Name: טיפול ללא נוגדנים עבור RNA מתילטרנספראז ניתוח פעילות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: למדו שיטה ללא נוגדנים לניתוח פעילות מתילטרנספראז של RNA באמצעות S-adenosyl-methionine מסומן בטריטיום. הפרוטוקול מאפשר כימות ויזואליזציה של מתילציית RNA בצורה רגישה ומדויקת לחקר אפיגנטיקה וביוכימיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות לד ר טורג'ה קאנטי דבנאת על עזרתו בכמקולף. מחקר במעבדה xhemalçe הצ נתמך על ידי משרד הביטחון-Congressionally ביים תוכנית מחקר רפואי-סרטן השד פריצת דרך הפרס (W81XWH-16-1-0352), NIH גרנט R01 GM127802 והתחל כספים מהמכון לסלולר ו ביולוגיה מולקולרית והמכללה למדעי הטבע באוניברסיטת טקסס באוסטין, ארה ב.

<ol><li>Xhemalce, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+histones+to+RNA%3A+role+of+methylation+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">From histones to RNA: role of methylation in cancer.</a> Briefings in Functional Genomics. 12 (3), 244-253 (2013).</li>
<li>Shelton, S. B., Reinsborough, C., Xhemalce, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Who+Watches+the+Watchmen%3A+Roles+of+RNA+Modifications+in+the+RNA+Interference+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Who Watches the Watchmen: Roles of RNA Modifications in the RNA Interference Pathway.</a> PLoS Genetics. 12 (7), 1006139(2016).</li>
<li>Mauer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+methylation+of+m%286%29Am+in+the+5%27+cap+controls+mRNA+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reversible methylation of m(6)Am in the 5' cap controls mRNA stability.</a> Nature. 541 (7637), 371-375 (2017).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N6-methyladenosine-dependent+regulation+of+messenger+RNA+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability.</a> Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).</li>
<li>Pendleton, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+U6+snRNA+m%286%29A+Methyltransferase+METTL16+Regulates+SAM+Synthetase+Intron+Retention%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The U6 snRNA m(6)A Methyltransferase METTL16 Regulates SAM Synthetase Intron Retention.</a> Cell. 169 (5), 824-835 (2017).</li>
<li>Meyer, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5%27+UTR+m%286%29A+Promotes+Cap-Independent+Translation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">5' UTR m(6)A Promotes Cap-Independent Translation.</a> Cell. 163 (4), 999-1010 (2015).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N%286%29-methyladenosine+Modulates+Messenger+RNA+Translation+Efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">N(6)-methyladenosine Modulates Messenger RNA Translation Efficiency.</a> Cell. 161 (6), 1388-1399 (2015).</li>
<li>Alarcon, C. R., Lee, H., Goodarzi, H., Halberg, N., Tavazoie, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N6-methyladenosine+marks+primary+microRNAs+for+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">N6-methyladenosine marks primary microRNAs for processing.</a> Nature. 519 (7544), 482-485 (2015).</li>
<li>Xhemalce, B., Robson, S. C., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+RNA+methyltransferase+BCDIN3D+regulates+microRNA+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Human RNA methyltransferase BCDIN3D regulates microRNA processing.</a> Cell. 151 (2), 278-288 (2012).</li>
<li>Jeronimo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+the+protein+interaction+network+for+the+human+transcription+machinery+reveals+the+identity+of+the+7SK+capping+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of the protein interaction network for the human transcription machinery reveals the identity of the 7SK capping enzyme.</a> Molecular Cell. 27 (2), 262-274 (2007).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brd4+and+JMJD6-associated+anti-pause+enhancers+in+regulation+of+transcriptional+pause+release%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Brd4 and JMJD6-associated anti-pause enhancers in regulation of transcriptional pause release.</a> Cell. 155 (7), 1581-1595 (2013).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experimentation%22%5BJournal%5D)">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> Journal of Visual Experimentation. , Cambridge, MA. (2019).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experimentation%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visual Experimentation. (63), e3998(2012).</li>
<li>Rong, M., Durbin, R. K., McAllister, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Template+strand+switching+by+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Template strand switching by T7 RNA polymerase.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (17), 10253-10260 (1998).</li>
<li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+active+recombinant+T7+RNA+polymerase+from+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protocols%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of active recombinant T7 RNA polymerase from E. coli.</a> Cold Spring Harb Protocols. 2013 (11), (2013).</li>
<li>Shelton, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+the+RNA+Methylation+and+Histone-Binding+Activities+of+MePCE+Regulates+P-TEFb+Activation+on+Chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between the RNA Methylation and Histone-Binding Activities of MePCE Regulates P-TEFb Activation on Chromatin.</a> Cell Reports. 22 (6), 1374-1383 (2018).</li>
<li>Walker, S. C., Avis, J. M., Conn, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+plasmids+for+producing+RNA+in+vitro+transcripts+with+homogeneous+ends%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">General plasmids for producing RNA in vitro transcripts with homogeneous ends.</a> Nucleic Acids Research. 31 (15), 82(2003).</li>
<li>Blazer, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Suite+of+Biochemical+Assays+for+Screening+RNA+Methyltransferase+BCDIN3D%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%22%5BJournal%5D)">A Suite of Biochemical Assays for Screening RNA Methyltransferase BCDIN3D.</a> SLAS Discovery. 22 (1), 32-39 (2017).</li>
<li>Arango, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylation+of+Cytidine+in+mRNA+Promotes+Translation+Efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Acetylation of Cytidine in mRNA Promotes Translation Efficiency.</a> Cell. 175 (7), 1872-1886 (2018).</li>
<li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+NAT10+is+an+ATP-dependent+RNA+acetyltransferase+responsible+for+N4-acetylcytidine+formation+in+18+S+ribosomal+RNA+%28rRNA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Human NAT10 is an ATP-dependent RNA acetyltransferase responsible for N4-acetylcytidine formation in 18 S ribosomal RNA (rRNA).</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35724-35730 (2014).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

כאן, שיטה פשוטה ואיתנה עבור אימות מחוץ לחוק של RNA מmethyltransferase פעילות כלפי התעתיקים הספציפיים מדווחים. הצורך מנצל את העובדה כי S-אדנוסיל מתיונין יכול להיות מטרימת על התורם קבוצת מתיל (איור 1), המאפשר RNA מתילאז להיות מזוהה במדויק ללא שימוש של נוגדנים. עם זאת, חשוב לציין שאין אפשרות לציין איזה שאריות או קבוצה כימית ממתיכה על-ידי האנזים. כדי לזהות או לוודא כי שאריות ספציפיים הוא מתילזה, שיטות אחרות כגון ניתוח מועד, בלוק תמלול הפוכה או ניתוח ספקטרומטר המסה של המצע RNA ניתן להשתמש בשילוב ...

DNA, RNA ו חלבונים כפופים שינויים כי בחוזקה לווסת ביטוי גנים1. בין השינויים הללו מתרחשים הbiopolymers בכל שלוש הפעמים. . בשלושת העשורים האחרונים לעומת זאת, העניין ב-RNA מתילציה הוצת רק לאחרונה לאור התפקידים החשובים שחלבונים הכותבים, מוחקים או מאגד את מחלות ה-RNA של המשחק בפיתוח ובמחלות2. בנוסף לפונקציות ידועות יותר בריבוזומיום שופע והעברת rnas, RNA מתילציה מסלולים להסדיר שליח ספציפי RNA יציבות3,4, החדרת5 ותרגום6,7, מירנה עיבוד8,9 ו הפסקה ושחרור10,11.
כאן, שיטה פשוטה ואיתנה עבור אימות מחוץ לחוק של RNA מתיליראז ' פעילות בהגדרה של מעבדת ביולוגיה מולקולרית מדווחת (מסוכם באיור 1). מחקרים רבים להעריך את הפעילות של RNA מmethyltransferase באמצעות נקודה בכתם עם נוגדן נגד RNA שינוי של עניין. עם זאת, נקודה בכתם אינו מאמת את היושרה של RNA על הדגירה עם ה-RNA מmethyltransferase. זה חשוב כי אפילו זהום קטין של חלבונים רקומביננטי עם נוקלאוסים יכול להוביל חלקי RNA השפלה ותוצאות מייסדים. יתר על כן, אפילו מאוד ספציפי שינוי RNA נוגדנים יכול לזהות RNAs שאינם מוגדרים עם רצפים או מבנים ספציפיים. ה-RNA מתיל מתילאז שדווח כאן מנצל את העובדה כי מתיונין S-אדנוסיל יכול להיות מטרימת על התורם קבוצת מתיל (איור 1), המאפשר RNA מתילמת להיות מזוהה במדויק ללא שימוש בנוגדנים . הוראות מסופקות לתמלול ולטיהור של תעתיק של עניין ובדיקות של מתילציה של התמליל האמור על ידי אנזים הריבית. שיטה זו גמישה ואיתנה, וניתן להתאימו בהתאם לצרכיו של כל פרוייקט נתון. לדוגמה, בתוך מבחנה ומטוהרים RNAs, מסונתז כימית RNAs, אבל גם RNAs הסלולר ניתן להשתמש. הדבר מספק מידע כמותי בצורה של ספירות שניות, כמו גם מידע איכותני על-ידי הצגת היכן בדיוק ה-RNA המתיל פועל על ג'ל. זה יכול לספק תובנה ייחודית לתפקוד של RNA מmethyltransferase, במיוחד בעת שימוש RNAs הסלולר כמו מצע, כפי שהוא מספק שיטה ישירות להתבונן בגודל של RNA או RNAs כי הם מיועדים מתילציה.

<table><tbody><tr><td>10 bp DNA Ladder</td><td>Invitrogen</td><td>10821-015</td><td>ערכת סולם DNA 10 bp.</td></tr><tr><td>10% אמוניום פרסולפט (APS)&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>עבור ג'ל פוליאקרילאמיד לדנטורציה של אוריאה (עבור 10 מ"ל, ממיסים 1 גרם ב-8 מ"ל של מים מילי-Q; התאימו את הנפח ל-10 מ"ל עם מים מילי-Q; סננו את התמיסה באמצעות מזרק של 10 מ"ל המצויד ב-0.45 &micro; מסנן m).</td></tr><tr><td>10X TBE Buffer</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>לג'ל פוליאקרילאמיד לדנטורציה של אוריאה (עבור 1 ליטר, הוסף 108 גרם של בסיס Tris, 55 גרם של חומצה בורית לגליל עם מוט ערבוב; הוסף 800 מ"ל מים מזוקקים והניח להתמוסס; הוסף 40 מ"ל של 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0); התאם את הנפח ל-1 ליטר עם מים milliQ; סנן את התמיסה באמצעות 0.22&micro; מסנן m).</td></tr><tr><td>10X TBS</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>עבור 1 ליטר, הוסיפו 60.5 גרם של Tris Base, 87.6 גרם NaCl לגליל עם מוט ערבוב; הוסיפו 800 מ"ל מים מזוקקים והניחו להתמוסס; התאימו את ה-pH ל-7.5 עם HCl מרוכז; התאימו את הנפח ל-1 ליטר עם מי milliQ; סננו את התמיסה באמצעות 0.22 &micro; מסנן M.&nbsp;</td></tr><tr><td>אקרילאמיד: ביס-אקרילאמיד 29:1 (40% תמיסה/אלקטרופורזה), פישר ביו-ריאגנטים</td><td>פישר</td><td>BP1408-1</td><td>לג'ל פוליאקרילאמיד לדנטורציה של אוריאה.</td></tr><tr><td>אדנוסיל-L-מתיונין, S-[מתיל-3H]; (SAM [3H])</td><td>פרקין אלמר</td><td>NET155V250UC</td><td>למתילציה במבחנה של RNA; ריכוז = 1.0 mCi/mL; פעילות ספציפית = 17.1 Ci/mmol; מולריות = (1.0 Ci/L)/(83.2 Ci/mmol) = 0.0584 mmol/L = 58.4 &micro;M.&nbsp; &nbsp; עם קבלת צינור ה-3H-SAM הקפוא, יש להפשיר אותו ב-4 מעלות; C, לעשות 20 ומיקרו; L aliquots, והקפיא אותם ב-30&deg;C. לעולם אל תקפיא מחדש ותעשה שימוש חוזר ב-aliquot בשימוש חלקי.</td></tr><tr><td>קלטות אוטורדיוגרפיה של אמרשם היפרקסטה</td> GE <td>Healthcare</td><td>RPN11649</td><td>לחשיפה לג'ל אוטורדיוגרמה.</td></tr><tr><td>אמרשם היפרפילם MP</td><td>GE Healthcare</td><td>28906846</td><td>לחשיפה לג'ל אוטורדיוגרמה.</td></tr><tr><td>מונה נצנוץ בקמן</td><td>בקמן</td><td>LS6500</td><td>לספירת נצנוץ נוזלי.</td></tr><tr><td>מערכת אלקטרופורזה אופקית מיני Biorad</td><td>Biorad</td><td>1704466</td><td>מערכת אלקטרופורזה אופקית מיני.</td></tr><tr><td>cOmplete מיני מעכב פרוטאז ללא EDTA טבליות קוקטייל</td><td>Roche Applied Science</td><td>4693159001</td><td>לקבלת תמיסה של פי 20, ממיסים טבליה אחת ב-0.525 מ"ל מים ללא נוקלאז.</td></tr><tr><td>Criterion Cell</td><td>Biorad</td><td>345-9902</td><td>RNase מגירה ריקה בחינם לג'ל פוליאקרילאמיד.</td></tr><tr><td>קריטריון קלטות ריקות</td><td>Biorad</td><td>1656001</td><td>תא אלקטרופורזה אנכי בפורמט מידי.</td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח DeNovix DS-11 ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח</td><td>DeNovix</td><td>DS-11-S</td><td>למדידת ריכוז DNA ו-RNA.</td></tr><tr><td>Ecoscint Original</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-271</td><td>לספירת נצנוץ נוזלי.</td></tr><tr><td>בקבוקוני נצנוץ של פישרברנד 7 מ"ל HDPE</td><td>פישר</td><td>03-337-1</td><td>לספירת נצנוץ נוזלי.</td></tr><tr><td>Fluoro-Hance-משפר אוטורדיוגרפיה מהיר</td><td>RPI CORP</td><td>112600</td><td>לטיפול מקדים בג'ל אוטורדיוגרמה.</td></tr><tr><td>מייבש ג'ל</td><td>Biorad</td><td>1651745</td><td>לייבוש ג'ל.</td></tr><tr><td>מאגר טעינת ג'ל II</td><td>Ambion</td><td>AM8547</td><td>להעמסת RNA בג'ל אוריאה פוליאקרילאמיד דנטורינג (הרכב: 95% פורממיד, 18 מ"מ EDTA ו-0.025% SDS, קסילן ציאנול וברומופנול כחול).</td></tr><tr><td>טיפים לכריתת ג'ל חד פעמי של GeneCatcher</td><td>חברת ג'ל</td><td>NC9431993</td><td>להסרת רצועות מג'לים אגרוז ופוליאקרילאמיד.</td></tr><tr><td>ערכת Megascript</td><td>Ambion</td><td>AM1333</td><td>לשעתוק במבחנה עם T7 RNA פולימראז.&nbsp;</td></tr><tr><td>Perfectwestern Extralarge Container</td><td>Genhunter Corporation</td> <td>קופסת צביעת ג'ל</td> <td>NC9226382 (שקופה)/ NC9965364 (שחורה).</td></tr><tr><td>pRZ</td><td>Addgene</td><td>#27663</td><td>פלסמיד לייצור תעתיקים במבחנה עם קצוות הומוגניים</td></tr><tr><td>Qiagen RNeasy MinElute Cleanup</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>לניקוי RNA, השתמש בפרוטוקול שונה המסופק בפרוטוקול.</td></tr><tr><td>ערכת מיצוי ג'ל QIAquick (50)</td>ערכת <td>Qiagen</td><td>28704</td><td>למיצוי ג'ל וניקוי של שבר dsDNA המשמש לשעתוק במבחנה.</td></tr><tr><td>עטיפת פלסטיק פרימיום סרן</td><td>עטיפת</td><td>אמזון</td><td>לייבוש ג'ל.</td></tr><tr><td>SYBR Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td>כתם ג'ל חומצת גרעין רגיש במיוחד.</td></tr><tr><td>SYBR Safe</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td>צבע ג'ל חומצת גרעין.</td></tr><tr><td>TE</td><td>Sigma</td><td>93283-100ML</td><td>10 מ"מ Tris-HCl, 1 מ"מ דיסודיום EDTA, pH 8.0</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher</td><td>110-18-9</td><td>לג'ל פוליאקרילאמיד לדנטורציה של אוריאה.</td></tr><tr><td>תרמו-מיקסר עם צינורות SMARTBLOCK 24X 1.5 מ"ל</td><td>eppendorf</td><td>5382000023/5361000038</td><td>לדגירה מבוקרת טמפרטורה של צינורות 1.5 מ"ל.</td></tr><tr><td>ערכת שיבוט TOPO TA</td><td>ערכות טכנולוגיות</td><td></td> חיים <td>לשיבוט מהיר של Taq polymerase&ndash; תוצרי PCR מוגברים לווקטורים המכילים מקדמי T7 ו/או SP6 לשעתוק RNA במבחנה.</td></tr><tr><td>טורבו DNase (2 U&frasl; ומיקרו; L)</td> <td>אמביון</td><td>AM2238</td><td>להסרת DNA מתגובות שעתוק במבחנה.</td></tr><tr><td>אוריאה</td><td>סיגמא</td><td>51456-500G</td><td>לג'ל פוליאקרילאמיד לדנטורציה של אוריאה.</td></tr><tr><td>נייר Whatman 3 מ"מ</td> GE <td>Healthcare</td><td>3030-154</td><td>נייר כרומטוגרפיה לייבוש ג'ל.</td></tr></tbody></table>

טיפול ללא נוגדנים עבור rna מתילטרנספראז ניתוח פעילות

Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis

ישנם יותר מ 100 שינויים כימיים ברורים של RNA, שני שלישים מהם מורכבים של מתיכי. עניין בשינויים RNA, ובעיקר מתיכי, התפתחה מחדש בשל התפקידים החשובים ששיחקו אנזימים הכותבים ומוחקים אותם בתהליכים ביולוגיים הרלוונטיים למחלות ולסרטן. כאן, רגיש בתוך שיטת החוץ הגופית לניתוח מדויק של פעילות כותב RNA מתילציה על סינתטי או בתוך מבחנה מלאכותית RNAs מסופק. שיטת הפעולה משתמשת בצורה מלאכותית של S-אדנוסיל-מתיונין, וכתוצאה מכך תיוג ישיר של RNA מתיל עם טריציום. האנרגיה הנמוכה של קרינת טריטיום עושה את השיטה בטוחה, ושיטות הקיימות מראש של טריציום הגברה האות, לאפשר לכמת ולהמחיש את רנ א מתיליום ללא שימוש של נוגדנים, אשר נוטים בדרך כלל חפצים. בעוד שיטה זו נכתבת עבור RNA מתילציה, מנופך מעטים לעשות את זה רלוונטי למחקר של שינויים אחרים RNA שיכול להיות מתויג רדיואקטיבית, כגון מרחרחון RNA עם 14C מרחלן מסוג A. בסך הכל, שיטת זה מאפשרת להעריך במהירות RNA מתילציה תנאים, עיכוב עם מעכבי מולקולה קטנה, או את ההשפעה של RNA או מוטציות אנזים, ומספק כלי רב עוצמה כדי לאמת ולהרחיב את התוצאות המתקבלות בתאים.

תגובת שעתוק מחוץ לגופית איור 2 A מייצגת הפעלה טיפוסית מתוך תגובת שעתוק מבחנה עם T7 RNA פולימראז של 7Sk snrna, שהוא קצר יחסית (331 nt) ו-RNA מובנה מאוד. כפי שמוצג על התמונה הגולמית, ישנן מספר להקות לא רצויות, הן קצרות יותר ויותר מ-7SK, ככל הנראה כתוצאה מאירוע חניכה או הפסקת אירועים אקראיים. בגלל זה, ג'ל טיהור לאחר התגובה בתמלול החוץ חשוב לקבל מדגם RNA נקי כמו המוצג באיור 2ב. בשלב זה, ה-RNA של העניין יכול להיות...

כאן, אנטי נוגדן בתוך שימוש בלתי מתורבת לניתוח ישיר של פעילות מmethyltransferase על סינתטי או בתוך מבחנה מלאכותית המועתק RNA מתואר.

טיפול ללא נוגדנים עבור RNA מתילטרנספראז ניתוח פעילות

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and ...

ישנם יותר מ -100 שינויים שונים של RNA, שני שליש מהם מתילציות. פרוטוקול זה מספק שיטה לניתוח רגיש ומדויק של פעילות כותב מתילציה RNA. טכניקה קלה לשימוש זו מאפשרת לנו לכמת ולהדמיין RNA מתילציה ללא שימוש בנוגדנים, אשר נוטים בדרך כלל חפצים.הפגנת ההליך תהיה סמנתה שלטון, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי. כדי להתחיל בהליך זה, הגדר את הבדיקה RNA 100 מיקרוליטר מתילטרנספראז בצינור 1.5 מיליליטר על קרח, כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. Vortex הצינור לערבב ביסודיות, צנטריפוגה ב 200 פעמים g במשך חמש שניות כדי לאסוף את הפתרון בתחתית הצינור.דגירה הצינור ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים. לאחר מכן, נקה את התגובה באמצעות טיהור עמודות, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי לבצע את ספירת ההטיה הנוזלית, הגדר את ארון התקשורת של ספירת ההיתוך עם בקבוקון אחד לכל דגימה, בקבוקון אחד למדידת רקע ובקבוקון אחד לבדיקת ההחלקה.מלאו את הבקבוקונים בחמישה מיליליטר של פתרון ספירת תבליט. הוסף 10 מיקרוליטרים של כל דגימת RNA רדיואקטיבית אלוט לתוך בקבוקון אחד. מהדקים את המכסה ומערבבים בעדינות.כדי להכין את בקבוקוני מבחן ההחלקה, יש לשפשף ביסודיות צמר גפן על כל המשטחים והציוד המשמשים במהלך ההליך. מוסיפים את המטילים האלה לבקבוקונים המלאים בתתווית תוסף, ומהדקים את המכסה. כדי להפעיל את הדגימות על מונה ההצטיינים, פתח את מכסה המנוע של המונה, הכנס את ארון התקשורת למכונה וסגור את מכסה המנוע.בחר ספירת ארון תקשורת בודד. בחר בחר תוכנית משתמש. בחר או צור תוכנית המודדת טיטוריום למשך 60 שניות והתן ללחץ על ארון תקשורת של Count.חזור על ספירת ההטיה שלוש פעמים. לאחר מכן, להכין ולהפעיל מחדש ג'ל פוליאקרילמיד urea denaturing, כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. העבר 20 מיקרוליטרים של חומר RNA רדיואקטיבי לצינור חדש של 1.5 מיליליטר המכיל 20 מיקרוליטרים של חיץ טעינת ג'ל 2X.לאחר הכנת הסולם, הדגירה את הדגימות ב 70 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. לשטוף את בארות של הג'ל פעם נוספת מיד לפני הטעינה מדגם על ידי חיץ pipetting ממיכלי ג'ל למטה לתוך בארות של הג'ל. לאחר מכן, לטעון 20 microliters של הסולם מוכן, 20 microliters של הדגימות, ו 20 microliters של חיץ 1X ג'ל טעינה לתוך הנתיבים של הג'ל.הפעל את הג'ל ב 100 וולט במשך 60 עד 180 דקות, בהתאם לאחוז פוליאקרילמיד. לאחר שהג'ל סיים לפעול, הסר את הג'ל מהקלטת והצב אותו בקופסה המכילה 50 מיליליטר של חיץ TBE 1X עם חמישה מיקרוליטרים של כתם ג'ל חומצת גרעין רגיש במיוחד. דגירה על נדנדה במשך חמש דקות כדי להכתים את RNA.לאחר מכן, מוציאים בזהירות את הג'ל מהתיבה, ומ מניחים אותו על טרנסילומינטור UV של מערכת ההדמיה ג'ל עם הבאר למעלה ואת הסולם בצד שמאל. למקד את המצלמה על הג'ל, להפעיל את אור UV, ולצלם את הג'ל. לאחר מכן, כבה את חשיפת UV ושמור את התמונה כקובץ TIFF.מניחים את הג'ל בחזרה לתוך התיבה, להסיר את TBE, ולתקן את הג'ל עם 50 מיליליטר של פתרון תיקון על נדנדה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. לאחר מכן, בעדינות להעביר את הג'ל לקופסה שחורה טרייה המכילה 25 מיליליטר של פתרון שיפור האוטוביוגרפיה. דגירה על הנדנדה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.מרימים בעדינות את הג'ל, ומ מניחים אותו עם הפנים כלפי מטה על גיליון של ניילון נצמד עם בארות למעלה ואת הסולם בצד ימין. מניחים שני גיליונות של נייר כרומטוגרפיה על גב הג'ל, ולהפוך את הערימה כולה. מחממים מראש את מייבש הג'ל ל-80 מעלות.מזיזים את כיסוי הפלסטיק על מייבש הג'ל לאחור. הכנס את הערימה כולה מתחת לכיסוי הפלסטיק, והזז את כיסוי הפלסטיק בחזרה למטה כדי ליצור חותם. יבש את הג'ל ב 80 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.לאחר מכן, לכבות את מייבש ג'ל, בעדינות להסיר את הערימה. הסר את נייר העטיפה והכרומטוגרפיה השני. מקליטים את נייר הכרומטוגרפיה הנותר עם הג'ל המיובש בקלטת אוטוביוגרפיה.בחדר חשוך, הוסף גיליון אחד של סרט אוטוביוגרפיה. אחסן את הקלטת ב 80 מעלות צלזיוס שליליות, ולפתח את הסרט בזמן המתאים, בהתאם לעוצמת האות. לאחר שהסרט מפותח, מניחים אותו על גבי הקלטת ולהשתמש סמן מעבדה כדי לסמן בזהירות את ארבעת הקצוות של הג'ל, כל באר, ואת המיקום של XC ו BB צבעים.סרוק את הסרט ברזולוציה של 300 או 600 פיקסלים לאינץ', ושמור את התמונה כקובץ TIFF. במחקר זה, בדיקת נוגדנים ללא הוכח לנתח פעילות RNA מתילטרנספראז. ריצה טיפוסית מתגובת שעתוק במבחנה עם פולימראז T7 RNA של RNA גרעיני קטן 7SK מראה RNA קצר יחסית מובנה מאוד.ישנן להקות לא רצויות מרובות, קצרות ואותר מ- 7SK, ככל הנראה כתוצאה מאירועי אתחול או סיום אקראיים של שעתוק. בגלל זה, טיהור ג'ל בעקבות תגובת שעתוק במבחנה חשוב להשיג מדגם RNA נקי. בשלב זה, RNA של עניין יכול להיות מזוהה על ידי מיקומו יחסית לסולם ומטוהר על ידי טיהור ג'ל.RNA ייצוגי methyltransferase לבדוק באמצעות הגבול התחתון של RNA מומלץ ריכוזי חלבון מוצג כאן. בדיקה זו מאפשרת הן תוצאות כמותיות מספירת ההטיה, והן תוצאות איכותיות מההתדרדרות האוטו-רדיום. כאן, מתילרנספראז RNA ידוע מתילאט 7SK מוצג להיות מסוגל גם מתילאט U6. יתר על כן, כפי שהוצג לאחרונה עבור 7SK, מחייב של היסטון H4 כדי MePCE גם מעכב מתילציה U6.ניתן לראות זאת הן בספירת הנצנוץ והן ב autoradiogram, מראה את החוסן של פרוטוקול זה. RNA רגיש להשפלה, לכן הקפד להשתמש ריאגנטים ללא RNase ולנקות ביסודיות את כל המשטחים והציוד. RNA שכותרתו רדיואקטיבית המתקבלת מהערכה זו methyltransferase ניתן להשתמש ישירות כדי להעריך פעילות RNA demethylase או פעילות מחייבת RNA על ידי מסמן שינוי ניידות אלקטרופורטית, למשל.שיטה זו מאפשרת לחוקרים לבדוק את ההשפעה של גורמים שונים על פעילות RNA מתילטרנספראז, כולל מוטציות נקודתיות וטיפולי מעכבי מולקולות קטנות. שיטה זו משתמשת בחומר רדיואקטיבי, כדי להיות בטוח ללבוש את PPE המתאים, ולהיות זהיר במהלך טיפול סילוק של חומרים רדיואקטיביים.

antibody-free-assay-for-rna-methyltransferase-activity-analysis

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

פרוטוקול זה מתאר את הכנת המצע tRNA סינתטי...

ב Assay tRNA מתילציה במבחנה עם histolytica Entamoeba דנ&quot;א Dnmt2 tRNA methyltransferase (Ehmeth) אנזימים

שיטה סופגת צפונית שונה למדידת N 6 -methyladenosine (מ 6 א) שינויים ב RNA מתוארת. השיטה הנוכחית יכולה לזהות שינויים ב RNAs ובקרות מגוונות תחת עיצובים ניסיוניים שונים.

שיטה למדידת RNA<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; שינויי -methyladenosine ב תאים ורקמות

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור האפיון הביוכימי של שמרים שינוי RNA האנזים, Mod5, ונדון כיצד פרוטוקול זה יכול לחול על אנזימים אחרים שינוי RNA.

Assay ב Vitro לגילוי פעילות טרנספראז tRNA-Isopentenyl

כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור הפצילות תלויי-RNA של רנ א. זה מאפשר ניתוח מהיר ותלוי האתר של RNA 2 '-או-מתילציה. גישה זו יכולה לשמש להערכה ראשונית או מרכזית של פעילות הסנחנה.

ניתוח מותנה של rRNA 2 '-או-מתילציה

מבחני האימונו-פסיכוטיציה של ה-RNA המתילציה הם שיטה מבוססת נוגדנים המשמשת להעשרה עבור שברי RNA מתילציה. יחד עם רצף עמוק, זה מוביל לזיהוי של תעתיקים הנושאים את שינוי m5C.

מתילציה RNA אימונואוציאציה Assay ללמוד m5C שינוי ערבידופסיס

פרוטוקולים אלה מספקים את המתודולוגיה המשמשת להערכת הפעילות האנזימטית של חברים בודדים במשפחת החלבון ארגינין מתילטרנספראז (PRMT) בתאים. הנחיות מפורטות על הערכת פעילות PRMT באמצעות סמנים ביולוגיים אנדוגני אקסוגני, מתיל ארגינין זיהוי נוגדנים, ותרכובות כלי מעכב מתוארים.

שיטות כמותיות לחקר חלבון ארגינין מתילטרנספראז 1-9 פעילות בתאים

התפקיד של שינויים RNA בזיהומים ויראליים רק מתחיל להיחקר והוא יכול להדגיש מנגנוני אינטראקציה ויראלי מארח חדשים. בעבודה זו, אנו מספקים צינור לחקור m6A ו m5C RNA שינויים בהקשר של זיהומים ויראליים.

לחקור m6A ו- m5C Epitranscriptomes על זיהום ויראלי: דוגמה עם HIV

מתיל-טרנספראזות דנ"א הן מטרות פוטנציאליות לתרופות לסרטן. כאן מוצג פרוטוקול להערכת מולקולות קטנות לעיכוב מתיל-טרנספראז של DNA. בדיקה זו משתמשת באנדונוקלאז למתילציה זוגית של דנ"א ליצירת פלואורסצנציה ומאפשרת לנטר את פעילות האנזים בזמן אמת.

בדיקת מתילציה רציפה של דנ"א מצומד אנדונוקלאז מבוססת פלואורסצנציה לסינון מעכבי מתיל-טרנספראז של DNA

כאן אנו מציגים פרוטוקול להערכת רמות m⁶A גלובליות באופן חצי-כמותי באמצעות נקודת כתם נקודות. ה-RNA הכולל מופק, מנותק, מנוקד על ממברנת ניילון, נבדק בנוגדן אנטי-m⁶A, ומוצג באמצעות כימילומינסנציה. עוצמת האות, שנמדדה על ידי ניתוח גווני אפור של ImageJ, משקפת שפע מתילציה יחסי, ומספקת זרימת עבודה ניתנת לשחזור למחקר.

בדיקת נקודת כתם לזיהוי רמות שינוי RNA גלובליות של N 6-מתילאדנוזין

כאן, אנו מפרטים את השיטה של S equen של P סורלן crosslinked, L igated, ו S נבחר H ybrids (SPLASH), אשר מאפשר מיפוי גנום רחב של interramolecular ו intermolecular RNA-RNA אינטראקציות in vivo . SPLASH ניתן ליישם את המחקר RNA אינטראקציות של אורגניזמים כולל שמרים, חיידקים ובני אדם.

מיפוי RNA-RNA אינטראקציות גלובלי באמצעות Psoralen Biotinylated

למדו שיטה ללא נוגדנים לניתוח פעילות מתילטרנספראז של RNA באמצעות S-adenosyl-methionine מסומן בטריטיום. הפרוטוקול מאפשר כימות ויזואליזציה של מתילציית RNA בצורה רגישה ומדויקת לחקר אפיגנטיקה וביוכימיה.

טיפול ללא נוגדנים עבור RNA מתילטרנספראז ניתוח פעילות

גלה סרטונים נוספים