אפיון ברמה המולקולרית באמצעות גישות ביוכימיות איתנות של חלבון קינאז חדש

Immunoprecipitation היא טכניקה חזקה מאוד לבודד ולטהר חלבון היעד. בתנאים חלקים, חלבונים, וסתים או מצעים עשויים להיות חיסוניים במשותף. לאחר מכן, ייתכן שתתגלה רשת אינטראקציה חדשה.

ניתן להעריך גם את פעילות החלבון האימונופריפיטי. בפרט, פעילות של קינאז עשוי להיבדק על מצעים שונים על ידי תיוג P32-ATP. עם זאת, ניתן להעריך פעילות של מעכבים המכוונים לקינאז המעורב במחלה.

הם עשויים להוות תרכובות עופרת לפתח תרופות חדשות. שיטה זו יכולה להיות מורחבת מיונקים לשמרים או חיידקים. טכניקה זו אינה כל כך קשה.

לנקודות מפתח:ודא שיש לך שליטה שלילית כדי לוודא שהאינטראקציה שזוהתה היא ספציפית, ובחר בקפידה תנאי תיזה כדי לשמור על אינטראקציות ופעילות. פרטים קטנים ומחוות חשובים כדי להבטיח את ההצלחה של טכניקה זו, והם אף פעם לא מתוארים בחומרים ושיטות של מאמרים. הדגימה של ההליך תהיה פביאן גודין, טכנאית מהמעבדה שלנו.

לאחר התאים מוכנים בחדר תרבות התא בתוך ארון biosafety, להשתמש פיפטה 10 מיליליטר כדי להסיר את התקשורת מן הצלחות להשליך אותו בבקבוק פסולת ייעודי עם אקונומיקה. לאחר מכן, מוסיפים 10 מיליליטר של DMEM טרי בתוספת, ומכניסים את הצלחות בחזרה לתוך אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס. כדי להכין את תערובת ההמרה, בצינור 15 מיליליטר, להוסיף 450 microliters של 10 מילימולר טריס הידרוכלוריד פתרון ב pH 7.5, בתוספת EDTA מילימולר אחד ו 50 microliters של 2.5 תווי סידן טוחנת.

מערבבים על ידי היפוך. לתוך הצינור, להוסיף נפח המתאים 10 מיקרוגרם של DNA פלזמה, מוגברת על ידי ערכת midiprep DNA, ומדולל עם מאגר elution של ערכה זו, וריכוזו נקבע. להפוך את הצינור לערבב.

לאחר מכן, עם תסיסה חלקה על מערבל מערבולת, לאט להוסיף 500 microliters של BES מאגר מלוחים 2X להתרכז, טיפה אחר טיפה לתוך הצינור. להזיז אותו בזהירות רבה, לא להפריע היווצרות מורכבת בין DNA וסידן פוספט. דגירה לפחות 15 דקות, או עד 45 דקות, בטמפרטורת החדר.

עכשיו, להעביר את הצלחת כדי לעבור מהחממה לארון הבטיחות. מוסיפים את קומפלקס הדנ"א המוכן טיפה אחר טיפה על התאים על כל פני השטח של הצלחת. אינקובט במשך 24 עד 72 שעות באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס.

כדי למנוע השפלת חלבונים, הכינו חיץ תזה על קרח, תוך התחשבות בארבעה מיליליטר של חיץ תזה לכל צלחת מקולבקת. קח את הצלחת עם תאים מנופלים מהאינקובטור. הסר את התקשורת והשליך אותה בבקבוק פסולת אקונומיקה ייעודי.

כדי לשטוף את התאים, להוסיף שלושה מיליליטר של PBS קר בצד של צלחת טיפה על ידי טיפה, כדי למנוע ניתוק תאים מנודים. ובעדינות מערבל את הצלחת כדי להפיץ את החיץ על פני השטח. להטות את הצלחת כדי להסיר את PBS ולהשליך אותו לתוך בקבוק הפסולת.

חזור על הכביסה פעם נוספת. מניחים את הצלחת על קרח. בסוף, להסיר בזהירות את שאר PBS.

לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטרים של מאגר תזה קרה לתאים שטופים מנופים. מורחים אותו על פני הלוח. דגירה במשך 10 דקות על קרח.

מעת לעת, שוב להפיץ את המאגר על פני השטח של הלוח. לאחר מכן, השתמש מרית התא כדי לגרד את התאים מעל פני השטח ולאסוף אותם בצינור microcentrifuge. צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 10, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס.

לאסוף את ליסנטנט על טבעי לתוך צינור microcentrifuge חדש ולאסוף aliquot 50 microliter של שבר זה לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש אחר. aliquot זה ישמש כדי לבדוק אם חלבונים מנוקטים באים לידי ביטוי היטב. השלך את גלולת האשפה לפח.

ראשית, יש לעכל בעדינות את פתרון המלאי של חרוזי אגרוז יחד עם הנוגדן המתאים. חותכים את הקצה של קצה 200 מיקרוליטר כדי להפוך את פתח אחד עד שני מילימטר. חבר את הקצה למיקרופיגט וצייר 40 מיקרוליטרים של הפתרון, מה שמאפשר ל חרוזים להיכנס לקצה.

פיפטה את חרוזים למעלה ולמטה מספר פעמים כדי להרוות את הקצה כדי להבטיח את הנפח הנכון של חרוזים ולהעביר את חרוזים צינור microcentrifuge. הוסיפו 500 מיקרוליטרים של חיץ TNET, ערבבו לפי היפוך וצנטריפוגה במשך שתי דקות במהירות של פי 1,000 G וארבע מעלות צלזיוס. הסר בזהירות את העל-טבעי והוסף 500 מיקרוליטרים של מאגר TNET.

דגירה על גלגל מסתובב לפחות שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, צנטריפוגה הצינור במשך שתי דקות ב 1, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס ולשטוף את חרוזים פעמיים עם 500 microliters של חיץ תמוגה על ידי היפוך צנטריפוגה. לאחר הכביסה, מעבירים את השבר הכולל שנאסף בעבר לצינור ו דגירה על גלגל מסתובב בארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים עד ארבע שעות.

עכשיו, צנטריפוגה הצינור המכיל את חרוזים immunoprecipitated במשך שתי דקות ב 1, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס. לשטוף את חרוזים חמש פעמים עם 500 microliters של חיץ תמוגה על ידי היפוך צנטריפוגה. בעת שטיפת חרוזים, יש לדאוג לא להתקרב יותר מדי מהחרוזים תוך הסרת על-טבעי.

אחרת, חרוזים ישואף ובסוף הניסוי, לא יישארו עוד חרוזים. עבור אלוטיון, צנטריפוגה ראשונה במשך שתי דקות ב 1, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס. השתמש במיקרופיגט מיליליטר אחד כדי להסיר בזהירות את העל-טבעי.

לאחר מכן, עם מזרק המילטון מצויד במחט מבוצרת, להסיר את הטיפות האחרונות של supernatant כדי למנוע שאיפה של חרוזים. לאחר מכן, להוסיף 40 microliters של חיץ 4X Laemmli. הומוגניזציה על ידי הקשה עדין על הצינור.

דגירה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, צנטריפוגה במשך חמש דקות ב 10, 000 פעמים G וטמפרטורת החדר. עם מזרק המילטון, להעביר את העל טבעי eluate לתוך צינור microcentrifuge חדש.

יש לאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס. תאי HEK-293 נותבו עם LIMK 2-1 לא מתויג או אחד מהאיסופורמים המתויגים של LIMK 2. LIMK 2-1 מתבטא היטב בתנאים השונים.

נוגדן אנטי LIMK 2-1 אינו מזהה LIMK 2a ו LIMK 2b isoforms, וזה ספציפי, כמו האות שלה פוחתת כאשר תאים מומרים עם LIMK2 RNA מפריע קטן, לעומת שליטה RNA מפריע קטן. בשורות תאים אנושיים שונים, LIMK 2-1 נראה לידי ביטוי HEK-293 ו HeLa, אבל לא ב C6. ניסויי Coimmunoprecipitation שימשו להערכת האינטראקציה של LIMK2-1 עם רוק קינאז במעלה הזרם. כל אחד מהחלבונים השונים המקודדים על ידי הווקטורים המנודים בא לידי ביטוי היטב.

שלושת האיסופורמים של LIMK2, כמו גם larp6, היו immunoprecipitated ביעילות. ב eluates, רוק זוהה ובכך coimmunoprecipitated עם שלושת isoforms של LIMK2, אבל לא עם larp6. האינטראקציה שזוהתה היא ספציפית לאחר מכן.

Coimmunoprecipitated LIMK 2-1 נבדק עבור פעילות קינאז שלה באמצעות תיוג ATP גמא P32. LIMK 2-1 לא זרחן קופלין, ואילו זה עשה זרחן מילין חלבון בסיסי, או MBP. LIMK 2-1 הוא immunoprecipitated ביעילות במבחן זה.

זה קריטי כדי לקבל שליטה שלילית בעת ביצוע immunoprecipitation כדי להיות בטוח האינטראקציה היא ספציפית. יש להגדיר בקפידה את ההרכב של מאגר תיזה כדי לשמר אינטראקציה ופעילות. לאחר immunoprecipitation, ניתן להעריך את פעילות קינאז כדי לספור מצעים שונים.

מוטציה עשויה להיות הציגה בקלות ועשויה לפענח את התפקיד של שאריות ספציפיות. מחקרים פונקציונליים עשויים להתבצע גם כדי להבין את התפקיד הפיזיולוגי של אינטראקציות מודגשות חדשות. תאים חייבים להיות מתורבתים בחדר תרבות ייעודי בתוך ארון ביו-בטיחות.

יש לטפל ב- P32 ATP בזהירות מסוימת. מגן להגנה מפני קרינה, מונה גייגר, איסוף פסולת ספציפית, תגי חזה ואצבע אישיים לזיהוי חשיפה רדיואקטיבית וטיפים לסינון.