ניתוח נגעים השוואתית באמצעות גישה ממוקדת רצף

הפרוטוקול שלנו מאפשר ללכוד את הקשר הגנטי בין נגעים ראשוניים וגטוסטטיים באמצעות זיהוי שינויים מולקולריים המעורבים בהתקדמות המחלה. השיטה שלנו מספקת את ההזדמנות לחקור את הקשורות הגנטית בדגימה קלינית עם רגישות גבוהה וספציפיות. זאת בשל שילוב של ניתוח מולקולרי והיסטופתולוגי.

להערכת הטרוגניות תוך-טמור בתחום חקר הסרטן יש חשיבות עליונה בתכנון אסטרטגיות אנטי-גידול יעילות, ושיטתנו ישימה באופן נרחב לסוגי גידולים מוצקים רבים. לאחר הכנת וכמות ספריות העניין, מדללים כל ספרייה לריכוז של 100 פיקומולרים במים נטולי גרעין ומשלבים 10 מיקרוליטרים של כל ספרייה מדוללת להפעלה אחת בצינור אחד. לאחר מכן מערבבים את הספריות המפולגות על ידי צינורות.

כדי ליזום הפעלת רצף, פתח תחילה את דפדפן Torrent במחשב המחובר למערכת הריצוף. תכנן הפעלה חדשה באמצעות התבנית הגנרית עבור היישום הנבחר ותחת הכרטיסיה ערכות בחר מערכת פרוטון יון או מערכת יון ג'ין Studio S5. בחרו בשבב המתאים מהתפריט הנפתח של סוג השבב ובחרו בערכת הספרייה Ion AmpliSeq 2.0 מהרשימה הנפתחת של ערכת הספרייה.

בחר בלחצן יון שף עבור ערכת התבנית ובחר את ערכת השף המתאימה מהרשימה הנפתחת של ערכת התבניות. בחרו בערכת רצף המתאימה מהתפריט הנפתח של ערכת רצף ובחרו 'יון אקספרס' מהרשימה הנפתחת 'ערכת ברקוד'. תחת לשונית התוסף, בחר את תוסף ניתוח הכיסוי.

תחת הכרטיסיה תוכנית, בחר את הגנום GRCH37HG19 מהרשימה הנפתחת של ספריית הייחוס. מהרשימה הנפתחת של אזורי היעד, בחרו בחלונית המתאימה לרצף. לאחר מכן הגדר את מספר הברקודים שיש לרצף והגדר את שם הברקוד ואת השם לדוגמה עבור כל ספריה.

עבור דילול ספריות בריכה, לדלל את ספריית המלאי עם מים ללא גרעין לריכוז 25 picomolar עבור שבב פרוטון יון פיפטה 50 microliters של כל ספרייה מדוללת לתחתית צינור מדגם הספרייה המתאים. טען צינורות מדגם המכילים את הספריות המדוללים המדוללים אל מערכת ההכנה לספרייה והתחל את הגברה שיבוט. עבור רצף הדור הבא, בצע את ההוראות המופיעות על המסך כדי לאתחל את הכלי.

כאשר הגברה שיבוט הוא סיים, לפתוח את דלת המכשיר יון שף, ולאחר מכן לפתוח את המכסה של צנטריפוגה טעינת שבב ולהסיר את שני השבבים ממערכת הכנת הספרייה. מניחים את השבבים במיכלי אחסון שבבים נפרדים ומטענים את אחד השבבים בתא השבבים במכשיר. לאחר מכן סגור את מכסה תא השבבים והתחל את רצף.

לניתוח מוטציה, פתח את תוסף ניתוח הכיסוי ולהשתמש בתפוקת ניתוח הכיסוי כדי לאמת את עומק הכיסוי ואחידות. השתמש בתוסף Torrent Variant Caller כדי לבצע את הקריאה משתנה בחירת קו נבט או זרימת עבודה סומטית בהתאם לצורך. לאחר מכן הורידו וריאנטים מסוננים לקבצי תבנית שיחה ולהשתמש בתוכנת מנבא אפקטי הווריאציה במסד הנתונים NCBI RefSeq כדי להוסיף ביאורים לגרסאות.

כדי להעריך את וריאציות מספר עותק, להשתמש תוסף uploader כתב יון לטעון את נתוני רצף לתוך תוכנת כתב יון ולהשתמש בזרימת העבודה מקיפה סרטן פאנל סרטן נורמלי זוג כדי לנתח את הנתונים. סנן ידנית את המוטציות ואת וריאציות מספר ההעתקה בהתבסס על הציונים שהוקצו על-ידי התוכנה ואמת את הווריאציות באופן חזותי עם מציג הגנומיקה האינטגרטיבית. לאחר מכן, בדוק באופן חזותי את היישור עבור קריאות יוצאות דופן שעשויות ליצור שיחות חפץ ולבדוק את הכיסוי המנורמל עבור כל האמפיקלונים בגן נתון מול הכיסוי המנורמל של התוכנית הבסיסית כדי לאמת את וריאציות מספר ההעתקה.

עבור כל מקרה, אינדקס קריאות המוטציה מן רצף של רקמה נורמלית או דם או גידול ראשוני או גרורות. סמן כקו נבט והשליך שיחות הניכרות גם מנתוני ריצוף הדנ"א של קו הנבט. דגל כמו שיבוט או מייסד המוטציות המשותפות בין כל נגעים של חולה נתון.

לאחר מכן דגל כתת-קטגורי או התקדמות המוטציות שזוהו בחלק מהנגעים אך לא בכל הנגעים של מטופל נתון. בניסוי מייצג זה, רצף רב-נגעים של חמישה מקרי ניאופלזם pseudopapillary מוצקים המכוונים לרצפי הקידוד של 409 גנים הקשורים לסרטן זיהו בסך הכל 27 מוטציות סומטיות בשמונה גנים. מוטציות הוגדרו כמייסד או שיבוט כאשר חולקים בין כל הנגעים של מטופל נתון ומתקדם או subclonal כאשר זוהה בחלק אבל לא כל הנגעים של חולה נתון.

באופן עקבי, כתמים אימונוהיסטוכימיים עבור בטא-קטנין ו KMD6A היה הומוגני בין נגעים מגוונים של מקרים עם מוטציות של הגנים המתאימים. הכתמים המתונים עבור KMD6A בדגימות שעברו מוטציה מצביעים על כך שהתניה גנטית עשויה לשנות את הפונקציה ולא את ביטוי החלבון. KMD6A אובדן תפקוד בגידולים בלבלב קשורה עם ויסות עד של סמן היפוקסיה GLUT-1.

ובהתאם לכך, GLUT-1 התבטא במקרים של מוטציות KMD6A. אימונוהיסטוכימיה עבור BAP1 ו- TP53 אישרה כי מוטציות בגנים אלה היו תת-קטגוריות. בקאריוטיפ וירטואלי זה של מקרה מייצג המציג את המיקום, הקרבה והסטטוס של מספר העתקה של גנים שהשתנו, ניתוח וריאציית מספר ההעתקה באמצעות נתוני רצף חשף שינויים בכל הדגימות שנותחו.

ובניגוד למוטציות נקודתיות, רוב שינויים בווריאציות של מספר העתקה היו תת-קטגוריים. אימות ואינדקס של מוטציות וריאציה מספר עותק ושימוש השוואת DNA נורמלי הגידול חשובים למניעת הדור של שיחות חפץ שיכול לפסול את התוצאות. הליך זה יכול להיות מיושם גם על מחקרי ריצוף גנום שלמים שמטרתם לחקור את הגנום כולו לזיהוי מוטציה בין נגע של סוגי גידולים מוצקים שונים.

בתחום חקר הסרטן, טכניקות אלה הן כלים קריטיים להבנת הביולוגיה של מחלות עם השלכות קליניות חשובות שמטרתן לעצב טיפולים ממוקדים מותאמים אישית ויעילים.