הכנה לדגימת פלזמה לספקטרומטר מסה באמצעות תחנת עבודה אוטומטית

זרימת עבודה אוטומטית זו מספקת עיכול אנזימטי עקבי של חלבונים עם יכולת שכפול ותפוקה מעולות. זה משפר את הדיוק והמהימנות של גילוי סמן ביולוגי, אימות, ויישום קליני על ידי ספקטרומטריית מסה. היתרון של טכנולוגיה זו הוא שניתן להשלים את זרימת העבודה כולה עבור 96 דגימות תוך כחמש שעות עם קורות חיים תוך-חקירה ובין-תזה של פחות מ-20% עבור רוב החלבונים.

הכנה מדויקת זו של דגימת תפוקה גבוהה מאפשרת לנו לחקור פרוטאומים של מחלות של רקמות או ביופלואידים בקנה מידה גדול יותר. בנוסף, זרימת העבודה האוטומטית של הכנת מדגם פרוטומי מספקת בסיס איתן לתוכן גבוה וניתוח פרוטומי כמותי. הדגמת ההליך תהיה ד"ר קין פו, מנהל מרכז תפוקה גבוהה בסידר סיני ומר קייסי ג'ונסון, עמית מחקר מהמעבדה שלי.

לפני תחילת הניתוח, להוסיף חמישה microliters של פלזמה אנושית בריאה בריכה לתוך 96 עגול עמוק גם פרופילן צלחת. לאחר שכל הדגימות נטענו, פתח את תוכנת התקן המטפל בנוזלים ותחת לשונית השיטה, בחר בבית את כל הצירים כדי לכוון את המטפל האוטומטי בנוזלים. ודא שכל מזרקי תחנת העבודה אינם מכילים בועות אוויר גלויות ופתיח שיטה חדשה ולחץ על הפעל כדי ליזום את השיטה.

הזינו True להזנת ערך לשימוש עבור בקשה לדגימה אוטומטית כדי להכין לוח דגימה אוטומטית בסוף השיטה ולחצו על הלחצן 'אשר'. הזן ערך בהזנת ערך לשימוש עבור שורת הפקודה של העמודה הראשונה ולחץ על אישור. הזינו 12 בהזנת ערך לשימוש עבור שורת הפקודה האחרונה ולחצו על הלחצן 'אשר'. אם נעשה שימוש בצלחת לדוגמה עם אמצעי אחסון לדוגמה של לפחות 20 מיקרוליטרים, הזן true בהזנת ערך לשימוש עבור שורת הפקודה לדוגמה של הלוח ולחץ על אישור. בצע את ההוראות בחלון התקנת כלי Labware מודרכים ולחץ על המשך. טען את חברי ההנהלה המתאימים לתוך הבאר המתאימה ולחץ על הבא. לחץ שוב על הבא כדי לפרוס את סיפון המטפל בנוזלים האוטומטי כפי שמודגם כולל לוחות ריאגנט, תגובה, מדגם ודגימה אוטומטית, שש בארות 90 תיבות קצה מיקרוליטר, תיבת קצה ריקה של 90 מיקרוליטר ותיבת קצה מלאה של 230 מיקרוליטר.

לאחר מכן לחץ על סיום כדי להתחיל את פעולת השירות. בהמשך לאחר הנחיה צנטריפוגה, לאחזר את צלחת התגובה ולהנחות את הצלחת לתוך הצנטריפוגה. בסוף הצנטריפוגה, להחזיר את צלחת התגובה למיקום שלה בתוך המטפל בנוזל אוטומטי ולחץ על המשך.

עבור כרומטוגרפיה נוזלית וניתוח ספקטרומטריית מסת טנדם, פתור את הפפטידים ב C18 2.1 על ידי 100 מילימטר 3.5 מיקרומטר עמודה על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה בלחץ גבוה עם קצב זרימה של 250 microliters לדקה ונותחו בשורה על ספקטרומטר מסה מרובע משולש. חמש דקות לאחר הטעינה, יש לצייד את העמודה בתמיסת B של 5%buffer ולהטפס את הפפטידים עם מעבר צבע ליניארי של 5-35% של מאגר B במשך 30 דקות. בסוף האלוטיון, שטף את העמודה עם 98%buffer B למשך 10 דקות ולאחר מכן שטיפה של חמש דקות עם 5%buffer B לפני טעינת הדגימה הבאה.

עבור ההסחה המקוונת, השתמש בשסתום מיתוג דו-פאזי כדי להסיט את הפסולת שלאחר העמודה לפסולת לפני שהיא נכנסת למקור היונים. כאשר כל הדגימות כבר eluted, נתוני ניטור תגובה מרובים ניתן לעבד. בניתוח מייצג זה, שלושה פפטידים בטא-גל ושני פפטידים אלבומין היו במעקב של בטא-גל ממוסדד וחלבוני אלבומין פלזמה מעובדים.

הדיוק של זרימת העבודה האוטומטית להכנת מדגם חושב כאחוז מקדם השונות של זרימת העבודה הכוללת של ניטור התגובה שנבחרה פרוטומית מינוס מקדם האחוזים של השונות של ספקטרומטריית מסת הדו-מס של הכרומטוגרפיה הנוזלית. כצפוי, עוצמת אות טובה נצפתה הן עבור אלבומין סרום אנושי והן עבור חלבוני בטא-גל. כדי לנטר את הדיוק של צעדי העברת הנוזל, ניתן לסמן איזוטופ יציב בתקני פפטיד עבור אלבומין סרום אנושי אנדוגני וחלבון בטא-גל אקסוגני בשלבי העברה עצמאיים של רייג'נט.

כדי לאמת את זרימת העבודה האוטומטית של הכנת מדגם פרוטומי, מקדם תוך יומי של ערכי שונות חושב מ- 21 בארות שהוכנו באותו יום. מקדם השונות התוך יומי הממוצע עבור 40 חלבונים נע בין 4-20%כדי להעריך את אפקט הקצה של זרימת העבודה האוטומטית המבוססת על לוח, ניתן לחשב את מקדם אחוז השונות מ בארות ספציפיות בתוך עמודות ושורות ייעודיות. בניסוי מייצג זה, עוצמת האותות של ניטור התגובות המרובים הייתה דומה בכל תצורות העמודות וה השורות עם מקדם האחוזים של השונות הנע בין 3-22%, השלבים החשובים ביותר הם הוספת מדגם נכון בהתאם למפת הלוחות הרצויה של 96 באר והגדרת לוחית ריאגנט נכונה בהתאם להוראת התוכנה.

שיטת הכנה אוטומטית זו של מדגם פרוטומי מאפשרת לחוקרים לאסוף נתוני פרוטומיקה אמינים וכמותיים בקנה מידה גדול.