטרפטווידין (APC)</td><td>Thermo Scientific</td><td>S32362</td><td></td></tr><tr><td>CD22 מיקרו-חרוזים, אנושי&nbsp;</td><td>Miltenyi</td><td>#130-046-401</td><td></td></tr><tr><td>עמודות LS</td><td>Miltenyi</td><td>#130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>מסנני טרום הפרדה&nbsp;</td><td>Miltenyi</td><td>#130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>PerCp-Cy5.5 עכבר אנטי אנושי CD19</td><td>BD Biosciences</td><td>BD#340951</td><td></td></tr><tr><td>PE-Cy7 עכבר אנטי אנושי CD27&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>#560609</td><td></td></tr><tr><td>עכבר FITC אנטי אנושי IgG</td><td>BD Biosciences</td><td>#560952</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>#D21490</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Life Technologies</td><td>#10777-019</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין בסרום בקר, Fraction V</td><td>Sigma</td><td>#A4503</td><td></td></tr><tr><td>RPMI media</td><td>Hyclone</td><td>#SH30096.01</td><td></td></tr><tr><td>HI FBS (סרום בקר עוברי)</td><td>Invitrogen</td><td>#10082147</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler שיפוע</td><td>אפנדורף</td><td>דגם #6325</td><td>PCR מכונת PCR</td></tr><tr><td>96 בארות צלחות</td><td>פניקס</td><td>MPS-500</td><td></td></tr><tr><td>PCR מחצלות צלחת</td><td>פניקס</td><td>SMX-PCR96</td><td></td></tr><tr><td>יתרון UltraPure PCR Deoxynucleotide Mix</td><td>Clontech</td> <td>#639125</td><td></td></tr><tr><td>כתב עילי IV מערכת סינתזה של גדיל ראשון</td><td>Invitrogen</td><td>#18091050</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High Fidelity Polymerase</td><td>Thermo Scientific</td><td>F-531-L</td><td></td></tr><tr><td>פלטינה פולימראז</td><td>Invitrogen</td><td>#10966108</td><td></td></tr><tr><td>מים ללא נוקלאז</td><td>QIAGEN</td><td>#129114</td><td></td></tr><tr><td>פריימרים אוליגונוקלאוטידים</td><td>IDT</td><td>פריימרים שונים</td><td>לכל שלבי PCR</td></tr><tr><td>ג'ל ערכת מיצוי</td><td>QIAGEN</td> <td># 28706</td><td></td></tr><tr><td>ערכת טיהור PCR</td><td>QIAGEN</td> <td># 28106</td><td></td></tr><tr><td>ערכת Miniprep</td><td>QIAGEN</td> <td># 27106</td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA הרכבה ערכת שיבוט</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>E5520S</td><td>גיבסון מכלול</td></tr><tr><td>Expi293 Expression Media</td><td>Invitrogen</td><td>#A14351-01</td><td></td></tr><tr><td>ExpiFectamine 293 Transfection Kit</td><td>Invitrogen</td><td>#A14525</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Media</td><td>Invitrogen</td><td>#31985070</td><td></td></tr><tr><td>חממת CO2 (Multitron)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Octet&nbsp; מערכת RED384</td><td>Pall/Forte Bio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce Streptavidin מצופה יכולת כריכה גבוהה צלחות ברורות 96 בארות</td><td>תרמו מדעי</td> <td>#15500</td><td></td></tr><tr><td>קורנינג קוסטאר 96 בארות צלחת פוליסטירן מחייבת גבוהה חצי שטח</td><td>קורנינג</td><td>#3690</td><td></td></tr><tr><td>עז אנטי אנושי IgG Fab נוגדן משני</td><td>מעבדות ג'קסון</td><td>#109-036-097</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן משני HRP עיזים נגד עכבר</td><td>מעבדות ג'קסון</td> <td>#115-035-072</td><td></td></tr><tr><td>SureBlueTM TMB Microwell מצע פרוקסידאז (1 רכיב)&nbsp;</td><td>KPL</td> <td># 52-00-03</td><td></td></tr><tr><td>פתרון עצירת TMB</td><td>KPL</td> <td># 50-85-06</td><td></td></tr></tbody></table>

שיטת הקרנה של תא בודד לבחירת ושחזור של נוגדנים עם הצורך הרצוי מתוך זיכרון אנושי מועשר b אוכלוסיות תאים

Single-cell Screening Method for the Selection and Recovery of Antibodies with Desired Specificities from Enriched Human Memory B Cell Populations

הרפרטואר האנושי של הנוגדן מייצג מקור מנוצל ברובו של נוגדנים טיפוליים פוטנציאליים וסמנים שימושיים. בעוד שיטות חישוביות נוכחיות, כגון רצף הדור הבא (NGS), להניב קבוצות עצומות של נתונים על רפרטואר נוגדנים ברמת הרצף, נתונים פונקציונליים נדרש כדי לזהות אילו רצפים רלוונטיים אנטיגן מסוים או קבוצה של אנטיגנים. כאן, אנו מתארים שיטה כדי לזהות ולשחזר נוגדנים ספציפיים אנטיגן ספציפי של דם היקפי תאי מונמונומנט (PBMCs) מתורם דם אנושי. שיטה זו מנצלת העשרה הראשונית של תאים B בוגרת ומחייב שילוב של סמנים תא פנותוניים ו חלבון מתויג בצורה פלואורוסקופים כדי לבודד את זיכרון IgG B תאים באמצעות הזרמת cy, לנסות. אזורי המשתנה הכבד והקל משוכפל ומוקרן מחדש. למרות שהוא מוגבל לזיכרון B תא התא, שיטה זו מנצל את היתרון של cy, מנסה לחקור מיליוני תאים B ומחזיר רצפי שרשרת כבדה וקלה מתא אחד בפורמט מוכן לביטוי ואישור של ספציפיות. נוגדנים ששוחזרו עם שיטה זו יכול להיחשב לפוטנציאל טיפולי, אבל יכול גם לקשר ספציפיות ופונקציה עם גישות ביוטיות כדי להעריך את רפרטואר התא B בתוך יחידים.

שיטה זו מכסה תהליך רב שלבים כדי לבודד נוגדנים ספציפיים אנטיגן מתורמים אנושיים. בנתוני הנציג המוצג כאן, התאים היו מודרתים עם בריכה של פפטידים המסומנים באמצעות פלואורוסקופים המייצגים מספר תחומים שונים של חלבון הטאו, כולל פפטידים זרחוניים כדי לחקות את האתרים זירחון. פפטידים אלה שימשו "פיתיון" כדי לזהות תאים התגובתית עם האפיסקופים של הטאו (ים) של עניין. לקראת מיון, פאנל של סמנים בעלי תוויות מסומנות בצורה פלואורוסקופים שימשו כדי לזהות אוכלוסיות תאים שונות בתוך אוכלוסיית התא B מועשר. סדרה של שערים של הסיילנסה המציאו כדי לבודד את זיכרון היעד B תאים (איור 1). לימפוציטים היו מבודדים בהתבסס על גודל התאים שלהם ואת צפיפות הרשת באמצעות פיזור הקדמי (fsc) ומגרשים בצד (הסוכנות למען המשתמש) בזרימה cy, try6,7. בעקבות החרגה של תאים מרובים ("doublets") ותאים מתים, סמנים פנומטורי אפשרו את ההפרדה של IgG+ זיכרון B תאים דרך igg, CD19 (תא b) ו CD27 (זיכרון). בגישה זו, CD27 marker אינו מפיץ לשתי אוכלוסיות נפרדות, כך 45% העליון של CD27+ ביטוי תאים נכללים עבור השער הסופי. בסופו של דבר, תאים כפול חיובי עבור APC ו-PE fluorophores להפיץ לתוך הרביע הימני העליון של הגרף, המציין את הפעילות מחדש הן הגרסאות המסומנות של פפטידים. התאים שנפלו בתוך השער המצויר היו מבודדים וממוינים לבארות בודדות של צלחת 96-באר. השימוש אנטיגן עם שתי תוויות שונות מגביר את היחס אות לרעש ומפחית את מספר התוצאות החיוביות שווא בתהליך הביולוגיה המולקולרית העוקבת. התאים הממוינים מיוצגים כ-0.1% מתאי הזיכרון B בשער הסופי, ו-0.001% מדגימת התא ההתחלתי.
הבדיקה הראשונה של שיבוט תא יחיד היא אישור של הגברה של שרשראות כבד ומשתנה האור המתאים (איור 2). מאז לזווג שחזור של שני הגברה היא הרצויה, תגובות ה-PCR מוערכים זה לצד זה על ג'ל agarose, וזוגות תואמים הם המגורש ג'ל וקטעי DNA שחולצו. יעילות אופיינית של הגברה היא 30-50% שרשרת כבדה 50-70% אור (קפא) שרשרת. שחזור של הגברה לזווג הוא בדרך כלל בין 25-40% יעילות. יעילות זו משתנה בין בריכות התורמים והנתונים הנציגים (איור 3) היא דוגמה להגברה יעילה מאוד מ -24 תאים בודדים (42% שחזור מזווג). בעקבות שיבוט IgG, וקטור ביטוי IgG הוא הופך לתוך כליה עובריים האדם (HEK-293) תאים ההשעיה, אשר משמשים כדי למקסם את הביטוי. השימוש במדיום ללא סרום מפחית חלבונים מזיהום מהכנות רקומביננטי נוגדן, ומסייע למזער את הרעש של הכריכה העוקבת. הנוגדנים התאושש מוקרן על הפאנל המקורי של הפפטידים טאו הבקיע לפעילות מחודשת על ידי אליסה (איור 4). סף התחלתי של OD = 0.5 מעל הרקע משמש לציון פעילות מחודשת של אנטיגן חיובי, וחלבון β-actin משמש כפקד עבור איגוד לא ספציפי. אם הזרימה cy, try ומיון הצעדים להשתמש בבריכה מעורבת של פפטידים, ההקרנה אליסה היא הצעד הראשון של פירוק פעילויות מסוימות מסוימות של IgGs התאושש. שלושה מתוך 10 הiggs הדגימו הפגינו מחדש נגד הפחת של CBTAU טאו, ואחד היה מגיב ל27.1 בלתי זרחתי של CBTAU (איור 4א). אישור נוסף הושלם באמצעות עקומת ריכוז של אותו דגימות נוגדן רקומביננטי נגד פפטידים המזוהים במסך הראשוני, פפטיד נוסף כמו שליטה שלילית (איור 4ב). עבור כל פגיעה חיובית, שיבוט בודד פלמיד היה מבודד מן הבריכה השתנה ואישר מחדש על ידי אותה שיטה אליסה. רק שיבוט 34 מוצג את הנתונים המוצגים, ובעוד פעילות מחודשת ל CBTAU שאינו זרחנות שאושרה, איגוד הזיקה התחתון נצפתה גם עם הזליס 27.1 פפטיד (איור 4ג).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59809/59809fig1.jpg"> איור 1 : בידוד של תאי אנטיגן-תגובתי בודדת דרך הזרימה cy, לנסות. (א) המוצג הוא מזימה ייצוגית שבה אוכלוסיית הימפוציטים היתה כלולה בתוך השער המצויר. (ב) שערים מבוסס על פיזור בצד הקדמי (fsc-גובה v fsc-רוחב (R3); בגובה מתחת לפני המבקרים-רוחב (אר אר)) שימשו להוצאת doublets. רק תאים בתוך שערים נמשכים הוערכו במגרשים הבאים. DAPI+ תאים נחשבו מתים ולא נכללו (R5). בניסוי זה, 3.7 x 107 "חיים" תאים נחקרו. רוב התאים החיים היו B תאים (CD19+), ו igg+ תאים (4.66%) היו מבודדים מאוכלוסיה זו (R6). החלק העליון 43.2% של תאי הזיכרון CD27+-המבטא נכללו בשער הבחירה (R7). (ג) רביע 2 (Q2) הכיל תאים מגיבים הן אנטיגנים שכותרתו (פפטיד-APC v פפטיד-PE), תאים אלה היו ממוינים והתאושש בנפרד לצלחת 96-באר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59809/59809fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59809/59809fig2.jpg"> איור 2 : ה-PCR הגברה משחזרת IgG רצף משתנה כבד ואור עבור שיבוט. (A) אזורי משתנה של שרשרת כבדים (vh) ואור (vh או Vl) משוחזרים באמצעות תגובות PCR מקוננות. צעד אני מגבירים את הרצף של המנהיג המקורי ומאחור מתוך האזור הקבוע. חצים מרובים מייצגים בריכה של בין 7-12 התחל, אשר משמשות כדי להבטיח כיסוי רחב של מסילות אפשרי. התחל שלב II הם מקוננים, ספציפיים לקצוות הקיצוניים של מסגרת הקריאה הפתוחה, והוסף רצף לקצות ההגברה ההומוולוגי לרצף הסמוך בוקטור הביטוי. (ב) המקשר מורכב משרשרת האור הקבועה (Ck או קלרנית), ולאחריה מקדם השרשרת הכבדה ורצף פפטיד שאינו יליד האות. ההגברה, המקשר ועמוד השדרה מחוללים בו באמצעות רצף הומוולוגי המופק במהלך הגברה שלב ב', והיא מבודדת כפלסמיד. הרשתות הכבדות והרקומביננטי בווקטור הביטוי הסופי מונעים על ידי היזמים של CMV עצמאיים (וזהים), ומתורגמים כחלבונים נפרדים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59809/59809fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59809/59809fig3.jpg"> איור 3 : Igg כבד ומשתנה אור הגברה שרשרת משוחזרים מתאים בודדים. תגובות ה-PCR המקונן (Step II) נטענו במישרין אל 1% מעלה ג'ל ודמיינו. שרשרת כבדה (H) ו קאפה האור תגובות שרשרת (L) PCR מאותו תא נטענו בבארות סמוכות כך הגברה מזווג היו בקלות נצפתה. שרשרת מוצלחת ומוצרי רשת אור הם בערך 400 bp ו 350 bp בהתאמה. התאוששות מוצלחת של הגברה לזווג מסומנים על ידי (*). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59809/59809fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59809/59809fig4.jpg"> איור 4 : הספציפיות אנטיגן אושרה מ רקומביננטי IgGs. פלמידים המכילים את רצפי השרשרת הכבדה והקלים ששוחזרו מתגברים בתאי HEK לביטוי. לאחר ארבעה ימים, רקומביננטי נוגדנים מוערך עבור פעילות מחודשת על ידי אליסה. (א) ריכוז igg בתקשורת הבהירה נמדד מדולל עד 20 μg/mL. הבריכה של פפטידים המשמשים למיון העריכו בנפרד באמצעות 40 pmol לכל טוב streptavidin צלחות. כל האיגים נבדקו. בבארות כפולות (ב) שיבוטים המוצגים OD450 מדידה &gt; 0.5 העריכו מחדש (שיבוטים #32, #34, #35) באמצעות 1:5 שלבי דילול נגד פפטידים המזוהים במסך. (ג) אישר לאחר להיט, שיבוט בודד פלסמיד היה מבודד שיבוט #34 שהפכו לליטים, מזוהמים, ואישר מחדש על ידי אליסה. אותו הדבר נעשה עבור שיבוטים #32 ו#35 (נתונים לא מוצגים). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59809/59809fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

שיטת BSelex כדי לזהות ולשחזר נוגדנים ספציפיים אנטיגן ספציפי של הדם היקפיים היקפי תאים מונמונומנט משלבת הזרימה cy, לנסות עם תא בודד PCR ו שיבוט.

שיטת הקרנה של תא בודד לבחירת ושחזור של נוגדנים עם הצורך הרצוי מתוך זיכרון אנושי מועשר B אוכלוסיות תאים

The human antibody repertoire represents a largely untapped source of potential therapeutic antibodies and useful biomarkers. While current computational ...

פרוטוקול זה הוא משמעותי כי זה יכול לשמש כדי לחקור את הרפרטואר החיסוני של תורמים אנושיים כדי לזהות נדיר, אנטיגן ספציפי B-תאים. טכניקה זו מאפשרת לנו להשיג שרשראות כבדות וקלות בזוגות מקומיים, אשר ניתן לשכפל במהירות, ולאחר מכן נבדק ישירות נגד אנטיגן או אנטיגנים של עניין. מדגים את ההליך יהיה מייק מורטון, טכנאי מהמעבדה שלנו.לפחות שעה לאחר הפשרה והתאוששות, לאסוף את התורם PBMC על ידי צנטריפוגה. ולהשעות מחדש את התאים ב50 מיליליטר של קרח קר MES Buffer לספירה. גלול את התאים על ידי צנטריפוגה אחרת, ולבודד את CD22 חיובי B-תאים על ידי בחירה חיובית עם MICROBEADs CD22 על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.לאסוף את התאים מבודדים CD22-חיובי חרוזים על ידי צנטריפוגה ו resuspend התאים בארבע פעמים 10 לתאים השביעי למיליליטר של ריכוז מאגר Vax. הוסף קוקטייל נוגדנים IgG CD19 CD27 לתאים בהתאם להמלצות הדילול של היצרן עם ערבוב עדין, ו aliquot 10 לתאים השביעיים לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר לשליטה שלילית. הוסף tetramers biotin steptavidin בעל תווית כפולה לצינור הבקרה השלילי בריכוז סופי של 36 ננומולרים כל אחד עם PE ו- APC, כפול מספר הפפטידים בצינור המיון.להביא את הנפח הסופי בכל צינור 2.5 מיליליטר עם חיץ Vax טרי ולהוסיף את tetramers פפטיד למיון הצינור ב 36 nanomolar כל PE ו- APC. לאחר צנטריפוגה, להביא את התאים פעמיים 10 כדי 6 לכל 100 microliters של ריכוז TBS עבור דגירה 30 עד 60 דקות, בחושך, בארבע מעלות צלזיוס, עם סיבוב. בסוף הדגירה, לשטוף את התאים פעמיים במאגר TBS טרי לכל לשטוף לפני מאמץ את הדגימות לתוך צינורות בודדים חמישה מיליליטר מסנן כובע.להכתים את הדגימות עם ריכוז סופי micromolar 0.3 של DAPI כסמן של שלמות קרום התא. ולהפעיל את כל השליטה השלילית על סדרן התאים כדי להגדיר את שערי ציטומטריית הזרימה לבודד את אוכלוסיות התאים המתאימות למיון תאים בודדים. התווה את האנטיגן PE לעומת אנטיגן APC והגדר את שער R8 כאנטיגן PE חיובי, ואת הרבע חיובי APC עם מספר נמוך של אירועים בשער חיובי כפול.לאחר מכן, מיין את CD19 חיובי יחיד CD27 חיובי אנטיגן PE חיובי, אנטיגן APC חיובי תאים לתוך בארות בודדות של מיקס מאסטר מוכן 96 צלחת היטב. בסוף הסוג, לכסות את הצלחת עם רפידות סרט אלומיניום, צנטריפוגה התאים במשך דקה אחת ב 400 פעמים g לפני מינוס 80 מעלות אחסון. כדי לבצע תגובת תעתיק הפוכה, להפשיר את תאי B ממוינים על קרח במשך שתי דקות לפני סיבוב הצלחת במשך שתי דקות ב 3300 פעמים g כדי למשוך את תוכן הבאר לתחתית הצלחת לפני הפתיחה.לאחר טיפול בתאים עם אנזים מתאים מאסטר מיקס, להוסיף 2.5 microliters של DNA חינם כתבנית עבור כל תגובת PCR, ולהוסיף פריימרים לריכוז הסופי של 1 micromolar לכל תגובה. לאחר מכן, להוסיף ריכוז 2X של מאגר פולימראז 10X לכל באר כדי להביא את הנפח הסופי ל 25 microliters לכל תגובה. ולהפעיל את התגובות PCR שרשרת כבדה וקלה כל אחד במשך 50 מחזורים.בסוף התגובות, להפעיל את הדגימות על 1% agarose ג'ל כדי לדמיין את להיטי הגברה חיובית. בודדו הן את התגובות הכבדות והן את תגובות שרשרת האור מאותו תא באמצעות מיצוי ג'ל. לקבוע את ריכוז שבר ה-DNA על ידי צפיפות אופטית ל 60 לחישובים תערובת קשירה מדויקת.שלבו את שברי השרשרת הכבדים והאור המשוחזרים עם שבר מקשר ואת עמוד השדרה הווקטורי של הביטוי באמצעות תגובת רצועות של ארבעה קטעים בהתאם להוראות היצרן. ולהפוך את תגובות הקשירה לחיידקים מוכשרים מבחינה כימית על פי הוראות היצרן. לאחר מצופה על צלחות אנטיביוטיות, להוסיף ארבעה מיליליטר של מדיום צמיחה עם אנטיביוטיקה לתרבות השינוי הנותרת עבור דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס ב 250 סיבובים לדקה.למחרת בבוקר, להכין DNA miniprep מתרבויות תערובת קשירה לילה על פי הוראות היצרן ולקבוע את ריכוז DNA פלסמיד וכתוצאה מכך. כדי לאשר את הספציפיות אנטיגן של הנוגדנים המבודדים, לשנות 10 מיקרוגרם של ה-DNA miniprep עם בסיס השומנים cationic reagent בהשעיה 10 מיליליטר של 293 תאים. הדגירה את תרבות התאים שלושה עד ארבעה ימים ב 37 מעלות צלזיוס ו 8% פחמן דו חמצני ו 125 סיבובים לדקה.בסוף הדגירה, צנטריפוגה התרבות במשך 10 דקות ב 1000 פעמים g, לשחזר את המדיום המובהר. למדוד את ריכוז IgG ב supernatant באמצעות זיקה חלבון A ולבדוק כל נוגדן על טבעי בריכוז 25 מיקרוגרם למיליליטר על ידי ELISA נגד פפטידים בודדים המשמשים למיון על פי פרוטוקולים ELISA סטנדרטיים. לאחר מכן, לאשר את המסך להיטים חיוביים עם ELISA נוסף באמצעות דילול של IgG על טבעי כדי ליצור עקומת ריכוז החל מ 20 microliters למיליליטר התוויית נגד הצפיפות האופטית עבור כל אנטיגן מראה תגובתיות למסך הראשוני ELISA.כדי לבודד נוגדנים ספציפיים לאנטיגן מתורמים אנושיים, ניתן להמציא סדרה של שערי ציטומטריה כדי לבודד את תאי B של זיכרון היעד. הלימפוציטים מבודדים בהתבסס על גודל התא שלהם וצפיפות, באמצעות פיזור קדימה וצד. בעקבות הדרה של כפילויות ותאים מתים, סמנים פנוטיפיים מאפשרים הפרדה של תאי B חיוביים ל- IgG ו- CD27 חיוביים לזיכרון B- תאים.הקריאה הראשונה של שיבוט תא יחיד היא אישור של הגברה של שרשראות משתנה כבד וקל בהתאמה. כאן, דוגמה של הגברה יעילה מאוד מ 24 תאים בודדים עם שחזור 42% מזווג לאחר PCR מוצג. בעקבות שיבוט IgG, וקטור ביטוי IgG הוא transpected לתוך כליה עוברית אנושית 293 תאים.נוגדנים משוחזרים מוקרנים נגד הפאנל המקורי של פפטידים טאו הבקיע עבור תגובתיות על ידי ELISA. אישור נוסף הושלם לאחר מכן באמצעות עקומת ריכוז של אותן דגימות נוגדנים רקומביננטיות נגד הפפטידים שזוהו במסך הראשוני. עבור כל להיט חיובי, שיבוט פלסמיד בודד יכול להיות מבודד מהבריכה שהשתנתה ולאמת מחדש על ידי אותה שיטת ELISA.המטרה היא להגביר רצפים מתאים בודדים, ולכן הדבר החשוב ביותר לזכור הוא כי כל זיהום יהיה מוגבר במהלך חלק PCR של הליך זה. הליך זה מניב נוגדנים רקומביננטיים אנושיים שלמים, המאפשרים טיהור ואפיון תפקודי של נוגדנים רבים ככל שתרצו לייצר.

single-cell-screening-method-for-selection-recovery-antibodies-with

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

אנו מתארים שיטה להפקת תאים T זיכרון הרגולציה, ואת נאיבי מתורם דם אחת האדם. Tregs מקוטב ניתן להשוות ואז תת אחרים במגוון רחב של יישומים גנטיים פונקציונלי עם הומוגניות גנטית, כולל assay דיכוי מפורטים גם כאן.

דור של מושרה תאים T רגולטוריים של האדם תאים ראשוניים טי נאיביות וזיכרון

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בפפטיד: tetramers MHC וmicrobeads המגנטי לבודד אוכלוסיות בתדירות נמוכה של תאי T epitope ספציפיים ולנתח אותם על ידי cytometry זרימה. שיטה זו מאפשרת למחקר הישיר של אוכלוסיות תאי T אנדוגני עניין...

פפטיד: העשרת tetramer מבוסס MHC של תאי T epitope ספציפיים

הסרטון מסביר דרך לטהר תאי B על ידי מיקוד אימונומגנטי והפרדה מהשעיית תאי דם חד-גרעיניים היקפיים. השיטה כוללת סימון סוגי תאים לא רצויים עם נוגדנים או ליגנדים ספציפיים (הקשורים לחלקיקים מגנטיים) המכוונים לחלבונים ספציפיים על פני התא, כדי להתרוקן מתרחיף התא ההטרוגני על ידי הפרדה מגנטית.

ברירה אימונומגנטית שלילית: שיטה לטיהור תאי B מתאים חד-גרעיניים היקפיים בדם

בסרטון זה אנו מדגימים את הבידוד של תאי B מדם היקפי אנושי באמצעות נוגדנים ביוטיניליים ספציפיים לתאים שאינם מסוג B ומיקרו-כדוריות מגנטיות מצומדות סטרפטווידין.

בידוד וטיהור תאי B מדם היקפי אנושי

סרטון זה מדגים את השימוש בבדיקת ELISpot כדי להעריך את תפקודם של תאי B מפרישי נוגדנים, ASC. הנוגדנים המופרשים על ידי ASCs אינטראקציה עם מקטעי נוגדנים רב-שבטיים הקשורים לקרום, אשר מזוהים על ידי נוגדני IgG או IgM מצומדים אנזים. הכתם הצבעוני שנוצר בכל באר מעיד על נוכחות איזוטיפ של הנוגדן הספציפי, אשר נמצא בקורלציה עם פעילות ההפרשה של תאי B.

הערכה תפקודית של תאי B מפרישי נוגדנים באמצעות בדיקת ELISpot

כאן אנו מתארים פרוטוקול לבידוד תת קבוצות של מבשר B-תאים מדם הטבורי. כמות ואיכות מספקת של חומצות גרעין עשויה להיות מופקים מהתאים והשתמשו במבחנים הבאים ניצול DNA או RNA.

בידוד של קבוצות משנה מבשר B-cell מדם טבורים

סינתזה של נוגדנים חד-שבטיים אנושיים היא הצעד הראשון במחקרים שמטרתם לחשוף את המנגנונים הפתופיזיולוגיים של תגובות חיסוניות בתיווך נוגדנים עצמיים. פיתחנו פרוטוקול ליצירת נוגדנים חד-שבטיים רקומביננטיים של אימונוגלובולין G (IgG) מתאי B ממוינים בדם, כולל בידוד תאי B, שיבוט נוגדנים וסינתזה במבחנה.

דור של רקומביננטי אדם IgG נוגדנים חד שבטיים מתאים הממוינים B הונצחו

דם היקפי אנושי משמש בדרך כלל להערכת התגובה החיסונית ההומורלית. כאן, מתוארות השיטות לבידוד תאי B אנושיים מדם היקפי, התמיינות תאי B אנושיים לתאי B מפרישי נוגדנים (AB) (ASCs) בתרבית, וספירת סך ה-IgM וה-IgG-ASCs באמצעות בדיקת ELISpot.

הבידוד, בידול, וכימות של האדם נוגדן מפריש תאים B מדם: ELISPOT בתור Readout פונקציונלי של חסינות הלחות

שיטה פשוטה אך יעילה המעסיקה חלקיקים מגנטיים כדי לזהות ולהעשיר תאי B-reactive אנטיגן לניתוח פונקציונלי פנוטיפי מתואר.

איתור והעשרה של נדיר- אנטיגן ספציפי בתאי B עבור ניתוח של הפנוטיפ ותפקוד

אנו מתארים שיטה לייצור נוגדנים אנושי ספציפי אנטיגן של עניין, מתחיל מתאי B נדיר במחזור דם אנושי. דור של נוגדנים טבעיים אלה הוא יעיל ומהיר, הנוגדנים שהושג יכול להפלות בין אנטיגנים מאוד קשורות.

דור שמסווגת נוגדנים חד-שבטיים אנושי מתאי B אנטיגן ספציפי נדיר במחזור הדם

שימוש במערכות רב שלבי תרבות, מדווחים תא B במבחנה למודל התמיינות תאים פלזמה.

חוץ גופית במודל התמיינות תאי הזיכרון האנושי נורמלי B לתאי פלזמה חיים ארוכים

למדו את שיטת BSelex לבידוד נוגדנים ספציפיים לאנטיגן מתאי B אנושיים באמצעות ציטומטריית זרימה ו-PCR של תא בודד. שיטה זו מאפשרת שחזור מהיר של שרשראות כבדות וקלות מזווגות לפיתוח נוגדנים תרפויים.

שיטת הקרנה של תא בודד לבחירת ושחזור של נוגדנים עם הצורך הרצוי מתוך זיכרון אנושי מועשר B אוכלוסיות תאים

גלה סרטונים נוספים