Name: עיקרי אוסף שיטות JoVE: אינטראקציות חלבון-חלבון (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-10T10:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 52 s
Description: למדו שיטות מתקדמות לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון בביולוגיה מולקולרית. הסרטון מציג פרוטוקולים מובנים לזיהוי וניתוח קשרים בין חלבונים במערכות חיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים למענקי NSERC RGPIN-2018-04994, תוכנית החדשנות של קמפוס אלברטה (RCP-12-002C) ומכון המחקר אלברטה פריון/אלברטה מחדשת פתרונות ביולוגיים (201600018) שהוענקו ל-M.O.

<ol><li>Jin, L., Wang, W., Fang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+protein-protein+interaction+by+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Targeting protein-protein interaction by small molecules.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 54, 435-456 (2014).</li>
<li>Titeca, K., Lemmens, I., Tavernier, J., Eyckerman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+cellular+protein-protein+interactions%3A+Technological+strategies+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Discovering cellular protein-protein interactions: Technological strategies and opportunities.</a> Mass Spectrometry Reviews. 38 (1), 79-111 (2019).</li>
<li>Cui, H., Loftus, K. M., Noell, C. R., Solmaz, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Cyclin-dependent+Kinase+1+Specific+Phosphorylation+Sites+by+an+In+Vitro+Kinase+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e57836(2018).</li>
<li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-immunoprecipitation+Assay+Using+Endogenous+Nuclear+Proteins+from+Cells+Cultured+Under+Hypoxic+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Co-immunoprecipitation Assay Using Endogenous Nuclear Proteins from Cells Cultured Under Hypoxic Conditions.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e57836(2018).</li>
<li>Nolan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calibration-free+Vitro+of+Protein+Homo-oligomerization+Using+Commercial+Instrumentation+and+Free%2C+Open+Source+Brightness+Analysis+Software%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Calibration-free Vitro of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e58157(2018).</li>
<li>Luzarowski, M., Wojciechowska, I., Skirycz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2+in+1%3A+One-step+Affinity+Purification+for+the+Parallel+Analysis+of+Protein-Protein+and+Protein-Metabolite+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e57720(2018).</li>
<li>Karchugina, S., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Heterodimerization+of+Protein+Isoforms+Using+an+Situ+Ligation+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an Situ Ligation Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57755(2018).</li>
<li>Winkelaar, G., Trieber, C., Kumar, J., Overduin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Interactions+of+Globular+and+Filamentous+Proteins+by+Nuclear+Magnetic+Resonance+Spectroscopy+%28NMR%29+and+Microscale+Thermophoresis+%28MST%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST).</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e58537(2018).</li>
<li>Mrozowich, T., McLennan, S., Overduin, M., Patel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Studies+of+Macromolecules+in+Solution+using+Small+Angle+X-Ray+Scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e58538(2018).</li>
<li>Stumpf, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+the+size+of+the+human+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Estimating the size of the human interactome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (19), 6959-6964 (2008).</li>
<li>Lundberg, E., Borner, G. H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+proteomics%3A+a+powerful+discovery+tool+for+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spatial proteomics: a powerful discovery tool for cell biology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

אינטראקציות חלבון-חלבון (PPI) הן בסיסיות ליצירת השפעות ביולוגיות. רבים מהם קשורים קשר הדוק למחלות, והם מוכרים יותר ויותר כמציעים מטרות חשובות לפעולה תרופתית1. קיימות טכניקות רבות לחקר אינטראקציות חלבון אלה, שחלקן נדונות באוסף זה או במאמרים אחרים של JoVE. לכל טכניקה יתרונות ומגבלות משלה2; עם זאת, אין טכניקה אחת מושלמת לכל ה-PPIs בשל המגוון העצום של אינטראקציות אלה המתרחשות בתאים תת-תאיים שונים, עם מגוון רחב של זיקות (פיקומולריות עד מילי-מולריות), ועשויות להיות רק חולפות באופיין.
מבחני קינאז במבחנה הם גישה עקיפה לחקר PPIs שניתן להשתמש בהם כדי לנתח כיצד קינאזות ממלאות את תפקידן הפונקציונלי בהעברת קבוצת פוספט מ-ATP למצע. Cui et al.3 משתמשים בטכניקה זו, יחד עם עיכול טריפטי וספקטרומטריית מסה, כדי לזהות את אתרי הזרחן הספציפיים לקינאז-1 התלויים בציקלין על שבר של חלבון הצנטרומר האנושי F (CENP-F). לצורך אימות פונקציונלי של אתרי זרחון חדשים, המחברים משתמשים במבחן מחייב, המשלב CENP-F המכיל מוטציה פוספומטית וקריופרין α, קולטן הובלה גרעינית, ובכך מספק אימות צולב.
קו-אימונו-משקעים היא שיטה בשימוש נרחב לחקר PPIs שבה נעשה שימוש בנוגדנים כדי ללכוד מטרה ספציפית יחד עם כל מולקולות חלבון אחרות הקשורות אליה. ג'נג ועמיתיו4 מיישמים טכניקה זו כדי לחקור גורמים המעוררים היפוקסיה (HIFs) המתפקדים כהטרודימרים המורכבים מתת-יחידת α מווסתת חמצן ותת-יחידה β המתבטאת באופן מכונן הידועה גם בשם ARNT3. הערה מעניינת לגבי הפרוטוקול שלהם היא שהתאים מושרים ונקצרים בתנאים היפוקסיים, וחלבונים אנדוגניים משברים גרעיניים עוברים משקעים אימונוגרפיים. כפי שמציינים המחברים, מגבלה אחת של השיטה היא שהיא אינה יכולה לקבוע אם PPIs הם ישירים או עקיפים.
Nolan et al.5 מציגים פרוטוקול למדידת מספר המולקולות ובהירותן בתמונות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית 'מספר ובהירות' (N&B), שניתן ליישם לזיהוי הומו-אוליגומריזציה של חלבונים. ניתן להשתמש בטכניקה הן במבחנה והן ב-vivo והיא יושמה כדי לכמת במדויק את המצב האוליגומרי של FKBP12F36V המסומנים ב-mVenus לפני ואחרי הוספת תרופה דימריזציה. המחברים דנים ביתרונות הטכניקה ביחס לטכנולוגיות קשורות ומדגישים את החשיבות של תיקון להלבנה ותנודות עוצמה ארוכות טווח. מיקרוסקופים קונפוקליים המצוידים בגלאים דיגיטליים מקלים על הכמות, אך N&B אפשרי גם עם גלאים אנלוגיים.
טיהור זיקה של קומפלקסים מרובי חלבונים, יחד עם זיהוי מרכיביהם, היה טכניקה בשימוש נרחב להבנת הפונקציות של חלבונים מורכבים כאלה. בפרוטוקול של Luzarowski et al.6, טכניקה זו נלקחת צעד קדימה על ידי אפיון בו-זמנית הן PPIs והן אינטראקציות חלבון-מטבוליט (PMIs) בתאי צמח Arabidopsis טרנסגניים. נוקלאוזידים דיפוספט קינאזות מתויגים מטוהרים על ידי הליך התגית של טיהור זיקה טנדם (TAP) עם חלבונים שנלכדו ומולקולות קטנות שזוהו לאחר מכן על ידי ספקטרומטריית מסה. הייחודיות של פרוטוקול זה היא היכולת לזהות ליגנדים הידרופוביים והידרופיליים כאחד; זהו פרוטוקול מיצוי שלושה באחד המאפשר לחקור הן PPIs והן PMIs ומיישם טיהור זיקה לשתילת תאים.
לבדיקת קשירת הקרבה יש יתרון בכך שהיא משמשת לאיתור אינטראקציות בין חלבונים אנדוגניים בתאים וברקמות. קרצ'וגינה וצ'רנוף7 משתמשים בטכניקה כדי להראות את נוכחותם של הטרודימרים של הקינאזות MST1 ו-MST2 בתאי שוואן אנושיים (HSCs) ותאי כליה עובריים אנושיים (HEK-293). במאמר שלהם יש כמה עצות חשובות כיצד לבצע את הטכניקה בהצלחה. נדרשים נוגדנים ראשוניים מתאימים הגדלים במינים שונים כנגד כל חלבון המקיים אינטראקציה, ומכיוון שהספציפיות והרגישות של הנוגדנים הם המפתח, יש לכוונן היטב את ריכוזי הנוגדנים. המחברים מצאו שקופיות תא זכוכית נוחות לניתוח קווי תאים מרובים ושילובי נוגדנים, אך ציינו כי הכרחי להסיר את כל תוספת הסיליקון בין הבארות כדי למנוע הבדלים במרחק הקונפוקלי במהלך המיקרוסקופיה. בנוסף, בקרות חיוביות ושליליות שונות משמשות לאימות התוצאות.
ספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית גרעינית (NMR) היא בדיקה רגישה שניתן להשתמש בה כדי לספק רזולוציה ברמה האטומית ומידע כמותי על אינטראקציות חלבון ואינטראקציות חלבון-ליגנד. וינקלאר ועמיתיו8 משתמשים בטכניקה כדי לחקור את האינטראקציה בין שני חלבונים (וימנטין ואנוופלאקין) המצויים בדסמוזומים, מבני תאים המעורבים בהידבקות תא לתא הנמצאים בדרך כלל ברקמות החוות לחץ מכני עז. המחברים משתמשים בתחום וימנטין 15עם תווית N ורוכשים ספקטרום דו-ממדי באמצעות מתאם קוונטי יחיד הטרו-גרעיני (HSQC). בנוכחות תחום מ-envoplakin, נצפית התרחבות קו נרחבת והיעלמות שיא, בהתאם לאינטראקציה עם חלבון. המחברים חוקרים עוד את בסיס האינטראקציה באמצעות מוטגנזה ותרמופורזיס בקנה מידה מיקרו (MST) כדי לספק מידע כמותי.
פיזור קרני רנטגן בזווית קטנה (SAXS) היא טכניקה שניתן להשתמש בה כדי לספק מידע על הגודל והקונפורמציות של מקרומולקולה בתמיסה וליצור מעטפת מולקולרית של קומפלקסים גדולים, רב-תחומיים או חלבונים ברזולוציה נמוכה. בפרוטוקול של Mrozowich et al.9, הטכניקה משמשת ליצירת מבנה ברזולוציה נמוכה של נידוגן-1 ולמינין γ-1 בקומפלקס. הטכניקה עשויה לעניין חוקרים החוקרים PPIs בחלבונים גדולים עם תחומים כדוריים מרובים שהם גדולים מדי עבור ספקטרוסקופיה של NMR ומאתגרים להתגבש עבור קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן.
ההערכה היא שיש כ-650,000 אינטראקציות באינטראקטום האנושי10 - מספיק כדי להעסיק את החוקרים בתחום לזמן מה. התפתחות אחרונה, שהתאפשרה הודות להתקדמות במיקרוסקופיה, ספקטרומטריית מסה ולמידת מכונה, היא פרוטאומיקה מרחבית שעשויה לספק תובנה רבה בתחום זה בעתיד11. אוסף זה של שיטות PPI יעזור לחוקרים להתמודד עם אתגר חשוב זה תוך הימנעות ממלכודות פוטנציאליות.

עיקרי אוסף שיטות jove: אינטראקציות חלבון-חלבון

JoVE Methods Collection Highlights: Protein-Protein Interactions

עיקרי אוסף שיטות JoVE: אינטראקציות חלבון-חלבון

jove-methods-collection-highlights-protein-protein-interactions

Without Section

למדו שיטות מתקדמות לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון בביולוגיה מולקולרית. הסרטון מציג פרוטוקולים מובנים לזיהוי וניתוח קשרים בין חלבונים במערכות חיות.

עיקרי אוסף שיטות JoVE: אינטראקציות חלבון-חלבון

גלה סרטונים נוספים