Name: בידוד של לינה קינאין תאים מונמוננקה מקולון מורלין באמצעות קולגנאז (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: למדו בידוד תאים מונונוקלאריים מלמינה פרופריה של קולון באמצעות עיכול אנזימטי עם קולגנאז. שיטה זו מאפשרת אימונופנוטיפינג מדויק של אוכלוסיות חיסון מעיים במודלים של דלקת וסרטן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים #1K08HL088260 ו #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., ח, S.J.), ואת הקרן Batchelor למחקר ילדים (D.M., ח, S.J., A.A.H., A.B.P.). C57BL/6 ו-BALB/c עכברים המשמשים במחקר זה היו מונולדו במתקן שלנו או שסופקו על ידי מעבדות ג'קסון או Taconic.

כל המחקרים נערכו תחת פרוטוקולי מחקר מכרסמים שנסקרו ואושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של אוניברסיטת מיאמי מילר בית הספר לרפואה, אשר עונה על הסטנדרטים הוטרינרים שנקבעו על ידי האגודה האמריקנית עבור מדע בעלי חיים במעבדה (AALAS).
1. הכנת פתרונות
<ol><li>
כפי שמתואר בטבלה 1, להכין את מאגר המעי הגס, מבוסס סיליקה צפיפות ההפרדה מדיה 100%, סיליקה מבוססי צפיפות ההפרדה מדיה 66%, סיליקה מבוססי צפיפות ההפרדה מדיה 44%, כגון מאגר העיכול E, ו-FACS מאגר.
	<ol>
<li>הכן את מאגר המעי הגס ביום שלפני ההליך ואחסן לילה ב -4 ° c.</li>
		<li>להכין 100% סיליקה מבוסס צפיפות מדיה הפרדה ביום לפני ההליך ומאוחסן לילה ב 4 ° c, הצבת טמפרטורת החדר בבוקר של ההליך להפשיר.</li>
		<li>הכינו 66% ו-44% מדיית הפרדה מבוססת סיליקה בבוקר הבידוד, באמצעות טמפרטורת החדר 100% מבוסס על דחיסות סיליקה הפרדה מדיה ומאגר קולון.</li>
		<li>למדוד את הכמות המתאימה של היסטרידיוםהנגזרים-הנגזרת הקולגן וחנות ב-20 ° c לילה לפני ההליך. למחרת בבוקר, מתמוסס את הנפח המתאים של מאגר המעי הגס לגזור מאגר העיכול קולגן. עבור כל incubations עם מאגר העיכול קולגן ביום ההליך, לחמם מראש את הפתרונות 37 ° c.</li>
	</ol>
</li>
	<li>עבור כל שלבי הפרוטוקול, לשמור צנטריפוגה אחת ב 20 ° צ' ואת מהירות הסיבוב של 859 x g, עם הבלמים מופעל (0 להאט) עבור הדרגתי צנטריפוגה. הגדר אחר ל -4 ° צ' ומהירות סיבוב של 859 x g, עם ההאטה הסטנדרטית, לשטיפת המדרגות.</li>
</ol>2. קצירת המעי הגס
<ol><li>המתת חסד העכבר באמצעות שיתוף2 חנק ואחריו aalac מאושר confirmatory שיטה.</li>
	<li>מניחים את העכבר במצב פרקדן ולרסס את הפרווה עם 70% אתנול. באמצעות מספריים הרקמה הגדולה, לעשות חיתוך קו האמצע אנכית לחשוף את צפק שלם.</li>
	<li>, שימוש במספריים לחיתוך משובח. פתח את הצפק מלקחיים להשתמש כדי להזיז את המעי הקטן בצד אחד ולחשוף את המעי הגס יורד. משוך מעט כלפי מעלה על המעי הגס יורד כדי לחשוף את החלק הרקטלי של המעי הגס. חותכים את הרקטום העמוק באגן ומנתחים ומסירים את המעי הגס כולו כיחידה אחת, מהרקטום המרוחק לכובע cecal.</li>
	<li>העבר את המעי הגס ב 20 mL מקורר מאגר קולון בצינור פוליפרופילן 50 mL.</li>
</ol>3. ניקוי המעי הגס
<ol><li>מניחים את המעי הגס על מגבת נייר לחלח לחלץ את הצואה מוצק על ידי החלת לחץ קל על קיר המעי עם קצה קהה של מספריים או מלקחיים.</li>
	<li>מניחים את המעי הגס בצלחת פטרי ומרוקן את הבטן עם 10 מ ל של מאגר קולון מקורר באמצעות מזרק 10 מ ל עם 18 גרם מילוי קהה.</li>
	<li>העבר את המעי הגס למאגר של מאגר המעי הגס, והסר את המצע המעי והשומן עם הקצה החד של המספריים.</li>
	<li>מניחים את המעי הגס בצלחת פטרי מלא 5-10 mL מקורר מאגר המעי הגס מאוד באופן ידני כדי לשטוף את השאר תוכן חוקן. חזור על 2-3 פעמים.</li>
	<li>חותכים את longitudinally המעי הגס מן הקצה שלה שרירי יותר המעי הגס האבובית (יצירת פיסת המעי הגס בודד פתוח מלבני) בצלחת פטרי מלא עם מאגר המעי הגס טרי מקורר. התעלם ממדיה קיימת ומלא מילוי עם מאגר נקודתיים נקי ומקורר.</li>
	<li>לשטוף את המעי 3 פעמים על ידי במרץ מתערבל אותו בצלחת פטרי והחלפת 5-10 mL של מאגר קולון מקורר לאחר עם כל כביסה.</li>
	<li>מניחים את רקמת המעי הגס המלבנית על מגבת נייר שלחלח מאגר המעי הגס וחותכים אותו על ידי חיתוך אופקי ולאחר מכן לרסיסים קטנים (3 מ"מ x 3 מ"מ סעיפים).</li>
	<li>לאסוף את שברי המעי הגס בזהירות באמצעות מלקחיים עדין לתוך 20 מ"ל מקורר מאגר קולון בשפופרת פוליפרופילן 50 mL.
</li>
	<li>לשטוף את שברי המעי הגס 3 פעמים, כל לשטוף ב 20 מ"ל מאגר המעי הגס, על ידי מתערבל במרץ את הצינור עבור 30 s. בין כל עצבנות, לאפשר שברי הרקמה להתיישב בתחתית הצינור. Decant או ואקום משאוב את supernatant תוך מניעת אובדן של הרקמה בתהליך השאיפה בין כל כביסה. הערה: אין צורך לשנות את הצינור לאחר כל כביסה.</li>
</ol>4. קולגן העיכול 1
<ol><li>הוסף 20 מ ל של מאגר העיכול קולגן כדי שברי המעי הגס שטוף בצינור 50 mL פוליפרופילן חרוט.</li>
	<li>מניחים את הצינור הסגור 50 mL ב 37 ° c בתוך שייקר מסלולית מודחטת עם קצב הסיבוב להגדיר ב 2 x g עבור 60 דקות. להבטיח את שברי הרקמה בתנועה מתמדת במהלך עצבנות; במידת הצורך, הגדילו את קצב הסיבוב בהדרגה כדי להבטיח שרסיסי רקמות לא יתיישבו לתחתית הצינורית.</li>
</ol>5. הכנת מעברי צבע סיליקה מבוססי מדיה הפרדה
<ol><li>הכינו 66% ו 44% מבוסס על דחיסות סיליקה מדיה הפרדה, באמצעות 100% מבוסס סיליקה צפיפות מדיה הפרדה ב 20 ° צ' (טמפרטורת החדר) ומאגר קולון.</li>
	<li>יוצקים 5 מ ל של 66% מבוסס סיליקה דחיסות הפרדה מדיה לתוך כל אחד 3 שונים 15 מ ל צינורות פוליפרופילן. להכין 3 צינורות לכל המעי הגס. פעולה זו מהווה את בסיס הצפיפות הגבוהה יותר של פרוצדורת הבידוד של מעבר הצבע, שאליה מדיה הפרדה בצפיפות נמוכה יותר תהיה שכבתית כדי ליצור את מעבר הצבע של ההפרדה.</li>
	<li>החנות ב -20 ° c עד השימוש.</li>
</ol>6. אוסף של סופרנטאנט מעיכול 1
<ol><li>לאסוף רק את supernatant באמצעות צינורות 25 מ ל ולסנן את supernatant באמצעות הנקבוביות 40 יקרומטר מסננת תא בד הממוקם לתוך צינור נקי של פוליפרופילן 50 mL, לאחר העיכול מקולגן 1 הושלמה. להיזהר לא לאכול כל שברי רקמה קיימים. הערה: שמור את כל חלקי הרקמה הגלויים בצינור. אלה יעברו העיכול השני הקולגן (שלב 8).</li>
</ol>7. קוצ'ינג מאגר העיכול
<ol><li>למלא את צינור פוליפרופילן 50 mL לחלוטין עם מאגר קולון מקורר. הערה: קולאגנאז פעיל ב 37 ° c; מכאן מאגר מקורר מפעיל את האנזים.</li>
	<li>צנטריפוגה את הצינור ב 4 ° צ' ב 800 x g עבור 5 דקות.<ol>
<li>השמט את הסופרנטנט דרך שאיפה ואקום. לשטוף תאים עם 25 מ ל של מאגר קולון טריים צנטריפוגה ב 800 x g עבור 5 דקות.</li>
		<li>השהה מחדש את הגלולה בפחות מ-1 מ ל של מאגר קולון טרי מקורר.</li>
		<li>מניחים את שפופרת פוליפרופילן 50 mL על קרח.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. מיכל העיכול 2
<ol><li>חזור על שלב 4 (עיכול 1) עם שברי הרקמה הנותרים שנשמרו משלב 6.1.</li>
</ol>9. מצבור רקמות לאחר העיכול 2
<ol><li>ריקון שברי הרקמה הלוך ושוב בין הצינור ומזרק 10 מ ל דרך מחט 18 G קהה-end.</li>
	<li>חזור על רצף זה למינימום של 7-8 מעברים מלאים, והמשך עד שלא ניתן לראות שברי רקמה ברוטו או פסולת.</li>
</ol>10. סנן תאים
<ol><li>להעביר את הבולם את הרקמה השעיה דרך מסננת מ40 μm-הנקבוביות תא בדים במרקם לתוך שפופרת נקי של פוליפרופילן 50 mL.</li>
	<li>לשטוף את הסינון תא בד מסננת עם 10 mL מקורר מאגר קולון כדי לשחזר את כל התאים הנסנרות במסנן.</li>
</ol>11. קוצ'ינג קולינג העיכול
<ol><li>ממלאים את צינור 50 mL פוליפרופילן חרוט לחישוק עם מאגר קולון מקורר. הערה: הטמפרטורה של מאגר המעי הגס הוא קריטי כדי להבטיח מקוצ'ינג של פעילות הקולגן.</li>
	<li>ספין ב 4 ° צ' ו 800 x g עבור 5 דקות.</li>
	<li>השמט את הסופרנטנט דרך שאיפה ואקום.</li>
	<li>לשטוף על ידי השעיית מחדש 25 מ ל של מאגר קולון טרי מקורר, ואחריו צנטריפוגה ב 4 ° צ', 800 x g עבור 5 דקות.</li>
	<li>השמט את הסופרנטנט דרך שאיפה ואקום.</li>
	<li>הבריכה את הגלולה מושעה מ העיכול הקולגן 1 (שלב 7) לצינור המקביל שלה משלב 11.4.</li>
	<li>חזור על שלב 11.4 (שטוף וצנטריפוגה).</li>
</ol>12. הפרדת מדיה בצפיפות סיליקה מבוססת הפרדה
הערה: בצע את שלבים 12-18 במהירות האפשרית, כדי להבטיח מהירות מהירה של פעילות הקולגן.
<ol><li>לאחר שלב 11.7, השהה מחדש כל גלולה ב-24 מיל סך של 44% מדיית הפרדה בדחיסות מבוססת סיליקה לכל נקודתיים.</li>
	<li>שכבה איטית 8 מ ל של התקשורת משלב 12.1 על כל אחד משלושת הצינורות המוכנים בשלב 5.2 (המכיל 66% הפרדה בצפיפות ההפרדה מדיה), באמצעות צינורות 10 מ"ל. שמור על זרימה יציבה ואיטית של 44% מדיית הפרדת הצפיפות באמצעות שכבות המילוי על מנת למנוע הפרעה של הממשק.</li>
	<li>איזון בזהירות כל הצינורות בתוך דליי צנטריפוגה באמצעות קנה מידה או שיווי משקל.</li>
	<li>ספין את הצינורות 20 דקות ב 859 x g בצנטריפוגה ללא בלם ב 20 ° c. אפשר לרוטורי להגיע למנוחה מוחלטת לפני הסרת הצינורות, ומטפלים לא לשבש את התאים בממשק מעבר הצבע.</li>
</ol>13. לאסוף תאים מונמונומנט מתוך ממשק מעבר צבע
<ol><li>המחש את ממשק מעבר הצבע (קרוב ל-5 מ"ל), שם בדרך כלל להקה לבנה בעובי 1-2 מ"מ (המכילה MNC) קיימת. הערה: אחד יכול או לא יכול לראות להקה לבנה. עם זאת, MNC יהיה בממשק זה, צריך לענן את הבהירות של ממשק מעבר הצבע.</li>
	<li>ואקום משאוב ולהשליך את העליון 7 מ ל של מעבר הצבע העליון כדי לאפשר הפיפטה קל גישה לממשק.</li>
	<li>באמצעות יניקה ידני שאיבה רציפה תנועה יציבה מסתובבת, לאסוף את שכבת הממשק של תאים לתוך צינור נקי 50 mL פוליפרופילן חרוט. לאסוף עד הממשק בין 2 הדרגתיות הוא ברור ו שבירה (ניקוי של תאים).</li>
	<li>ממלאים את צינור האוסף עם 50 mL של מאגר FACS מקורר. ספין ב 4 ° צ', 800 x g עבור 5 דקות.</li>
	<li>לשאוב את הסופר באמצעות שאיפה ואקום ולהשעות את הגלולה ב 1 מ ל של מאגר FACS.</li>
	<li>לספור את התאים על הומוציטוטומטר בדילול 1:2 באמצעות שיטות אי הכללה של תא מת מתאים.</li>
	<li>המשך לצביעת FACS או מספר אחר עם המעי הגס מבודד טרי MNC.</li>
</ol>

<ol><li>Schneeman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+physiology+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal physiology and functions.</a> British Journal of Nutrition. 88, S159-S163 (2002).</li>
<li>Arranz, E., Pena, A. S., Bernardo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mediators+of+inflammation+and+immune+responses+in+the+human+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+of+inflammation%22%5BJournal%5D)">Mediators of inflammation and immune responses in the human gastrointestinal tract.</a> Mediators of inflammation. 2013, 1-3 (2013).</li>
<li>Blumberg, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+in+the+intestinal+tract%3A+pathogenesis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+diseases%22%5BJournal%5D)">Inflammation in the intestinal tract: pathogenesis and treatment.</a> Digestive diseases. 27 (4), 455-464 (2009).</li>
<li>Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Distribution+of+Lymphocytes+and+Plasma+Cells+and+the+Role+of+the+Gut%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Tissue Distribution of Lymphocytes and Plasma Cells and the Role of the Gut.</a> Trends in Immunology. 29 (5), 206-208 (2008).</li>
<li>Reibig, S., Hackenbrunch, C., Hovelmeyer, N. Isolation of T Cells from the Gut. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aReibig%2C+S+%22T-Helper+Cells%3A+Methods+and+Protocols%2C+Methods+in+Molecular+Biology%22">T-Helper Cells: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology</a>. Waisman, A., Becher, B. , Humana Press. New York, NY. 21-25 (2014).</li>
<li>Mowat, A. M., Agace, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+Specialization+within+the+Intestinal+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regional Specialization within the Intestinal Immune System.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).</li>
<li>Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terminology%3A+Nomenclature+of+mucosa-associated+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Terminology: Nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue.</a> Mucosal Immunology. 1 (1), 31-37 (2008).</li>
<li>Schieferdecker, H. L., Ullrich, R., Hirseland, H., Zeitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+differentiation+antigens+on+lymphocytes+in+the+human+intestinal+lamina+propria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">T cell differentiation antigens on lymphocytes in the human intestinal lamina propria.</a> Journal of Immunology. 148 (8), 2816-2822 (1992).</li>
<li>Mowat, A. M., Viney, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anatomical+basis+of+intestinal+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The anatomical basis of intestinal immunity.</a> Immunological Reviews. 156, 145-166 (1997).</li>
<li>Ford, A. C., Lacy, B. E., Talley, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Irritable+Bowel+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Irritable Bowel Syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 376 (26), 2566-2578 (2017).</li>
<li>Harb, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crohn%27s+Disease+of+the+Colon%2C+Rectum%2C+and+Anus%5BTitle%5D)+AND+%22Surgical+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Crohn's Disease of the Colon, Rectum, and Anus.</a> Surgical Clinics of North America. 95 (6), 1195-1210 (2015).</li>
<li>Ungaro, R., Mehandru, S., Allen, P. B., Pyrin-Biroulet, L., Colombel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ulcerative+Colitis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Ulcerative Colitis.</a> The Lancet. 389 (10080), 1756-1770 (2017).</li>
<li>Mohty, B., Mohty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+complications+and+side+effects+after+allogeneic+hematopoietic+stem+cell+transplantation%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+cancer+journal%22%5BJournal%5D)">Long-term complications and side effects after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: an update.</a> Blood cancer journal. 1 (4), 1-5 (2011).</li>
<li>Hatzimichael, E., Tuthill, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+and+cloning%3A+advances+and+applications%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell transplantation.</a> Stem cells and cloning: advances and applications. 3, 105-117 (2010).</li>
<li>Hernandez-Margo, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonic+Complications+Following+Human+Bone+Marrow+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Coloproctology%22%5BJournal%5D)">Colonic Complications Following Human Bone Marrow Transplantation.</a> Journal of Coloproctology. 35 (1), 46-52 (2015).</li>
<li>Del Campo, L., Leon, N. G., Palacios, D. C., Lagana, C., Tagarro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abdominal+Complications+Following+Hematopoietic+Stem+Cell+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Radio+Graphics%22%5BJournal%5D)">Abdominal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation.</a> Radio Graphics. 34 (2), 396-412 (2014).</li>
<li>Lee, J., Lim, G., Im, S., Chung, N., Hahn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+Complications+Following+Hematopoietic+Stem+Cell+Transplantation+in+Children%5BTitle%5D)+AND+%22Korean+Journal+of+Radiology%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation in Children.</a> Korean Journal of Radiology. 9 (5), 449-457 (2008).</li>
<li>Takatsuka, H., Iwasaki, T., Okamoto, T., Kakishita, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+Graft-Versus-Host+Disease%3A+Mechanisms+and+Management%5BTitle%5D)+AND+%22Drugs%22%5BJournal%5D)">Intestinal Graft-Versus-Host Disease: Mechanisms and Management.</a> Drugs. 63 (1), 1-15 (2003).</li>
<li>Shuyu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+immune+tolerance+in+nonmyeloablative+MHC-mismatched+BMT+for+murine+%CE%B2-thalassemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Bidirectional immune tolerance in nonmyeloablative MHC-mismatched BMT for murine β-thalassemia.</a> Blood. 129 (22), 3017-3030 (2017).</li>
<li>van der Merwe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recipient+myeloid-derived+immunomodulatory+cells+induce+PD-1+ligand-dependent+donor+CD4%2BFoxp3%2B+regulatory+T+cell+proliferation+and+donor-recipient+immune+tolerance+after+murine+nonmyeloablative+bone+marrow+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Recipient myeloid-derived immunomodulatory cells induce PD-1 ligand-dependent donor CD4+Foxp3+ regulatory T cell proliferation and donor-recipient immune tolerance after murine nonmyeloablative bone marrow transplantation.</a> Journal of Immunology. 191 (11), 5764-5776 (2013).</li>
<li>Couter, C. J., Surana, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Flow+Cytometric+Characterization+of+Murine+Small+Intestinal+Lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), e54114(2016).</li>
<li>Qiu, Z., Sheridan, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+Lymphocytes+from+the+Mouse+Small+Intestinal+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e57281(2018).</li>
<li>Weigmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subsequent+analysis+of+murine+lamina+propria+mononuclear+cells+from+colonic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and subsequent analysis of murine lamina propria mononuclear cells from colonic tissue.</a> Nature Protocols. 2, 2307-2311 (2007).</li>
<li>Bull, D. M., Bookman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+characterization+of+human+intestinal+mucosal+lymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional characterization of human intestinal mucosal lymphoid cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 59 (5), 966-974 (1977).</li>
<li>Davies, M. D., Parrott, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+purification+of+lymphocytes+from+the+epithelium+and+lamina+propria+of+murine+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Preparation and purification of lymphocytes from the epithelium and lamina propria of murine small intestine.</a> Gut. 22, 481-488 (1981).</li>
<li>Carrasco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Lymphocyte+Isolation+Methods+for+Endoscopic+Biopsy+Specimens+from+the+Colonic+Mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of Lymphocyte Isolation Methods for Endoscopic Biopsy Specimens from the Colonic Mucosa.</a> Journal of Immunological Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).</li>
<li>Zhang, Y., Ran, L., Li, C., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity%2C+Structures%2C+and+Collagen-Degrading+Mechanisms+of+Bacterial+Collagenolytic+Proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Diversity, Structures, and Collagen-Degrading Mechanisms of Bacterial Collagenolytic Proteases.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6098-6107 (2015).</li>
<li>Harrington, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+collagenases+and+collagen-degrading+enzymes+and+their+potential+role+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Bacterial collagenases and collagen-degrading enzymes and their potential role in human disease.</a> Infection and immunity. 64 (6), 1885-1891 (1996).</li>
<li>Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+collagenases+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial collagenases - A review.</a> Critical Reviews in Microbiology. 42 (1), 106-126 (2014).</li>
<li>Autengruber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Enzymatic+Tissue+Disintegration+on+the+Level+of+Surface+Molecule+Expression+and+Immune+Cell+Function%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Impact of Enzymatic Tissue Disintegration on the Level of Surface Molecule Expression and Immune Cell Function.</a> European Journal of Microbiology and Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).</li>
<li>Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Murine+Small+Intestine+Leukocyte+Isolation+for+Global+Immune+Phenotype+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of Murine Small Intestine Leukocyte Isolation for Global Immune Phenotype Analysis.</a> Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).</li>
<li>van der Heijden, P. j, Stok, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Procedure+for+the+Isolation+of+Functionally+Active+Lymphoid+Cells+from+the+Murine+Intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved Procedure for the Isolation of Functionally Active Lymphoid Cells from the Murine Intestine.</a> Journal of Immunological Methods. 3 (2), 161-167 (1987).</li>
</ol>

המחברים לא מצהירים על אינטרסים פיננסיים מתחרים.

פרוטוקול חזותי זה מתאר שיטות נסבל היטב עבור בידוד של תאים מוננועיים במעי הגס כולל לימפוציטים קיננה (LPL). בהינתן כי פרוטוקול זה היה אופטימיזציה בהערכת חמור לאחר השתלת מודלים העכבר כאשר ציטוקינים דלקתיים ופציעה רקמות להשאיל את עצמם הכדאיות הירודה של MNC התאושש, אנו מצפים כי שיטות אלה ניתן לתרגם לאחרים יישומים המחייבים ניתוח פנוסטימית של חוקן MNC. אלה כוללים אך, אינם מוגבלים להערכת דלקת המעי הגס במודלים של העכבר של מחלת המעי הגס, מחקרים של תגובות החיסונית של טיפול קוליטיס ממוקד, קוליטיס המיוצר על ידי פתוגנים זיהומיות. בנוס...

למרות מערכת העיכול (GI) במערכת מוקדש בעיקר עיבוד וספיגה חוזרת של חומרים מזינים מזון, במערכת GI גם שומר על תפקידים מרכזיים ביושרה של כלי הדם, הלימפה, והעצבים של איברים רבים אחרים באמצעות המערכת החיסונית שלה submucosal1. מערכת החיסון GI יש תפקיד רב השפעה הן בריאות המערכת העיכול ומערכתית בשל החשיפה המתמדת שלו אנטיגנים זרים ממזון, בקטריה של הקומנדנט, או פולשים פתוגנים1,2. לכן, מערכת החיסון GI חייב לשמור על איזון עדין שבו היא סובלנית אנטיגנים שאינם פתוגניים תוך התגובה בהתאם אנטיגנים פתוגניים1,2. כאשר האיזון של סובלנות והגנה מופרת, מקומי או מערכתית החיסונית חוסר תקנה ודלקת יכול להתרחש כתוצאה מספר עצום של מחלות1,2,3.
המעי נמלים לפחות 70% של כל תאי הלימפה בגוף4. האינטראקציות הראשוניות ביותר במערכת החיסונית כרוכות לפחות באחת משלוש תחנות החיסון במעי: 1. כתמים של Peyer, 2) לימפוציטים האפיתל (אל-על) ו-3) לימפוציטים באופן מרכזי (LPL). כל אלה מורכב רשת מורכבת מחוברים של תאים חיסוניים המגיבים במהירות לאתגרים החיסונית נורמלי בבטן5. מוגבל לסטרומה מעל המוסקולריס mucosae, מובנה לאמינה מובנית היא רקמת החיבור של רירית הבטן וכולל פיגומים על הוויאוס, הוזוקולטורה, ניקוז הלימפה, מערכת העצבים mucosae, כמו גם מולדים רבים ומערכת המשנה החיסונית. האדפטיבית6,7,8,9 LPL הם מורכבים CD4+ ו CD8+ T תאים ביחס משוער של 2:1, תאים פלזמה ותאים השושלת המייאלואידית כולל, תאים דנדריטים, התורן תאים, אאוזיפרפילים ו מקרופאגים6.
יש עניין הולך וגובר בהבנת הדיסתקנה החיסונית ודלקת הבטן כפי שהיא מתייחסת למצבי מחלה שונים. תנאים כגון מחלת קרוהן ו קוליטיס כיבית כל מניפסט רמות שונות של דלקת במעי הגס10,11,12. בנוסף, חולים עם הפרעות ממאירות או שאינן ממאירות של מח או מערכת החיסון אשר עוברים השתלת מח עצם allogeneic (allo-BMT) יכול לפתח צורות שונות של קוליטיס כולל 1) רעילות ישירה מתוך התניה משטרי לפני bmt, 2) זיהומים נגרמת על ידי דיכוי חיסוני לאחר bmt ו 3) השתל-מול-מארח מחלה (gvhd) מונע על ידי מסוג התורם תאים T מגיב התורם allo-אנטיגנים ברקמות לאחר bmt13,14,15. כל אלה post-bmt סיבוכים לגרום שינויים משמעותיים בסביבה החיסונית של המעיים16,17,18. השיטה המוצעת מאפשרת הערכה מהימנה של הצטברות תאים חיסוניים במעי הגס של העכבר, כאשר מוחל על הנמענים murine לאחר BMT, מקלה על היכולת היעילה של שני התאים החיסוניים של התורם והנמען המעורבים סובלנות השתלה19 ,20. גורמים נוספים לדלקות בטן כוללים ממאירות, אלרגיה למזון, או שיבוש מיקרובידום המעיים. פרוטוקול זה מאפשר גישה של תאים מונוליניים המעיים מן המעי הגס, עם שינויים, לוקיציטים של המעי הדק בכל אחד מדגמי murine אלה טרום קלינית.
חיפוש בתוך באמצעות מונחי החיפוש "המעי והתא החיסונית ובידוד" חושף מעל 200 פרסומים המתארים שיטות עיכול קטן כדי לחלץ תאים חיסוניים. עם זאת, החיפוש ספרות דומה לתשואות המעי הגס לא היטב פרוטוקולים המציין בידוד של תאים חיסוניים מן המעי הגס. זה יכול להיות בגלל המעי הגס יש יותר שרירי וביניים בשכבות, עיבוד זה קשה יותר לעכל לחלוטין מאשר המעי הדק. בניגוד לפרוטוקולים קיימים, פרוטוקול זה משתמש באופן ספציפי בקולאגנאז E מתוך קלוסטרידיום hiסטוליום ללא הקולגן האחרים בקטריות (קולאגנאז D/קולאגנאז I). אנו מדגימים כי, באמצעות פרוטוקול זה, העיכול של רקמת המעי הגס ניתן להשיג תוך שמירה על איכות הבטן מבודדים תאים חיסוניים ברורים (MNC) ללא תוספת של ריאגנטים נגד החלקה כגון נתרן versenate (EDTA), Dispase השני, ו ביטול הכרה i (dnase)21,22,23. פרוטוקול זה הוא ממוטב כדי לאפשר הפקת חזקה מיותרת של MNC קיימא מן הנקודתיים murine עבור מחקרים מכוונים נוספים צריך להשאיל את עצמו למחקר של אימונולוגיה של המעי הגס או (עם שינויים) את המעי הדק24, . עשרים וחמש

<table><tbody><tr><td>60 מ"מ פטרי DIsh</td><td>תרמו מדעי</td><td>150288</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>קורנינג</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Lonza BioWhittaker</td><td>BW17-517Q</td><td></td></tr><tr><td>10 מ"ל חד פעמי פיפטה סרולוגית</td><td>קורנינג</td><td>4100</td><td></td></tr><tr><td>10 מ"ל מזרק</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל צינורות חרוטיים לא סטריליים</td><td>TruLine</td><td>TR2002</td><td></td></tr><tr><td>18 גרם מחט קהה</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>305180</td><td></td></tr><tr><td>25 מ"ל חד פעמי פיפטה סרולוגי</td><td>קורנינג</td><td>4250</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m גודל נקבוביות מסננת תאים</td><td>קורנינג</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל פלקון</td><td>צינור קורנינג</td><td>21008-951</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A4503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>מאגר קיבוע</td><td>Biolegend</td><td>420801</td><td></td></tr><tr><td>E. coli קולגנאז E מ- Clostridium histolyticum</td><td>Sigma</td><td>C2139</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0.5 M סטרילי פתרון</td><td>Amresco</td><td>E177-500ML</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>תרמו / פישר סיינטיפיק -HyCLone</td><td>SV30014.03</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>GE Healthcare-HyClone</td><td>SH30237.01</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare-Life Sciences</td><td>1708901</td><td></td></tr><tr><td>RPMI בינוני</td><td>קורנינג</td><td>17-105-CV</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אזיד</td><td>VWR מדעי החיים אמרסקו</td><td>97064-646</td><td></td></tr><tr><td>טריפן כחול</td><td>לונזה ביו-ויטאקר</td><td>17-942E</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד של לינה קינאין תאים מונמוננקה מקולון מורלין באמצעות קולגנאז

Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E

המעי הוא הבית למספר הגדול ביותר של תאים חיסוניים בגוף. המעי קטן וגדול מערכת חיסונית המשטרה חשיפה לאנטיגנים אקסוגני ולווסת את התגובות החזק מיקרוביואלי החיסון הנגזרות. מסיבה זו, המעי הוא אתר היעד העיקרי של חוסר תקנה חיסונית ודלקת במחלות רבות, כולל אבל, לא מוגבל למחלות מעיים דלקתיות כגון מחלת קרוהן כיבית קוליטיס, השתל-מול-מארח מחלה (GVHD) לאחר העצם השתלת מח עצם (BMT), ומצבים אלרגיים וזיהומיות רבים. מודלים murine של דלקת במערכת העיכול ו קוליטיס משמשים בכבדות כדי לחקור סיבוכים GI ו-קלינית מיטוב אסטרטגיות למניעה וטיפול. נתונים שנאסף מן המודלים האלה באמצעות בידוד וניתוח פנוטימית של תאים חיסוניים מן המעי הוא קריטי כדי הבנה חיסונית נוספת שניתן להחיל על מערכת העיכול שפר הפרעות דלקתיות מערכתית. דו ח זה מתאר פרוטוקול אפקטיבי ביותר לבידוד של תאים מוננועיים (MNC) מהמעי הגס באמצעות ממשק מעבר הדרגתי מעורב בדחיסות מבוססת סיליקה. שיטה זו בונה מבודד מספר משמעותי של לוקיציטים קיימא תוך מזעור פסולת מזהם, ומאפשר פנוטיפים החיסונית הבאים על ידי הזרימה cy, try או שיטות אחרות.

כאשר עובדים עם מחלת המעי הגס מודל מודלים, זה מועיל להיות מסוגל להעריך הן לכמת באיכות איכותית, בין MNC של המעי הגס, מספר קבוצות מערכות החיסון מעורב בתהליך דלקתי. השעיית תא יחיד של MNC שהושג באמצעות היישום של פרוטוקול זה מאפשר אפיון פנוסטילי כזה בצורה איתנה וללא שימוש. כהוכחה לעיקרון היישום של שיטת בידוד זו תחת הגדרות ניסיוני מגוונות, החזרנו את המעי הגס באמצעות שיטה זו וביצעו מרובת פרמטרים זרימה cy, לנסות על תאים מבודדים מעכברים עם (איור 1 ו <s...

המטרה של פרוטוקול זה היא לבודד את התאים המונונרורים השוכנים בתוך המעי הגס של הנקודתיים על ידי העיכול אנזימטית של הרקמה באמצעות קולגן. פרוטוקול זה מאפשר בידוד יעיל של תאים מוניוצלולים וכתוצאה מכך השעיית תא בודד אשר בתורו יכול לשמש עבור immunophenotyping קלדה חזקה.

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous ...

בידוד בניתוח פנוטיפי של תאים חיסוניים מהמעי באמצעות פרוטוקול זה הוכיחו את עצמם ישימים להבנת GI והפרעות דלקתיות מערכתיות. שיטה זו מבודדת מספר משמעותי של תאים חד-גרעיניים בני קיימא על ידי מזעור פסולת מזהמת המאפשרת פנוטיפים חיסוניים עוקבים על ידי האטומיסטריה של פלר או שיטות אחרות. כמו המעי הוא אתר היעד העיקרי של דלקת במחלות רבות, פרוטוקול זה עשוי להיות שימושי לחקר אוכלוסיות החיסון במעיים במודלים העכבר של סרטן, אלרגיה, השתלה, אוטואימוניות.כדי לייעל את התשואה והיעילות של פרוטוקול זה, מומלץ להכין מראש פתרונות וחומרים מרכזיים. לאחר המתת לחץ הפוך את העכבר עושה חתך קו האמצע אנכי, להשתמש מספריים ניתוח עדין כדי לפתוח את peritoneum. באמצעות מדפים, להעביר את המעי הדק לצד אחד ולחשוף את המעי הגס היורד.משוך כלפי מעלה מעט על המעי הגס היורד כדי לחשוף באופן מקסימלי את החלק רקטלי של המעי הגס. לאחר מכן, חותכים את פי הטבעת הדיסטלי עמוק באגן וחותכים את המעי הגס כולו כיחידה אחת מהפי הטבעת הדיסטלית לכסה ה- cecal. ראשית, מניחים את המעי הגס על מגבת נייר לחה ולהשתמש בקצה הקהה של זוג מספריים או מטחנים כדי להחיל לחץ קל על דופן המעי ולחלץ את הצואה מוצק.לאחר מכן, מניחים את המעי הגס בצלחת פטרי ולהשתמש מזרק 10 מיליליטר עם מחט 18-מד קהה מלא כדי לשטוף את המעיים עם 10 מיליליטר של חיץ המעי הגס צונן. מניחים את המעי הגס בצלחת פטרי מלא 5-10 מיליליטר של חיץ המעי הגס צונן להתסיס באופן ידני כדי לשטוף את התוכן המעי הגס הנותר. חזור על שטיפה זו 2-3 פעמים, באמצעות צלחת פטרי חדשה המכילה חיץ טרי לכל שטיפה.לאחר מכן, מעבירים את המעי הגס לצלחת פטרי חדשה המכילה חיץ מעי גס צונן טרי. חותכים את המעי הגס אורך מקצה רקטלי שרירי יותר שלה המעי הגס proximal, כדי ליצור חתיכת המעי הגס פתוח מלבני יחיד. משליכים את החציון בצלחת ומחליפים אותו במאגר המעי הגס הצונן והנקי.מניחים את רקמת המעי הגס המלבנית על מגבת נייר כי הוא לח עם חיץ המעי הגס לחתוך אותו על ידי חיתוך אופקי ולאחר מכן לתוך שברים קטנים. השתמש ממטרות בסדר כדי לאסוף את שברי המעי הגס לתוך צינור חרוט פוליפרופילן 50 מיליליטר המכיל 20 מיליליטר של חיץ המעי הגס צונן. לאחר מכן, לשטוף את השברים על ידי מערבולת נמרצת את הצינור במשך 30 שניות.לאחר הכביסה, תן שברי הרקמה להתיישב לתחתית הצינור לפני decanting או ואקום שאפת supernatant, הקפד להימנע לאבד שברי רקמות, לחזור על כל תהליך לשטוף את כל זה 3 פעמים באמצעות חיץ המעי הגס טרי עבור כל לשטוף. כדי להתחיל, להוסיף 20 מיליליטר של מאגר עיכול קולגן לצינור המכיל את שברי המעי הגס שטף. לאטום את הצינור ולמקום אותו שייקר מסלולית ב 37 מעלות צלזיוס עם קצב סיבוב של 2 פעמים G במשך 60 דקות.ודא שברי הרקמה נמצאים בתנועה מתמדת במהלך תסיסה. ראשית, יוצקים 5 מיליליטר של מדיה הפרדה מבוססת סיליקה 66% לכל אחד מ-3 צינורות פוליפרופילן נפרדים של 15 מיליליטר. לאחר מכן, השתמש פיפטה סרולוגית 25 מיליליטר כדי לאסוף רק את supernatant מ קולאגנס Digestion 1.סנן את העל-טבעי דרך מסננת תאי בד סינון ירודה של 40 מיקרוליטר שהונחה בתוך צינור חרוט פוליפרופילן נקי של 50 מיליליטר. ממלאים את הצינור לחלוטין עם חיץ המעי הגס צונן כדי להתרווה את חיץ העיכול קולגן. ואז לסובב את התאים, שאף את העל-טבעי, ושמור את גלולת הקרח על הקרח.המשך לבצע עיכול קולגנס 2 כמפורט בפרוטוקול הטקסט. לאחר עיכול קולגנס 2 הושלמה, לשטוף את שברי הרקמה במרץ קדימה ואחורה בין הצינור מזרק 10 מיליליטר דרך מחט קצה קהה 18-מד. חזור על סומק זה לפחות 7-8 מעברים, ממשיך עד שברי רקמה ברוטו או debri גלויים.לאחר מכן, להעביר את ההשעיה פירוק רקמות דרך 40 מיקרומטר סינון לקוי בד תא מסננת להציב לתוך צינור פוליפרופילן נקי 50 מיליליטר. ממלאים את הצינור לשפה עם חיץ המעי הגס מצונן כדי להתרווה על העיכול והצנטריפוגה ב 800 פעמים G ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. להשליך את supernatant באמצעות שאיפה ואקום ולמשוך את גלולה מושעה מחדש מ Collagenase Digestion 1 לצינור המתאים שלה.לאחר מכן, להשעות כל גלולה ב 24 מיליליטר של 44%סיליקה מבוסס צפיפות הפרדה מדיה לכל המעי הגס. השתמשו בפיפסה סרולוגית של 10 מיליליטר כדי לשכב באיטיות 8 מיליליטר של מדיה זו על כל אחד מ-3 הצינורות המכילים מדיית הפרדה מבוססת סיליקה של 66%. בזהירות לאזן את הצינורות בתוך דליי צנטריפוגה באמצעות סולם משקל או איזון.צנטריפוגה ב 859 פעמים G ב 20 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות ללא הפסקה. אפשר למוטות לבוא לנוח לפני הסרת צינורות, דואג לא לשבש את התאים בממשק הדרגתי. תחילה, דמיין את ממשק המילוי ההדרגתי ליד סימן 5 מיליליטר, שבו בדרך כלל קיימת רצועה לבנה בעובי 1-2 מיליליטר.ואקום שאף והשליך את 7 המיליליטרים העליונים של המילוי ההדרגתי כדי לאפשר גישה קלה יותר של פיפטה לממשק. באמצעות יניקה ידנית רציפה ותנופת פרק כף יד מסתובבת יציבה, לאסוף את שכבת הממשק של תאים. לאסוף עד הממשק בין שני מעברי צבע ברור שביר ולהעביר את הממשק חדש 50 מיליליטר פוליפרופילן צינור חרוט.לאחר מכן, הוסף חיץ FACS לאמבטיה זו עד ההשעיה הכוללת מגיעה 50 מיליליטר. צנטריפוגה ב 800 פעמים G ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. לאחר מכן, שאף את העל-טבעי באמצעות שאיפת ואקום והשהה מחדש את גלולת הכדור במיליליטר אחד של חיץ FACS.ההליך המתואר בסרטון זה יכול לשמש לבידוד תאים חד-גרעיניים מהמעי הגס או, עם שינויים, מהמעי הדק. בנוסף, ניתוח ציטומטריה ונתונים מבוצע כדי להשוות את שברי לימפוציטים אפופוטוטיים ונמקים / מתים בעת שימוש או קולגנס E או D לבידוד, עם שלנו ללא טיפול DNAse 1. בעקבות Annexin 5 וכתמי צבע כחול מתים לתיקון על מתלים תא יחיד בעקבות כל בידוד, קולגנס E ללא DNAse הראה אחוז גבוה משמעותית של תאים חיים לאחר בידוד בהשוואה קולגנס D ללא DNAse.גם בהשוואה לקולגנס עם DNAse. בנוסף, זיהינו תאים נמקיים באחוז חציוני של 41.0% בקבוצת קולגנס E לעומת 90.0% בקבוצת קולגנס D. 75.9% בקבוצת קולגנס E DNAse ו-80.3% בקבוצת קולגנס D DNAse.ציטומטריית זרימה רב-פרימטרית מוחלת לאחר מכן על MNC המבודד מעכברי נמען CD45.2 Valve-C ביום 7 לאחר קבלת BMT או דגמי BMT אלוגניים או סינגניים. המספרים המוחלטים הממוצעים של תאי T חיוביים ו- CD8 חיוביים של תורם CD8 שחולצו מנקודתיים של נמען BMT מחושבים ומוושוים. אז זה יכול להיות חשוב לזהות ו / או לכמת אוכלוסיות נדירות של תאי החיסון במודלים עכבר כזה.ערכות משנה נדירות, כולל תאים רגולטוריים T חיוביים FOX-P3 נגזרים תורמים מוערכים הן במודלים סינגניים והן במודלים של BMT אלוגניים ואלוגניים. באמצעות שיטה זו, ניתן לנתח אפילו קבוצות משנה נדירות, כגון רגולציית T המעי הגס הנגזרת על-ידי התורם, לאחר BMT. יש לציין כי קולגנס E פעיל ב 37 מעלות צלזיוס.אז כל פתרונות קולגנס צריך להיות מחומם מראש לפעילות קולגן נאותה ומרווה ביסודיות כדי לסיים את הפעילות. פרוטוקול זה מאפשר מספר רב של תאים חד-גרעיניים שניתן להשתמש בהם לאפיון עוקב על ידי ציטומטריית פלר, טכניקות ביולוגיה מולקולרית, מיקרוסקופיה, תרבות ואתר של, בין היתר. פרוטוקול זה סיפק הערכה מהימנה של דלקת במעי הגס של עכברים ניסיוניים לעומת מבוקרים במודל השתלת מח עצם.ובכך להקל על גילוי מנגנונים חיסוניים רגולטוריים חדשניים של סובלנות להשתלה. קולגנס מ Clostridium Istoliticum הוא רהוט כי יש לטפל עם טכניקות בטיחות במעבדה. זה מהווה סכנה בריאותית כאשר בשאיפה עלול לגרום לגירוי בעור ובעין.

isolation-lamina-propria-mononuclear-cells-from-murine-colon-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

דרך יעילה לבודד את הלימפוציטים מדרכי מין עכבר מתוארת. שיטה זו מנצלת עיכול אנזים והפרדת השיפוע Percoll לאפשר בידוד יעיל. טכניקה זו היא גם להתאמה לשימוש במינים...

בידוד של לימפוציטים מעכבר גניטלי חוברות רירית

בסרטון זה, אנו מדגימים את הבידוד של תאים חד-גרעיניים lamina propria מרקמת המעי הגס על ידי עיכול אנזימטי באמצעות collagenase E והפרדת צפיפות מבוססת סיליקה הפרדת מדיה הדרגתית. התאים החד-גרעיניים המבודדים יכולים לשמש לניתוח במורד הזרם.

Lamina Propria בידוד תאים חד-גרעיניים: טכניקת צנטריפוגה הדרגתית מבוססת סיליקה להשגת תאים חד-גרעיניים מהמעי הגס של מורין

Myofibroblast הוא תא סטרומה השפעה של מערכת העיכול המווסת את התהליכים פיסיולוגיים חשובים במדינות שניהם נורמליות ומחלה. אנו מתארים טכניקה המאפשרת בידוד של myofibroblasts העיקרי משני בעכבר ורקמת מעי גס אנושית, אשר יכול להיות מנוצל לניסויים במבחנה.

בידוד של ראשוני myofibroblasts מעכבר ורקמות מעי גס אנושיים

כאן אנו מתארים שיטה פשוטה לבידוד של תאי פני השטח של המעי הגס של עכברים מובחנים מרחבית מתאי בסיס הקריפטה הבסיסיים.

Cryosectioning שיטה לMicrodissection של Murine גס רירית

כאן נתאר פרוטוקול מפורט על הבידוד של לימפוציטים האתרים אינדוקטיבית כולל בלוטות לימפה mesenteric המנקזים ותיקונים של פייה רקמת הלימפה הקשורים הבטן, ואת האתרים אפקטור כולל את פרופריה. מוסקולריס ו אפיתל המעי של המערכת החיסונית קטנים במעיים.

לימפוציטים בידוד מן העכבר קטן המעי המערכת החיסונית

הפרוטוקול המתואר כאן משתמשת בגישה photolabeling בעכברים היילוד במיוחד לזהות תאים חיסוניים להגר מן המעי הגס לאתרים במיוחד מעיים. אסטרטגיה זו יהיה מועיל ללמוד אינטראקציות מארח-microbiome בחיים מוקדם.

אין ויוו Photolabeling של תאים במעי הגס כדי להעריך את פוטנציאל הנדידה של תאים Hematopoietic בעכברים Neonatal

כאן, אנו מציגים פרוטוקול התרבות האנושית enteroid או monolayers colonoid שיש להם פונקציה נפגע המחסום ללמוד אינטראקציות אפיתל-microbiota מארח ברמה התאית וביוכימי.

Monolayers Colonoid האדם ללמוד אינטראקציות בין גורמי מחלה, Commensals אפיתל המעי מארח

במחקר זה, אנו מתארים הליך מפורט של פיברוזיס בתיווך מעיים של TNBS, אשר מציג הפתופסולוגיה המקבילה ל-פיברוזיס של קרוהן. אנו גם דנים גישה זו לאור של rapamycin הקלה השפעות מעכבות על סיסטיק מעיים.

תובנה מכניסטית לתוך פיתוח של מעיים TNBS-תיווך פיברוזיס והערכת השפעות העכבות של Rapamycin

בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד ליצור מונוליירים אפיתל ראשוניים של אפיתל ישירות מקריפטות מעיים. אנו מספקים גישות ניסיוניות כדי ליצור monolayers confluent על מסננים חדירים, monolayers confluent לריפוי פצעי גירוד ומחקרים ביוכימיים, ו monolayers דליל ונוח לניתוח כשל חיסוני.

דור של מונוליירים אפיתל המעי הגס הראשי מורין מקריפטות מעיים

כאן אנו מתארים ומדגימים פרוטוקול לבידוד תאי אנדותל סינוסואידליים ראשוניים בכבד עכבר (LSEC). הפרוטוקול מבוסס על זלוף קולגן בכבד, טיהור תאים לא-פרנצ'ימליים על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה ובחירת חרוזים מגנטיים CD146. אנו גם מנצלים את הפנוטיפ ומאפיינים את ה-LSECs המבודדים הללו באמצעות ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק.

בידוד ואפיון של תאי אנדותל סינוסואידליים ראשוניים בכבד של עכבר

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד mesenchyme המעי murine, כולל telocytes. אלה יכולים לשמש למספר יישומים, כגון תרבות משותפת עם עכבר או אורגנואידים שמקורם בבני אדם, כדי לתמוך בצמיחה ולשקף טוב יותר את המצב ברקמה המקורית.

בידוד של מזנכימה במעי מורין וכתוצאה מכך תשואה גבוהה של טלוציטים

למדו בידוד תאים מונונוקלאריים מלמינה פרופריה של קולון באמצעות עיכול אנזימטי עם קולגנאז. שיטה זו מאפשרת אימונופנוטיפינג מדויק של אוכלוסיות חיסון מעיים במודלים של דלקת וסרטן.

בידוד של לינה קינאין תאים מונמוננקה מקולון מורלין באמצעות קולגנאז

גלה סרטונים נוספים