Name: אינטרטל הדמיה של לימפוציטים תוך-אפיתל במעי קטן מוריין (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: חקור הדמיה תוך-חיים של לימפוציטים תוך-אפיתל במעי קטן מוריין באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר תאים חיים עד 4 שעות לחקר אינטראקציות חיסון-אפיתל.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכת על ידי NIH R21 AI143892, ניו ג'רזי קרן הבריאות גרנט, בוש ביורפואי מענק (קל). אנו מודים למדלן הו על עזרתה בעריכת כתב היד והענקת הנתונים המוצגים בתוצאות הנציגים.

כל המחקרים נערכו באגודה של הערכה והסמכה של מעבדה בעלי חיים טיפול (AALAC)-מתקן מוכר על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי הספר הרפואי של רטגרס ניו ג'רזי רפואה השוואתית משאבים.
1. הכנת העכבר
הערה: ההליך הבא, כולל הכנה לבעלי חיים וניתוחים, ייקח 30 – 40 דקות לפני הניתוח, הפעל את המיקרוסקופ וחמם את החממה המצורפת במיקרוסקופ עד 37 ° c.
<ol><li>בצע ניסויים ב-8 – 10 שבועות עכברים מבית הספר על רקע C57BL/6, אשר התקבלו מ ברנרד Malissen (INSERM, פריז, צרפת). על פי ההליך המאושר IACUC, מורדם העכבר על ידי הזרקת כיתה של קטמין (120 מ"ג/ק"ג) ו xylazine (10 מ"ג/ק"ג) מבוסס על משקל החיה. הערכת רמת ההרדמה בקצב נשימה (55 – 65 נשימות לדקה)21, צביטה בבוהן וpalpebral רפלקס.</li>
	<li>לאחר הרדמה המטוס הכירורגי הוא הגיע, לאבטח את הרגליים האחוריות של העכבר באמצעות קלטת למשטח חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף, אשר ניתן לפקח על ידי מד חום פי הטבעת. אם יש סימנים כי ההרדמה היא לובש (למשל, קצב נשימה מוגבר, מהבהב ו/או שריר העין תגובה מרעידה palpebral רפלקס), מחדש לניהול 50 μL של קטמין/xylazine בכל פעם עד העכבר הוא הרגעה לחלוטין.</li>
	<li>להכין את הצבע הגרעיני על ידי דילול 50 μL של Hoechst 33342 (10 מ"ג/mL) עם 315 μL של 0.9% תמיסת מלח; הריכוז הסופי הוא 37.5 מ"ג/ק"ג מבוסס על משקל העכבר (200 כמות משוער μL). ברגע העכבר מורדם, לאט להזריק הופסט באמצעות מזרק טוברקולין דרך סינוס ורידי רטרו מסלולית. הערה: המתן 1 – 2 דקות לפני שתמשיך לשלב הבא כדי לאפשר לעכבר להפוך את השינוי במחזור הנפח הבאים רטרו מסלולית הזרקה.</li>
	<li>מניחים כמות קטנה של חומר סיכה על העיניים כדי למנוע מהם להתייבש.</li>
</ol>2. כירורגיה של העכבר: לפרוטומיה לחשוף רירית המעיים
<ol><li>לעשות חתך 2 ס מ אנכי דרך העור ואת צפק לאורך קו האמצע של הבטן התחתונה כדי להחצין את האזור של המעי להיות בתמונה.</li>
	<li>באמצעות מלקחיים זוויתי, בזהירות למשוך את מעי מתוך חלל הצפק ולזהות את האזור של המעי הדק כדי להיות בתמונה. היזהרו לא לקרוע כלי דם מצע במהלך תהליך זה. כדי למזער נזק פוטנציאלי או דימום, להימנע לתפוס או צובט את המעי עם מלקחיים.</li>
	<li>אתר אזור מתאים של המעי הדק (2 – 3 ס מ) עבור דימות המכיל תוכן מינימלי צואה. החזר בזהירות את המעי הגס ואת המעיים הקטנים הנותרים לחלל הצפק, תוך השארת קטע הריבית מוחלק. הערה: הימנע מלדרוך על המעי הסטום או לשבש את היום במהלך שלב זה.</li>
	<li>מניחים שני זוגות של מלקחיים משני צדדיו של המצע המעי הבסיסית בין כלי הדם, ולשפשף בעדינות את קצות המלקחיים יחד כדי ליצור חור בקרום (איור 1)22. זה יאפשר המחט לעבור את המצע המעי כאשר סוגרים את החלל הצפק מתחת למעיים.</li>
	<li>לסגור את החתך תוך שמירה על לולאה של המעי השפעה. באמצעות מלקחיים זוויתי מעוקל, המחט נקודת להתחדד מוצמד 5 ס מ תפר, לחדור צד אחד של צפק, לעבור דרך החור עשה בשלב הקודם, ומעלה דרך הצד השני של רירית הצפק. מניחים תפר אחד למעלה, ועוד. קרוב לתחתית החתך הערה: הימנע מפגיעה בכלי האורך במהלך שלב זה.</li>
	<li>חזרו על תהליך זה כדי לסגור את העור מתחת לולאת המעי, על ידי הצבת תפר אחד באמצע החתך, בין התפרים הקודמים בצפק הבסיסית. הערה: חשוב רק להחצין את האזור שהוא ליצירת תמונה; פעולה זו תפחית את התנועה החיצוני במהלך ההדמיה. אל תדאג להמנע מקשירת. העורקים המסטרמיים</li>
	<li>השתמשו בחשמלית כדי ליצור קו ניקוב לאורך הגבול האנטי-מסטראלי. מיד לאחר הצרוב, להחיל כמה טיפות מים על פני השטח של המעי כדי למנוע נזק נוסף רקמות המושרה. אבן חשופה בעלת מגבונים להסרת מים שיורית.</li>
	<li>חותכים חתך אופקי קטן בקצה המרוחק של הרקמה הכאוגית באמצעות מספריים vannas ולהמשיך לחתוך לאורך הקו הצרוב לקראת הקצה הקרוב ביותר של פלח הרקמה המועבר (כ 1.5 ס מ אורך) כדי לחשוף את הרירית שטח. הערה: במקרה הצורך, השתמש מלקחיים כדי להסיר בעדינות את כל התוכן העודף בצואה שנותר על פני השטח החשוף של רירית.</li>
	<li>לכסות את הבטן של העכבר עם קינגב לחות כדי למנוע את רקמת להיות מיובש. להעביר את העכבר למיקרוסקופ בתוך כלי מכוסה.</li>
</ol>3. רכישת תמונה על ידי ספינינג מיקרוסקופיה דיסק מוקד
<ol><li>פיפטה 150 μL של 1 μM AlexaFluor 633 ב HBSS על שמיכות זכוכית התחתון של צלחת 35 mm. הצב את העכבר כך שפני השטח הפתוחים של רירית מגעים ישירות עם שובר הכיסויים.</li>
	<li>להטות את הראש של המיקרוסקופ לאחור ולמקם את העכבר על הצלחת שמיכות על הבמה הדמיה בחממה טרום מחומם. לחלופין, לכסות את העכבר על ידי שמיכה חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף.</li>
	<li>הפעל תוכנה לדימות. את עוצמת עירור ואת זמן החשיפה עבור כל לייזר לא יעלה על 10-15 mW או 120 – 150 ms, בהתאמה, כדי למנוע הלבנת ולמזער את המרווח בין נקודות זמן. כוונן את ממוצע המסגרת ל-"2" והפעל את פונקציית הרווח האלקטרו-ממדי כדי להפחית את רעשי הרקע. בחר בכיול האובייקטיבי 63 x כדי להבטיח את המדידה הנכונה של גודל הפיקסל. הערה: ההגדרות המפורטות לעיל אמורות לספק הפניה ראשונית, אך ישתנו בהתאם לתצורות המיקרוסקופ הבודדות.</li>
	<li>שימוש 405 ננומטר לייזר ומטרת האוויר 20x, להמחיש את הגרעינים כדי לאתר שדה של villi כי חוסר תנועה מורגש או להיסחף בעין. הימנע מאזורים של התנועה העובדתית עקב נשימה, פריסטלזיס או פעימות לב.</li>
	<li>באמצעות הסריקה XY, להקליט את קואורדינטת XY של שדה העניין ולעבור את טבילה הגליצרול 63 x המטרה.</li>
	<li>ודא כי villi בשדה שנבחר הם יציבים על ידי רכישת תמונה חיה על ערוץ 405 ננומטר עד 1 דקות.</li>
	<li>בזמן הרכישה של תמונה חיה על הערוץ 405 ננומטר, להתאים את המוקד כדי למצוא את המטוס האורתוגונלי ממש מתחת לקצה הווילי. לרכוש Z-ערימות החל מתחת בדיוק מתחת האפיתל עצה villous למטה villous עד קשה לפתור את גרעיני, כ 15 – 20 יקרומטר, באמצעות צעד 1.5 יקרומטר. הערה: כאשר הדמיה עם שלושה ערוצים (405, 488, 640 nm) באמצעות זמני חשיפה שתוארו לעיל, ניתן לרכוש את כל שלושת הערוצים ברציפות בסביבות 20 s מרווחי.</li>
	<li>פתח את התוכנה במצב ניתוח, 3 – 5 דקות לאחר תחילת הרכישה, כדי לאשר את יציבות התמונה וγδ לתנועתיות אל-על. המשך לרכוש תמונות עבור 30 – 60 דקות עבור כל שדה של villi. שיא 2 – 3 שדות עבור כל עכבר. בזמן הדמיה, לפקח על העכבר כל 5 דקות. הערה: אם ההרדמה מתחיל להתפוגג, להשתמש מלקחיים כדי להדוף בעדינות את הצוואר של העכבר כדי לנהל 50 μL של קטמין/xylazine בכל פעם. המשיכו לנטר רמות הרדמה וניהול מחדש בעת הצורך.</li>
	<li>לא מומלץ לצלם עכבר יחיד למשך יותר מ 4 h. לאחר רכישת תמונה הושלמה, להקריב את העכברים על ידי פריקה צוואר הרחם ואחריו החזה הדו.</li>
</ol>4.4D ניתוח תמונות
<ol><li>ישירות לייבא קבצי הדמיה לתוכנת עיבוד 4D.</li>
	<li>צור משטחים בודדים עבור iels ולומן, ולאחר מכן עקוב אחר המשטחים לאורך זמן תוך שימוש בפרמטרים המתוארים בטבלה 1 כהפניה ראשונית. עבור IELs, אפשר מפוצל לגעת באובייקטים באמצעות קוטר נקודת הזרע המצוין.</li>
	<li>השתמש באלגוריתם המעקב האוטומטי כדי לקבוע את התנועתיות של אל. למרות שאלגוריתם המעקב מדויק יחסית, הכרחי לבדוק באופן חזותי מסלולים לכל אחד מאלה. אם מעקב אינו נכון, תקן אותו באמצעות הפקודה התנתק והתחבר תחת הכרטיסיה ערוך רצועות . </li>
	<li>כדי לקבוע את המרחק מכל אל-אל לומן, בחר את משטח לומן ובצע פונקציית שינוי מרחק בתפריט כלי . כשתתבקש, בחר מחוץ למשטח. לאחר החישוב, השינוי במרחק יוצג כערוץ ה -4.</li>
	<li>לסנן את העוצמה מינימום של הערוץ הרביעי כדי לבחור γδ iels כי הם בתוך המרחב התרבות לרוחב (LIS). ערך זה צריך להיות קרוב ל 15 μm, מבוסס על גובה של תא אפיתל טורי. האחוזים של סך γδ IELs בתוך טווח זה מדווחים כתדירות של IELs γδ ב-LIS.</li>
	<li>לניתוח נוסף, לייצא נתונים סטטיסטיים כולל: מהירות המסלול של אל-על, מסלול הזחה, מעקב אחר יושר ואורך המסלול. לחלופין, ניתוח נתונים באמצעות מודול התצפית. בהתאם לניסוי, השג מדדים נוספים מהנתונים הנרכשים, כולל זמן לשכון באינטראקציות LIS או אל-האפיתל.</li>
</ol>

<ol><li>Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+light+and+dark+sides+of+intestinal+intraepithelial+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (7), 445-456 (2011).</li>
<li>Hu, M. D., Edelblum, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sentinels+at+the+frontline%3A+the+role+of+intraepithelial+lymphocytes+in+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmacology+Reports%22%5BJournal%5D)">Sentinels at the frontline: the role of intraepithelial lymphocytes in inflammatory bowel disease.</a> Current Pharmacology Reports. 3 (6), 321-334 (2017).</li>
<li>Chen, Y., Chou, K., Fuchs, E., Havran, W. L., Boismenu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+of+the+intestinal+mucosa+by+intraepithelial+gamma+delta+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Protection of the intestinal mucosa by intraepithelial gamma delta T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (22), 14338-14343 (2002).</li>
<li>Swamy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+intraepithelial+lymphocyte+activation+promotes+innate+antiviral+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Intestinal intraepithelial lymphocyte activation promotes innate antiviral resistance.</a> Nature Communications. 6, 7090(2015).</li>
<li>Dalton, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraepithelial+gammadelta%2B+lymphocytes+maintain+the+integrity+of+intestinal+epithelial+tight+junctions+in+response+to+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Intraepithelial gammadelta+ lymphocytes maintain the integrity of intestinal epithelial tight junctions in response to infection.</a> Gastroenterology. 131 (3), 818-829 (2006).</li>
<li>Mombaerts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+development+of+inflammatory+bowel+disease+in+T+cell+receptor+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice.</a> Cell. 75 (2), 274-282 (1993).</li>
<li>Willcox, B. E., Willcox, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gammadelta+TCR+ligands%3A+the+quest+to+solve+a+500-million-year-old+mystery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">gammadelta TCR ligands: the quest to solve a 500-million-year-old mystery.</a> Nature Immunology. 20 (2), 121-128 (2019).</li>
<li>Marchiando, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epithelial+barrier+is+maintained+by+in+vivo+tight+junction+expansion+during+pathologic+intestinal+epithelial+shedding%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The epithelial barrier is maintained by in vivo tight junction expansion during pathologic intestinal epithelial shedding.</a> Gastroenterology. 140 (4), e1201-e1202 (2011).</li>
<li>Marchiando, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caveolin-1-dependent+occludin+endocytosis+is+required+for+TNF-induced+tight+junction+regulation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Caveolin-1-dependent occludin endocytosis is required for TNF-induced tight junction regulation in vivo.</a> Journal of Cell Biology. 189 (1), 111-126 (2010).</li>
<li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MLCK-dependent+exchange+and+actin+binding+region-dependent+anchoring+of+ZO-1+regulate+tight+junction+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MLCK-dependent exchange and actin binding region-dependent anchoring of ZO-1 regulate tight junction barrier function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 107 (18), 8237-8241 (2010).</li>
<li>Chieppa, M., Rescigno, M., Huang, A. Y., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+dendritic+cell+extension+into+the+small+bowel+lumen+in+response+to+epithelial+cell+TLR+engagement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of dendritic cell extension into the small bowel lumen in response to epithelial cell TLR engagement.</a> Journal of Experimental Medicine. 203 (13), 2841-2852 (2006).</li>
<li>McDole, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Goblet+cells+deliver+luminal+antigen+to+CD103%2B+dendritic+cells+in+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine.</a> Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).</li>
<li>Edelblum, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+migration+of+gammadelta+intraepithelial+lymphocytes+requires+occludin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dynamic migration of gammadelta intraepithelial lymphocytes requires occludin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (18), 7097-7102 (2012).</li>
<li>Edelblum, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gammadelta+Intraepithelial+Lymphocyte+Migration+Limits+Transepithelial+Pathogen+Invasion+and+Systemic+Disease+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Migration Limits Transepithelial Pathogen Invasion and Systemic Disease in Mice.</a> Gastroenterology. 148 (7), 1417-1426 (2015).</li>
<li>Hu, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+IL-15+Is+a+Critical+Regulator+of+gammadelta+Intraepithelial+Lymphocyte+Motility+within+the+Intestinal+Mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Epithelial IL-15 Is a Critical Regulator of gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Motility within the Intestinal Mucosa.</a> Journal of Immunology. 201 (2), 747-756 (2018).</li>
<li>Hoytema van Konijnenburg, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+Epithelial+and+Intraepithelial+T+Cell+Crosstalk+Mediates+a+Dynamic+Response+to+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intestinal Epithelial and Intraepithelial T Cell Crosstalk Mediates a Dynamic Response to Infection.</a> Cell. 171 (4), 783-794 (2017).</li>
<li>Prinz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+earliest+steps+of+gammadelta+T+cell+development+in+the+adult+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Visualization of the earliest steps of gammadelta T cell development in the adult thymus.</a> Nature Immunology. 7 (9), 995-1003 (2006).</li>
<li>Sandrock, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+models+reveal+origin%2C+persistence+and+non-redundant+functions+of+IL-17-producing+gammadelta+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genetic models reveal origin, persistence and non-redundant functions of IL-17-producing gammadelta T cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 215 (12), 3006-3018 (2018).</li>
<li>Wang, X., Sumida, H., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPR18+is+required+for+a+normal+CD8alphaalpha+intestinal+intraepithelial+lymphocyte+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">GPR18 is required for a normal CD8alphaalpha intestinal intraepithelial lymphocyte compartment.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (12), 2351-2359 (2014).</li>
<li>Sumida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPR55+regulates+intraepithelial+lymphocyte+migration+dynamics+and+susceptibility+to+intestinal+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">GPR55 regulates intraepithelial lymphocyte migration dynamics and susceptibility to intestinal damage.</a> Sci Immunol. 2 (18), (2017).</li>
<li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2 (2), (2011).</li>
<li>Watson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+barrier+function+in+vivo+is+sustained+despite+gaps+in+epithelial+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers.</a> Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).</li>
<li>Lodolce, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-15+receptor+maintains+lymphoid+homeostasis+by+supporting+lymphocyte+homing+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">IL-15 receptor maintains lymphoid homeostasis by supporting lymphocyte homing and proliferation.</a> Immunity. 9 (5), 669-676 (1998).</li>
<li>Ma, L. J., Acero, L. F., Zal, T., Schluns, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-presentation+of+IL-15+by+intestinal+epithelial+cells+drives+development+of+CD8alphaalpha+IELs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Trans-presentation of IL-15 by intestinal epithelial cells drives development of CD8alphaalpha IELs.</a> Journal of Immunology. 183 (2), 1044-1054 (2009).</li>
<li>Knoop, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotics+promote+the+sampling+of+luminal+antigens+and+bacteria+via+colonic+goblet+cell+associated+antigen+passages%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Antibiotics promote the sampling of luminal antigens and bacteria via colonic goblet cell associated antigen passages.</a> Gut Microbes. 8 (4), 400-411 (2017).</li>
<li>Sujino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+adaptation+of+regulatory+and+intraepithelial+CD4%28%2B%29+T+cells+controls+gut+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue adaptation of regulatory and intraepithelial CD4(+) T cells controls gut inflammation.</a> Science. 352 (6293), 1581-1586 (2016).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Requirements+of+TCR+Signaling+in+Homeostatic+Maintenance+and+Function+of+Dendritic+Epidermal+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Differential Requirements of TCR Signaling in Homeostatic Maintenance and Function of Dendritic Epidermal T Cells.</a> Journal of Immunology. 195 (9), 4282-4291 (2015).</li>
<li>Chennupati, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-+and+intercompartmental+movement+of+gammadelta+T+cells%3A+intestinal+intraepithelial+and+peripheral+gammadelta+T+cells+represent+exclusive+nonoverlapping+populations+with+distinct+migration+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Intra- and intercompartmental movement of gammadelta T cells: intestinal intraepithelial and peripheral gammadelta T cells represent exclusive nonoverlapping populations with distinct migration characteristics.</a> Journal of Immunology. 185 (9), 5160-5168 (2010).</li>
<li>Kolesnikov, M., Farache, J., Shakhar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+two-photon+imaging+of+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital two-photon imaging of the gastrointestinal tract.</a> Journal of Immunological Methods. 421, 73-80 (2015).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

פיתוח טכניקות המיקרוסקופיה של הארגון סיפק הזדמנות חסרת תקדים לבחון את התארגנות משנה של מבנים תת-תאיים8,9,22, אינטראקציות תא תאים12, 25 והתנהגות הנדידה של תאים13,14,15,16,26 ברקמות אחרות שאינן נגישות. יש כבר מ...

לימפוציטים התוך-אפיתל (אל-על) נמצאים מתחת לאפיתל המעי, ומצויים הן לאורך קרום המרתף ובין תאי האפיתל הסמוכים בחלל הבין-תאי הרוחבי1. יש כ-א. א. אחד עבור כל 5-10 תאים אפיתל; אלה IELs לשמש זקיפים כדי לספק מעקב החיסונית של המרחב הגדול של מכשול האפיתל המעי2. IELs ביטוי קולטן התא γδ T (TCR) מהווים עד 60% של אוכלוסיית הכולל של אל. אל במעי הדק קטן. מחקרים ב γδ T-cell לקוי עכברים להפגין תפקיד המגן במידה רבה של תאים אלה בתגובה לפציעה במעיים, דלקת וזיהום3,4,5. למרות הדור של העכבר הנוקאאוט Tcrd 6, ההבנה שלנו של ביולוגיה γδ, שנותרה מוגבלת בשל העובדה שליטרים המוכרים על-ידי הγδ tcr טרם זוהו7. כתוצאה מכך, חוסר כלים ללמוד את האוכלוסיה הסלולרית התקשה לחקור את התפקיד של γδ TCR הפעלה ותפקוד בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים. כדי למלא פער זה, פיתחנו טכניקות הדמיה בשידור חי כדי להמחיש את התנהגות הנדידה הγδ של אל-על עם הסביבה השכנה כאמצעי כדי לספק תובנה נוספת לפונקציה γδ והיענות לגירויים חיצוניים בvivo.
במהלך העשור האחרון, הדמיה מעמיקה הרחיבה באופן משמעותי את הבנתנו את האירועים המולקולריים המעורבים בהיבטים מרובים של ביולוגיה של המעי, כולל תאים אפיתל הקזת8, ויסות פונקציית ההפרדה האפיתל9 ,10, לדגימת תא מיאלואידית של תוכן של לומיאל11,12, ואינטראקציות של חיידק מארח11,13,14,15,16 . במסגרת השימוש בביולוגיה של אל-על, שימוש במיקרוסקופיה באמצעות מיקרוטרטל מזיל אור על הדינמיקה הטמפורלית של אל-מדינת אל-עואו, והגורמים המאובטים את התנהגות המעקב שלהם13,14,15, . שישה עשרה הפיתוח של TcrdH2BeGFP (tcrdegfp) כתבת עכברים, אשר תוויות γδ iels על ידי גרעיני הביטוי gfp17, גילה כי iels γδ הם מאוד נעים בתוך האפיתל והתערוכה התנהגות ייחודית מעקב היענות חיידקים . זיהום17,13,14 לאחרונה, עוד γδ T העיתונאי הנייד פותחה (Tcrd-gdl) אשר מבטא gdl בציטופלסמה כדי לאפשר ויזואליזציה של התא כולו18. מתודולוגיה דומה שימש כדי לחקור את הדרישה של קולטני כימוקין ספציפיים, כגון G חלבון בשילוב קולטן (gpcr)-18 ו-55, על הדינמיקהשל אל. בהעדר כתב מיוחד לתאים, השתמשו בנוגדנים בעלי מראות פלורסנט כנגד CD8α שימשו להמחיש ולעקוב אחר "אל-לvivo" ב-19,20. למרות מיקרוסקופ שני פוטון לייזר סריקה משמש בדרך כלל עבור הדמיה intravital, השימוש של הדיסק ספינינג מיקרוסקופ לייזר קונפוקלית וקד מספק יתרונות ייחודיים כדי ללכוד מהירות גבוהה ברזולוציה גבוהה multi-channel תמונות עם רעש רקע מינימלי. טכנולוגיה זו היא אידיאלית כדי להבהיר את הדינמיקה הטמפורלית של אינטראקציות החיסון/אפיתל בתוך המיקרו-סביבה המורכבת של רירית המעי. יתר על כן, באמצעות שימוש במודלים שונים ו/או העכבר מודלים, מחקרים אלה יכולים לספק תובנה לתוך הוויסות המולקולרי של המעי החיסונית ו/או תא אפיתל התפקוד.

<table><tbody><tr><td>צלחת 35 מ"מ, מס' 1.5 Coverslip</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 633 Hydrazide</td><td>Invitrogen</td><td>A30634</td><td></td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide מחטים היפודרמיות - 27 גרם</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-826-48</td><td></td></tr><tr><td>BD מזרק סטרילי עם קצה החלקה - 1 מ"ל</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-823-434</td><td></td></tr><tr><td>BD מזרק טוברקולין</td><td>תרמו פישר Scientific</td><td>14-829-9</td><td></td></tr><tr><td>מספריים מנתחים</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>Electrocautery</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50822501</td><td></td></tr><tr><td>תא דגירה סגור</td><td>OKOLAB</td><td></td><td>מיקרוסקופ</td></tr><tr><td>מחטי עיניים, גודל #3; 1/2 מעגל, נקודת התחדדות, אורך אקורד 12 מ"מ</td><td>Roboz</td><td>RS-7983-3</td><td></td></tr><tr><td>Hank's תמיסת מלח מאוזנת</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>55037C</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Imaris (v. 9.2.1) עם מודולי Start, Track, XT</td><td>תוכנת</td><td>Bitplane</td><td></td></tr><tr><td>הפוכה DMi8</td><td>Leica</td><td></td><td>Microscope</td></tr><tr><td>IQ3 (v. 3.6.3)</td> <td>Andor</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Putney</td><td></td><td>Anesthesia</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>VWR</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>מספריים McPherson-Vannas 3 אינץ' (7.5 ס"מ) ארוך 5 x 0.15 מ"מ ישר Sharp</td><td>Roboz</td><td>RS-5600</td><td></td></tr><tr><td>תפר כירורגי שאינו נספג, סליל משי, שחור קלוע</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0798934</td><td></td></tr><tr><td>Nugent מלקחיים 4.25 אינץ' (11 ס"מ) זווית ארוכה חלקה 1.2 מ"מ קצה</td><td>Roboz</td><td>RS-5228</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Vet משחה</td><td>Dechra</td><td></td><td>סיכה משחת עיניים</td></tr> דיסק <tr><td>מסתובב יוקגאווה CSU-W1 עם 63x 1.3 N.A. HC PLAN APO מטרת טבילה גליצרול, מצלמת iXon Life 888 EMCCD, לייזר דיודה 405 ננומטר, לייזר DPSS 488 ננומטר, לייזר דיודה 640 ננומטר</td><td>מערכת קונפוקלית</td> קסילזין <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>אקורן</td><td></td><td>הרדמה</td></tr></tbody></table>

אינטרטל הדמיה של לימפוציטים תוך-אפיתל במעי קטן מוריין

Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine

לימפוציטים תוך-אפיתל המבטאת קולטן תא T γδ (γδ אל) לשחק תפקיד מפתח במעקב החיסונית של אפיתל המעי. בשל היעדר ליגולי מוחלט עבור קולטן התא γδ T, ההבנה שלנו של התקנה של γδ הפעלה של אל-על ותפקידם בvivo נשאר מוגבל. זה מחייבת את ההתפתחות של אסטרטגיות חלופיות לחקור משעולים איתות המעורבים בוויסות הפונקציה של γδ, ואת התגובה של תאים אלה למיקרו הסביבה המקומית. למרות γδ IELs מובנים באופן נרחב כדי להגביל טרנסלוקציה הפתוגן, השימוש הדמיה in, היה קריטי כדי להבין את הדינמיקה הרקתית של האינטראקציות של אל-האו אפיתל במצב יציב בתגובה פתוגנים פולשנית. בזאת, אנו מציגים פרוטוקול להמחיש התנהגות הנדידה של אל-אל ברירית המעי הקטן של העכבר הכתבת gfp γδ T באמצעות דיסק מסתובב הפוך מיקרוסקופ לייזר קונפוקלית. למרות שעומק ההדמיה המקסימלי של גישה זו מוגבל ביחס לשימוש במיקרוסקופיה לייזר בשני הפוטונים, מיקרוסקופ לייזר מסתובב בדיסק מספק את היתרון של רכישת תמונה במהירות גבוהה עם הלבנת שיפור ו נזקי. באמצעות תוכנת ניתוח התמונה 4D, התנהגות מעקב התא T ואת האינטראקציות שלהם עם התאים השכנים ניתן לנתח בעקבות מניפולציה ניסיוני כדי לספק תובנה נוספת לתוך הפעלה ותפקוד של אל-על בתוך רירית המעי.

באמצעות דימות הדמיה של עכברים העיתונאי TcrdEGFP, יש לנו בעבר הראו כי IELs γδ התערוכה מעקב דינמי התנהגות, שבה הם מסיירים האפיתל על ידי מעבר לאורך קרום המרתף לתוך החלל הבינתאי לרוחב (LIS) באופן קבוע מדינה (איור 2, סרט 1).
גישה זו יכולה לשמש גם כדי להעריך כיצד עיכוב של מסלולים ספציפיים התא איתות ו/או קולטנים השפעות γδ התנהגות נדידה של אל. לדוגמה, אינטרלויקין (IL)-15 הוא מתקן הכרחי עבור γδ אל הומאוסטזיס23,<sup class=...

אנו מתארים שיטה כדי להמחיש gfp γδ iels התווית באמצעות הדמיה intravital של המעי הדק מורטין על ידי מיקרוסקופית הפוכה דיסק מיקרוסקופ קונפוקלית. טכניקה זו מאפשרת מעקב של תאים חיים בתוך רירית עד 4 h והוא יכול לשמש כדי לחקור מגוון של אינטראקציות מעיים החיסונית-אפיתל.

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal ...

מיקרוסקופ תוך-ויטמינים של רירית המעי הקטנה יכול לספק תובנה לגבי הדינמיקה המרחבית של אינטראקציות תאיות בתוך האפיתל בין סוגי תאים חיסוניים שונים, או בין שני תאים אלה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת רכישה של תמונות במהירות גבוהה וברזולוציה גבוהה בתוך רירית המעי בזמן אמת. הדמיה חיה של המעי יכולה לספק תובנה נוספת על האינטראקציות התאיות, או איתות תאים המעורבים בחסינות ריר, ביולוגיה אפיתל או ביולוגיה של סרטן.זוהי שיטה מאתגרת הדורשת תרגול של הטכניקה הכירורגית, כמו גם סבלנות ומיקום אופטימלי של העכבר לרכישת תמונה. לאחר אישור חוסר תגובה קמצוץ הבוהן בעכבר מהופנט הרדמה, הבעת חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר, או EGFP, קולטן גמא-דלתא T-cell, להשתמש מזרק שחפת לאט להזריק 200 microliters של Hoechst טרי מוכן 33342 פתרון צבע לתוך סינוס ורידים רטרו-מסלולית. אחת עד שתי דקות לאחר ההזרקה, יש למרוח משחה על עיני החיה כדי למנוע מהם להתייבש.לאחר מכן, לעשות חתך אנכי 2CM דרך העור ואת peritoneum, לאורך קו האמצע של הבטן התחתונה ולהשתמש ממטרים זוויתי כדי למשוך בזהירות את caecum מתוך חלל צפק. זהה אזור 2-3CM של המעי הדק המכיל תוכן צואה מינימלי, דואג לא לקרוע את כלי הדם mesenteric, בזהירות להחזיר את caecum ואת המעי הדק הנותר לחלל צפק, משאיר את קטע העניין החצנה. הצבת שני זוגות של מדפים משני צדי mesentery קו תח

intravital-imaging-intraepithelial-lymphocytes-murine-small

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

הטכניקה לביצוע מיקרוסקופיה intravital של הצומת לימפה מפשעתי (LN) הוא התווה. טכניקה כזו מאפשרת בזמן...

מיקרוסקופית Intravital של הצומת לימפה מפשעתי

ההתקדמות מיקרוסקופיה 2-פוטון אפשרו בזמן...

Intravital הדמיה של בלוטות לימפה popliteal עכבר

סרטון זה מדגים הדמיה של לימפוציטים תוך-אפיתליאליים γδ (IELs) בעכברים טרנסגניים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. ההליך הכירורגי כולל יצירת קו ניקוב וביצוע חתך אורכי כדי לחשוף את רירית המעי ואת villi. העכברים הטרנסגניים מבטאים חלבוני כתב באופן בלעדי ב-γδ IELs, מה שמאפשר מעקב אחריהם. הדמיה תוך-חיונית לוכדת את התנועה הדינמית של γδ IEL ירוק המסומן בפלואורסצנטיות לאורך קרום המרתף של תא האפיתל של המעי.

הדמיה תוך חיונית של לימפוציטים תוך-אפיתליאליים של גמא דלתא

על ידי שימוש בעכברים מדווחים טרנסגניים ותוויות פלואורסצנטיות הניתנות להזרקה, מיקרוסקופיה קונפוקלית של דיסק מסתובב תוך-חיוני לטווח ארוך מאפשרת הדמיה ישירה של התנהגות התאים המיאלואידיים לאדנומה של המעי הגס במודל סרטן המעי הגס Apc Min/+.

הדמיה של Dynamics התאים מיאלואידית בזמן אמת Apc מינימום / + מעיים גידולים על ידי דיסק מסתובב Confocal מיקרוסקופית

יש עניין גובר באפיון הכמותי של לימפוציטים במעי עקב ההכרה הגוברת בכך שתאים אלה ממלאים תפקיד קריטי במגוון מחלות מעיים ומערכתיות. בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד לבודד אוכלוסיות תאים בודדים מתאי מעי דק שונים לאפיון ציטומטרי זרימה לאחר מכן.

אפיון בידוד תזרים Cytometric של Murine קטנים מעיים לימפוציטים

אנו מתארים כאן מודל של עכבר מדווח טרנסגני כדי לדמיין את התאים המייצרים IL-22 בתוך רקמות עכבר שונות. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לעקוב אחר מיקומם של ציטוקינים אחרים או חלבוני מזכיר בעכבר.

ויזואליזציה של לימפוציטים-22-להביע IL באמצעות עכברים Reporter

כאן נתאר פרוטוקול מפורט על הבידוד של לימפוציטים האתרים אינדוקטיבית כולל בלוטות לימפה mesenteric המנקזים ותיקונים של פייה רקמת הלימפה הקשורים הבטן, ואת האתרים אפקטור כולל את פרופריה. מוסקולריס ו אפיתל המעי של המערכת החיסונית קטנים במעיים.

לימפוציטים בידוד מן העכבר קטן המעי המערכת החיסונית

. הנה, נדגים את שיטות ויוו כימות של ליקוציט יציאה מן תמימה, מודלק, והעור מאתר ממאיר. אנו לבצע השוואת עפות בשני דגמים: transdermal FITC יישום, בחיי עיר photoconversion. יתר על כן, נדגים את התועלת של photoconversion עבור מעקב אחר ליקוציט היציאה של גידולים עורית.

לכימות ליקוציט היציאה דרך כלי הלימפה מ מאתר עור וגידולים

תוך ניצול של מיקרוסקופ תוך-ויטאל, השיטה המוצגת כאן מאפשרת הדמיה בזמן אמת של שפיכת תאי אפיתל במעיים בבעלי חיים חיים. לכן, רירית מעיים מוכתמת topically (acriflavine ו rhodamineB-dextran) של עכברים מרדימים הוא תמונה עד רזולוציה של תא יחיד באמצעות מיקרוסקופית confocal.

גישה תוך-ויטאלית המבוססת על מיקרוסקופיה להערכת חמלה במעיים וביצועי שפיכת תאים אפיתל

פרוטוקול זה מציע הוראות מפורטות לביסוס אורגנואידים של המעי הדק של מורין, בידוד תאי לימפואידים מולדים מסוג 1 מהלמינה פרופריה של המעי הדק מורין, והקמת תרביות משותפות תלת-ממדיות (3D) בין שני סוגי התאים כדי לחקור אינטראקציות דו-כיווניות בין תאי אפיתל במעי לבין תאי לימפואידים מולדים מסוג 1.

תרבית משותפת של אורגנואידים אפיתליאליים של המעי הדק של מורין עם תאי לימפה מולדים

כאן, אנו מציגים שיטה לקבלת תמונות של המעי על פצע המושרה בלייזר. על ידי חשיפת מעי העכבר ללייזר מולטיפוטון, אובדן של קריפט(ים) בודדים או מרובים מושרה באופן מקומי. על ידי הדמיה חוזרת ונשנית של האזור הפגוע במשך חודשים, נלכדת הדינמיקה בזמן אמת של התאוששות המעי.

אבלציה בלייזר ומיקרוסקופ תוך חיוני לחקר עיצוב מחדש של המעי

חקור הדמיה תוך-חיים של לימפוציטים תוך-אפיתל במעי קטן מוריין באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר תאים חיים עד 4 שעות לחקר אינטראקציות חיסון-אפיתל.

אינטרטל הדמיה של לימפוציטים תוך-אפיתל במעי קטן מוריין

גלה סרטונים נוספים