Name: הערכה של האינדוקציה לטווח ארוך של דיכאון פרוסות למבוגרים בלבד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: חקור אינדוקציה של דיכאון לטווח ארוך בתאי פורקינייה במוח הקטן בחיות עם מניפולציה גנטית. שיטות אלקטרופיזיולוגיות מסייעות להבנת הפלסטיות הסינפטית וקשרה ללמידה מוטורית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לא. קובה על הסיוע הטכני שלה. מחקר זה היה נתמך באופן חלקי על ידי גרנט בסיוע עבור מחקר מדעי (C) 17K01982 כדי K.Y.

כל ההליכים הניסיוניים אושרו על ידי ועדת RIKEN על הטיפול והשימוש בבעלי חיים בניסויים. עכברים נשמרו במתקן החי של מרכז ריקן למדעי המוח בטמפרטורה מבוקרת היטב (23 – 25 ° c) ולחות (45% – 65%) תנאים. השתמשו בשני עכברים זכריים ונקביים (C57BL/6, 3 – 6 חודשים).
1. הכנת הפתרונות המשמשים בניסויים
הערה: כל הפתרונות צריך להתבצע במים באולטרטהור ללא מתכות (מרסיסטילים > 18.2 MΩ) וזיהומים אחרים (פחמן אורגני סך (TOC) < 5.0 ppb). עבודה נוזל מלאכותי שדרתי (ACSF) עבור חיתוך גזירה והקלטה נעשים טריים ביום הניסוי החל 10 פעמים (x10) מלאי של ACSF. בועה הפתרונות עם 5% CO2/95% O2 תערובת גז לפני השימוש. ה-pH של ACSF מותאם 7.4 ± 0.1, ו osmolarity מותאם 315 ± 5 mOsm/ק ג על ידי הוספת מים באולטרטהורים.
<ol><li>להכין מלאי 10x של ACSF המכיל 1250 מ"מ הנאל, 30 מ"מ KCl, 12.5 mM נה2פו4, ו 260 mM נחקו3. ניתן לאחסן פתרון זה ב -4 ° c.</li>
	<li>
להכין עבודה ACSF המכיל 125 מ"מ הנאל, 3 מ"מ KCl, 2 מ"מ CaCl2, 1 מ ג Mg2SO4, 1.25 mm נה2פו4, 26 מ"מ נחקו3 ו 20 מ"מ גלוקוז.
	<ol>
<li>ראשון, להוסיף 1 mL של 2 M CaCl2 הפתרון ואחריו 1 ml של 1 M Mg2כל כך4 פתרון לתוך סביב 800 ml של מים באולטרטהורים, כדי למנוע משקעים. ואז להוסיף 100 mL של 10 x ACSF ו גלוקוז. לבסוף, לפצות על נפח כולל של 1,000 mL על ידי הוספת מים באולטרטהורים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכינו 3.3% אגר לטיפול במוח. מתמוסס 1 גרם של אגר ב 30 מ ל של 0.9% הפתרון הנאקל, וחום במיקרוגל עד רק רותחים. מערבבים כדי לערבב, ולאחר מכן יוצקים אותו לתוך סטרילי 4 ס"מ x 10 ס מ פלסטיק הקופסה ולאפשר לגבש. לאחסן את הצלחת אגר (~8 מ"מ עובי) במקרר.</li>
	<li>
הכן את הפתרון הפנימי.
	<ol>
<li>הכן את הפתרון הפנימי מבוסס K+המכיל 60 Mm kcl, 60 mm K-גלוקונאט, 0.3 MM egta, 4 מ"מ MgCl2, 4 מ"מ ATP, 0.4 mm GTP ו 30 מ"מ hepes (pH 7.2). הערה: ריכוז נמוך (0.3 מ"מ) של EGTA, Ca איטי2 +-הליידי, מתווסף להיות כנראה מזוהמים ca2 + ב מים טהורים, אבל זה ריכוז נמוך של egta בפתרון הפנימי אף פעם לא חוסם את אינדוקציה של בע מ (איור 3, איור 4, איור 5) במהלך הקלטה שלמה של התאים. לחץ אוסמוטי נמדד הוא 285 mOsm/ק"ג.</li>
		<li>הכינו את הפתרון הפנימי מבוסס Cs+המכיל 60 Mm CsCl, 46 mm D-gluconate, 27 מ"מ טטראתילמוניום כלוריד (תה-Cl), 0.3 MM egta, 4 מ"מ MgCl2, 4 מ"מ ATP, 0.4 mm GTP ו 30 מ"מ hepes (pH 7.2, מותאם באמצעות csoh). הערה: מדעי הבית+ בלוקים של ערוצי K התלויים במתח חשמלי, ומשפר את תנאי הצבת החלל בדנדריטים מרוחקים על ידי הגדלת האורך קבוע. לחץ אוסמוטי נמדד הוא 285 mOsm/ק"ג.</li>
		<li>הכינו 200 μL של פתרונות ואחסון ב-30 ° c.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. המוח חיתוך ו זמירה
<ol><li>לצנן ו חמצן 2 50 mL מספלים של ACSF על הקרח עד הטמפרטורה נמוכה יותר 4 ° c. הוסף 50 μl של טטרודוטוקסין (ttx, 1 מ"מ) לתוך אחד הקרים קרח קר של acsf ושריין אותו חיתוך פרוסות. כדי להשיג את העכבר פרוסה באופן שמירת פרוסות היכולת, תוספת TTX ל-ACSF הרגיל הוא הכרחי.</li>
	<li>מצננים את מגש המתכת על ידי מילוי אזור אמבט הקרח בחדר הפרוסות עם קרח.</li>
	<li>יוצקים 1 מ ל של isof, לתוך צנצנת מורדם (~1000 mL) ולאחר מכן למקם את העכבר בו 30-45 s. להבטיח כי העכבר הוא מורדם עמוקות על ידי אישור חוסר יכולתה להגיב גירוי מכני.</li>
	<li>ערוף את ראשו של העכבר. באמצעות מספריים כירורגיים החזיקו את הראש וחתכו את העור השטחית לאורך קו האמצע תוך שימוש במספריים של אופטלמולוגית. משוך את העור על ידי החזקת עם האצבעות כדי לחשוף באופן נרחב את פני הגולגולת.</li>
	<li>חותכים את הגולגולת אופקית לאורך קו מן החור הגדול spinochular ממש מעל האוזן והעין באמצעות מספריים רופא עיניים. חותכים את הגולגולת לאורך קו מעל שתי העיניים ולהסיר כדי לבודד את הגולגולת.</li>
	<li>חותכים את המוח באמצע המוח באמצעות אזמל, ואז לבודד את החלק caudal של המוח כולל את המוח הראשי מהגולגולת. לטבול אותו בגביע קר קרח של ACSF. בדרך כלל, הזמן הכולל של עריפת הראש כדי טבילה של בלוק המוח לתוך הגביע הטרום מקורר של ACSF צריך להיות פחות מ 60 s.</li>
	<li>מיקום של אבובים מבעבעים צריך להיות מותאם כדי לא לעורר את גוש המוח בגביע. נזק מכני עלול לגרום לנפיחות של הפרוסה במהלך ההקלטה. להשאיר אותו לפחות 7 דקות ולאפשר למוח להתקרר.</li>
	<li>כדי לחתוך את המוח לחסום, לגזור פיסת אגר מלבני (2 ס"מ x 2 ס מ) מצלחת אגר גדול (4 ס"מ x 10 ס"מ, מאוחסן ב 4 ° c) ולשים אותו על נייר סינון כדי לקלוט את עודפי הנוזלים.</li>
	<li>להפוך את הקטע אגר הפוך על נייר מסנן, ואז למקם את פיסת אגר על נייר סינון על מגש מתכת טרום מקורר הדגימה (16 ס"מ x 20 ס מ). להרים את בלוק המוח באמצעות מרית ולקלוט נוזל מוגזם סביבו עם פיסת נייר סינון.</li>
	<li>הר המוח לחסום על בלוק אגר באמצעות דבק (הדבק מיידית רפואי ציאנואקריאקרילי). הקפד לצרף את החלק התחתון (בצד הגחוני) של בלוק המוח כדי אגר.</li>
	<li>חותכים את האונה הימנית עם להב. להיות בטוח כי הצד של המטוס חיתוך הוא מקביל ככל האפשר למישור הדנדריטי של המחשב, כי הצד הזה מחובר למשטח של מגש הדגימה. חותכים ומסירים את הצד השני של האונה. לאחר מכן, חותכים את המוח בין העליון לבין המכרה הנחות, ולחתוך את חוט השדרה.</li>
	<li>הדבק את הצד הימני של המוח הקצוץ החתוך עם בלוק אגר על מגש הדגימה טרום מקורר. מורחים דבק עודף סביב המוח החצי עם החלק השטוח של מרית, כדי למנוע דבק עודף מלצרף למשטח המוח. להטות את מגש המתכת ויוצקים ACSF כדי לתקן את הדבק ולשטוף את הדבק עודף.</li>
</ol>3. חיתוך מוח
<ol><li>האוריינט המדגם כך שהצד השני של המוח הראשי נמצא בצד הקדמי. יוצקים ice-קר חיתוך ACSF, המכיל 1 μM TTX, מספיק כדי לטבול את המוח החסר לחלוטין. מניחים צינור גז לתוך ACSF ולהתחיל מבעבע עם O2/CO2 תערובת גז.</li>
	<li>הסירו את הארכייד מאטר. בעזרת טוויצר משובח מתחת למשקפת ותסיר את גזע המוח. ואת הבלוק של אגר סובב את המגש 180 °, כך שהמשטח החלק הגבי של המוח הפנימי מתמודד עם להב גילוח.</li>
	<li>הגדר את הלהב וכוונן את מיקום החיתוך הראשון. הגדר את הפרמטרים של פרוסות הרטט לבאות: משרעת ל-5.5, תדירות ל-85 Hz, מהירות ל-3-4 ועובי הפרוסה ל-300 μm.</li>
	<li>להעביר את הפרוסה המוח על ניילון-נטו לתוך אינקובטור אקריליק לטבול את הפרוסה לחלוטין ACSF חמצון. יש להניח את החממה באמבט מים השומר על טמפרטורה של 26 ° c.</li>
	<li>אחסן את הפרוסות עבור לפחות 1 h כדי לאפשר שחזור מהנזק במהלך החיתוך.</li>
</ol>4. הדבקת תא שלם-הקלטת קלאמפ
הערה: הקלטה מלחציים תיקון דורש הציוד הבאים: מיקרוסקופ זקוף עם הפרעה אינפרא אדום הפרעות דיפרנציאליות (IR-DIC) אופטיקה, מגבר מהדק תיקון, התקן הדיגיטציה של נתונים, גירוי דיגיטלי, מבודד, מחשב, תוכנה לרכישת נתונים ניתוח, מנועי מניפולטור, פלטפורמת מיקרוסקופ, שולחן בידוד רטט, כלוב פאראדיי, מערכת חימום פתרונות, משאבות פריסטלטיות וכלי אלקטרודה.
<ol><li>הוסף picrotoxin (0.1 mM) כדי ACSF ולפתור אותו באמצעות ultra-sonication עבור 3 דקות.</li>
	<li>מבשם תא הקלטה עם picrotoxin המכיל, O2-CO2-רווי acsf בשיעור של 2 מ ל/דקה. לשמור על טמפרטורת חדר ההקלטה בסביבות 30 ° c.</li>
	<li>לבצע הקלטה אלקטרודה ידי משיכת נימי זכוכית בורוסיליקט עם נימה (קוטר החיצוני = 1.5 מ"מ) באמצעות פולר עם 4 שלבים. קוטר הקצה אמור להיות בסביבות 1 μm.</li>
	<li>לעשות אלקטרודה מגרה על ידי משיכת נימי אותו באמצעות הפולר עם 2 שלבים, ואז לשבור כדי לייצר טיפ דק על ידי הכאת הטיפ נגד גוש ברזל תחת מיקרוסקופ המשקפת. הקוטר האחרון צריך להיות 3 – 5 μm.</li>
	<li>העבר את פרוסת המוח לתא ההקלטה ותקן אותו עם משקל Pt עם חוטי ניילון. למלא אלקטרודה מגרה עם ACSF.</li>
	<li>לגירוי ה-PFs, הנח את האלקטרודה המעוררת על פני השטח של השכבה המולקולרית, בסביבות 50 יקרומטר הרחק משכבת התאים purkinje.</li>
	<li>לגירוי של CF, המקום האלקטרודה מגרה בתחתית שכבת התאים Purkinje (שלבים 5.3, 5.4).</li>
	<li>הפתרון הפנימי מבוסס מסנן K+או Cs+באמצעות מסנן 0.45 יקרומטר. השתמש מיקרו מטעין כדי למלא אלקטרודה הקלטה עם 8 μL של פתרון פנימי.</li>
	<li>החל לחץ חיובי חלש על האלקטרודות ההקלטה לפני שאתה מאשר אותו לתוך ACSF. ההתנגדות שלה צריכה להיות 2 – 4 MΩ ופוטנציאל junctional נוזלי צריך להיות מתוקן.</li>
	<li>גש אל גוף התאים הבריא והבהיר של המחשב עם האלקטרודה הרושמת. לדחוף את פני השטח של התאים Purkinje מעט, להפסיק את החלת לחץ חיובי, הבא להחיל לחץ שלילי עד ליצירת חותם giga-אוהם. לאחר מכן לקבוע את התצורה של התא כולו באמצעות לחץ שלילי.</li>
	<li>להחזיק את הפוטנציאל הממברנה ב-70 mV, ולהחיל -2 mV פולס (משך, 100 ms) ב 0.1 הרץ כדי לפקח על התנגדות הקלט, התנגדות סדרה וקיבולת קלט, ברציפות. אל תשתמש בפיצוי ההתנגדות של הסדרה. התעלם מנתונים כאשר התנגדות הסדרה משתנה ביותר מ-15%.</li>
</ol>5. אינדוקציה בע מ
<ol><li>לעורר את השכבה המולקולרית עם דופק (משך, 0.1 ms). זיהוי הזרמים הפוסט-מפוטיים של PF (EPSC) על-ידי החלת גירוי בפעימה כפולה (מרווח זמן משני (ISI) של 50 ms). ה-PF-EPSC צריך להראות הקלה לזווג הדופק ועלייה הדרגתית משרעת יחסית להגדיל את עוצמת גירוי.</li>
	<li>הקלט את תגובת הבדיקה של ה-PF-EPSC על-ידי החלת פעימה בודדת ב-0.1 Hz. להתאים את עוצמת הגירוי, כך משרעת EPSC מעורר הוא סביב 200 pA. הימנע מזיהום של הזרם דרך הערוץ היוני תלוי המתח.</li>
	<li>לעורר את CF בחלק התחתון של שכבת התאים Purkinje, ולזהות את EPSC מעורר על ידי הפעלת CF (על ידי החלת גירוי הדופק כפול). CF-EPSC צריך להראות מזווג הדופק דיכאון ו-all-או-none הצורה על פי העלייה בעוצמה גירוי. עבור השראה בע מ, יש להשתמש בגירוי יחיד.</li>
	<li>
פרוטוקול ממריץ 1
	<ol>
<li>באמצעות האלקטרודה המכילה K+מבוסס פתרון פנימי תחת תנאים מלחציים הנוכחי, להחיל את הגירוי PF יחיד בודד CF-גירוי בו ב 1 הרץ עבור 5 דקות (300 פולסים) (איור 1a).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
פרוטוקול ממריץ 2
	<ol>
<li>באמצעות אלקטרודה המכילה K+מבוססי פתרון פנימי תחת התנאים הנוכחיים מלחציים, להחיל כפול pf-גירויים (ISI של 50 ms) ויחיד CF-גירוי כמו ה-pf-גירוי השני הוא האירוע עם cf-גירויים ב 1 הרץ עבור 5 דקות (איור 1b).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
פרוטוקול ממריץ 3
	<ol>
<li>באמצעות אלקטרודה המכילה הפתרון הפנימי מבוסס Cs+בתנאי מהדק מתח, להחיל את הגירוי PF כפול (ISI של 50 ms) ו בודד הקיטוב צעד (-70 כדי 0 mV, 50 ms) כדי סומה ב 1 הרץ עבור 3 דקות, כך PF-גירוי השני הוא שווה ערך לתחילת שלב המתח (איור 1C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
פרוטוקול וממריץ בע מ-4
	<ol>
<li>באמצעות אלקטרודה המכילה הפתרון הפנימי מבוסס Cs+בתנאי מהדק מתח, להחיל את PF-גירויים (5x ב 100 Hz) ו בודד ביטול הקיטוב צעד (-70 כדי 0 mV, 50 ms) כדי סומה ב 0.5 Hz עבור 3 דקות, בו זמנית (איור 1d ).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Eccles, J. C., Ito, M., Szentagothai, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEccles%2C+JC+%22The+Cerebellum+as+a+Neuronal+Machine%22">The Cerebellum as a Neuronal Machine</a>. , Springer. New York. (1967).</li>
<li>Marr, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+theory+of+cerebellar+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">A theory of cerebellar cortex.</a> Journal of Physiology. 202 (2), 437-470 (1969).</li>
<li>Albus, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory+of+cerebellar+function%5BTitle%5D)+AND+%22Mathematical+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Theory of cerebellar function.</a> Mathematical Biosciences. 10 (1), 25-61 (1971).</li>
<li>Maekawa, K., Simpson, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Climbing+fiber+responses+evoked+in+vestibulocerebellum+of+rabbit+from+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Climbing fiber responses evoked in vestibulocerebellum of rabbit from visual system.</a> Journal of Neurophysiology. 36 (4), 649-666 (1973).</li>
<li>Ito, M., Shiida, T., Yagi, N., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+influence+on+rabbit+horizontal+vestibulo-ocular+reflex+presumably+effected+via+the+cerebellar+flocculus%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Visual influence on rabbit horizontal vestibulo-ocular reflex presumably effected via the cerebellar flocculus.</a> Brain Research. 65 (1), 170-174 (1974).</li>
<li>Ghelarducci, B., Ito, M., Yagi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impulse+discharge+from+flocculus+Purkinje+cells+of+alert+rabbits+during+visual+stimulation+combined+with+horizontal+head+rotation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Impulse discharge from flocculus Purkinje cells of alert rabbits during visual stimulation combined with horizontal head rotation.</a> Brain Research. 87 (1), 66-72 (1975).</li>
<li>Robinson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+gain+control+of+vestibulo-ocular+reflex+by+the+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Adaptive gain control of vestibulo-ocular reflex by the cerebellum.</a> Journal of Neurophysiology. 39 (5), 954-969 (1976).</li>
<li>Gilbert, P. F. C., Thach, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purkinje+cell+activity+during+motor+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Purkinje cell activity during motor learning.</a> Brain Research. 128 (2), 309-328 (1977).</li>
<li>Ito, M., Sakurai, M., Tongroach, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Climbing+fibre+induced+depression+of+both+mossy+fibre+responsiveness+and+glutamate+sensitivity+of+cerebellar+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Climbing fibre induced depression of both mossy fibre responsiveness and glutamate sensitivity of cerebellar Purkinje cells.</a> Journal of Physiology. 324, 113-134 (1982).</li>
<li>Ito, M., Kano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lasting+depression+of+parallel+fiber-Purkinje+cell+transmission+induced+by+conjunctive+stimulation+of+parallel+fibers+and+climbing+fibers+in+the+cerebellar+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Long-lasting depression of parallel fiber-Purkinje cell transmission induced by conjunctive stimulation of parallel fibers and climbing fibers in the cerebellar cortex.</a> Neuroscience Letters. 33 (3), 253-258 (1982).</li>
<li>Ekerot, C. F., Kano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+depression+of+parallel+fibre+synapses+following+stimulation+of+climbing+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Long-term depression of parallel fibre synapses following stimulation of climbing fibres.</a> Brain Research. 342 (2), 357-360 (1985).</li>
<li>Sakurai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+modification+of+parallel+fibre-Purkinje+cell+transmission+in+in+vitro+guinea-pig+cerebellar+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Synaptic modification of parallel fibre-Purkinje cell transmission in in vitro guinea-pig cerebellar slices.</a> Journal of Physiology. 394, 462-480 (1987).</li>
<li>Hirano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depression+and+potentiation+of+the+synaptic+transmission+between+a+granule+cell+and+a+Purkinje+cell+in+rat+cerebellar+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Depression and potentiation of the synaptic transmission between a granule cell and a Purkinje cell in rat cerebellar culture.</a> Neuroscience Letters. 119 (2), 141-144 (1990).</li>
<li>Linden, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+long-term+depression+of+AMPA+currents+in+cultured+cerebellar+purkinje+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A long-term depression of AMPA currents in cultured cerebellar purkinje neurons.</a> Neuron. 7 (1), 81-89 (1991).</li>
<li>Linden, D. J., Connor, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Participation+of+postsynaptic+PKC+in+cerebellar+long-term+depression+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Participation of postsynaptic PKC in cerebellar long-term depression in culture.</a> Science. 254 (5038), 1656-1659 (1991).</li>
<li>Ito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+long-term+depression%3A+characterization%2C+signal+transduction+and+functional+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cerebellar long-term depression: characterization, signal transduction and functional roles.</a> Physiological Reviews. 81 (3), 1143-1195 (2001).</li>
<li>Ito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+organization+of+cerebellar+long-term+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The molecular organization of cerebellar long-term depression.</a> Nature Reviews Neuroscience. 3, 896-902 (2002).</li>
<li>Ito, M., Jastreboff, P. J., Miyashita, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+effects+of+unilateral+lesions+in+the+flocculus+upon+eye+movements+in+albino+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Specific effects of unilateral lesions in the flocculus upon eye movements in albino rabbits.</a> Experimental Brain Research. 45 (1-2), 233-242 (1982).</li>
<li>Nagao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+vestibulocerebellar+lesion+upon+dynamic+characteristics+and+adaptation+of+vestibulo-ocular+and+optokinetic+responses+in+pigmented+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Effects of vestibulocerebellar lesion upon dynamic characteristics and adaptation of vestibulo-ocular and optokinetic responses in pigmented rabbits.</a> Experimental Brain Research. 53 (1), 36-46 (1983).</li>
<li>Watanabe, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+events+correlated+with+long-term+adaptation+of+the+horizontal+vestibulo-ocular+reflex+in+the+primate+flocculus%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Neuronal events correlated with long-term adaptation of the horizontal vestibulo-ocular reflex in the primate flocculus.</a> Brain Research. 297 (1), 169-174 (1984).</li>
<li>van Neerven, J., Pompeiano, O., Collewijn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+GABAergic+and+noradrenergic+injections+into+the+cerebellar+flocculus+on+vestibulo-ocular+reflexes+in+the+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Effects of GABAergic and noradrenergic injections into the cerebellar flocculus on vestibulo-ocular reflexes in the rabbit.</a> Progress in Brain Research. 88, 485-497 (1991).</li>
<li>Ito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+motor+learning+in+the+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Mechanism of motor learning in the cerebellum.</a> Brain Research. 886, 237-245 (2000).</li>
<li>De Schutter, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+long-term+depression+might+normalize+excitation+of+Purkinje+cells%3A+a+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Cerebellar long-term depression might normalize excitation of Purkinje cells: a hypothesis.</a> Trends in Neurosciences. 18 (7), 291-295 (1995).</li>
<li>Hansel, C., Linden, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+depression+of+the+cerebellar+climbing+fiber-Purkinje+neuron+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Long-term depression of the cerebellar climbing fiber-Purkinje neuron synapse.</a> Neuron. 26 (2), 473-482 (2000).</li>
<li>Safo, P., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+dependence+of+the+induction+of+cerebellar+LTD%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Timing dependence of the induction of cerebellar LTD.</a> Neuropharmacology. 54 (1), 213-218 (2007).</li>
<li>Schonewille, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reevaluating+the+role+of+LTD+in+cerebellar+motor+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Reevaluating the role of LTD in cerebellar motor learning.</a> Neuron. 70 (1), 43-500 (2011).</li>
<li>Karachot, L., Kado, T. R., Ito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus+parameters+for+induction+of+long-term+depression+in+in+vitro+rat+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Stimulus parameters for induction of long-term depression in in vitro rat Purkinje cells.</a> Neuroscience Research. 21 (2), 161-168 (1994).</li>
<li>Hartell, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+cerebellar+long-term+depression+requires+activation+of+glutamate+metabotropic+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Induction of cerebellar long-term depression requires activation of glutamate metabotropic receptors.</a> Neuroreport. 5, 913-916 (1994).</li>
<li>Aiba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficient+cerebellar+long-term+depression+and+impaired+motor+learning+in+mGluR1+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Deficient cerebellar long-term depression and impaired motor learning in mGluR1 mutant mice.</a> Cell. 79, 377-388 (1994).</li>
<li>Steinberg, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+in+vivo+mutations+of+the+AMPA+receptor+subunit+GluR2+and+its+interacting+protein+PICK1+eliminate+cerebellar+long-term+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeted in vivo mutations of the AMPA receptor subunit GluR2 and its interacting protein PICK1 eliminate cerebellar long-term depression.</a> Neuron. 46 (6), 845-860 (2006).</li>
<li>Koekkoek, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+FMR1+in+Purkinje+cells+enhances+parallel+fiber+LTD%2C+enlarges+spines%2C+and+attenuates+cerebellar+eyelid+conditioning+in+Fragile+X+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Deletion of FMR1 in Purkinje cells enhances parallel fiber LTD, enlarges spines, and attenuates cerebellar eyelid conditioning in Fragile X syndrome.</a> Neuron. 47 (3), 339-352 (2005).</li>
<li>Yamaguchi, K., Itohara, S., Ito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reassessment+of+long-term+depression+in+cerebellar+Purkinje+cells+in+mice+carrying+mutated+GluA2+C+terminus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Reassessment of long-term depression in cerebellar Purkinje cells in mice carrying mutated GluA2 C terminus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (36), 10192-10197 (2016).</li>
<li>De Schutter, E., Bower, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+active+membrane+model+of+the+cerebellar+Purkinje+cell+II.+Simulation+of+synaptic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">An active membrane model of the cerebellar Purkinje cell II. Simulation of synaptic responses.</a> Journal of Neurophysiology. 71 (1), 401-419 (1994).</li>
<li>Swensen, A. M., Bean, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+mechanisms+of+burst+firing+in+dissociated+Purkinje+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ionic mechanisms of burst firing in dissociated Purkinje neurons.</a> Journal of Neuroscience. 23 (29), 9650-9663 (2003).</li>
<li>Fukuda, J., Kameyama, M., Yamaguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breakdown+of+cytoskeletal+filaments+selectively+reduces+Na+and+Ca+spikes+in+cultured+mammal+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Breakdown of cytoskeletal filaments selectively reduces Na and Ca spikes in cultured mammal neurones.</a> Nature. 294 (5836), 82-85 (1981).</li>
<li>Arancillo, M., White, J. J., Lin, T., Stay, T. L., Silltoe, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+Purkinje+cell+firing+properties+during+postnatal+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of Purkinje cell firing properties during postnatal mouse development.</a> Journal of Neurophysiology. 113, 578-591 (2015).</li>
<li>Ishikawa, T., Shimuta, M., Häusser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+sensory+integration+in+single+cerebellar+granule+cell+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Multimodal sensory integration in single cerebellar granule cell in vivo.</a> eLife. 4, e12916(2015).</li>
<li>Tempia, F., Minlaci, M. C., Anchisi, D., Strata, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsynaptic+current+mediated+by+metabotropic+glutamate+receptors+in+cerebellar+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Postsynaptic current mediated by metabotropic glutamate receptors in cerebellar Purkinje cells.</a> Journal of Neurophysiology. 80, 520-528 (1998).</li>
<li>Wang, S. S., Denk, W., Häusser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coincidence+detection+in+single+dendritic+spines+mediated+by+calcium+release%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Coincidence detection in single dendritic spines mediated by calcium release.</a> Nature Neuroscience. 3, 1266-1273 (2000).</li>
<li>Kuroda, S., Schweighofer, N., Kawato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+signal+transduction+pathways+in+cerebellar+long-term+depression+by+kinetic+simulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Exploration of signal transduction pathways in cerebellar long-term depression by kinetic simulation.</a> Journal of Neuroscience. 21 (15), 5693-5702 (2001).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+cerebellar+engrams+in+short-term+and+long-term+motor+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Distinct cerebellar engrams in short-term and long-term motor learning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), E188-E193 (2014).</li>
<li>Inoshita, T., Hirano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+of+long-term+depression+in+the+cerebellar+flocculus+during+adaptation+of+optokinetic+response%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Occurrence of long-term depression in the cerebellar flocculus during adaptation of optokinetic response.</a> eLife. 27, 36209(2018).</li>
<li>Belmeguenai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+plasticity+complements+long-term+potentiation+in+parallel+fiber+input+gain+control+in+cerebellar+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Intrinsic plasticity complements long-term potentiation in parallel fiber input gain control in cerebellar Purkinje cells.</a> Journal of Neuroscience. 30 (41), 13630-13643 (2010).</li>
<li>Ohtsuki, G., Piochon, C., Adelman, J. P., Hansel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SK2+channel+modulation+contributes+to+compartment+specific+dendritic+plasticity+in+cerebellar+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">SK2 channel modulation contributes to compartment specific dendritic plasticity in cerebellar Purkinje cells.</a> Neuron. 75, 108-120 (2012).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

הבדלים בין ארבעת הפרוטוקולים
בפרוטוקולים מסוג 1 ו-2, Cjs 300 פעמים ב-1 Hz מספיק כדי לגרום למוח בע מ. תדירות גירוי של CF נראה להיות בטווח פיזיולוגי, כי שיעור הירי המורכב ספייק בזמן התראה עכברים מבוגרים (P60) דווחה להיות 1.25 Hz36. עם זאת, הגירוי CF לבדו לא לגרום פלסטיות לטווח ארוך ב-PF-CF סינפסה, כפי שנעשה בשימוש פרוטוקולים 1 ו 2 (איור 4, איור 5), למרות CF-גירוי לבד בתדר גבוה יותר המושרה בע מ24</...

הארגון הסינפטיות של הרשתות עצבי הרחיב של קליפת המוח, מורכב של מחשבים, שכבת מולקולרית interneurons (סל ו stellate תאים), בתאי golgi, PFs של תאים גרגר עושה סיבים טחבי וסיבים טיפוס (cfs), הובהר במונחים של עירור/עיכוב והתפצלות/התכנסות, ואת דיאגרמת המעגלים המאורגנים היטב הציע כי המוח התת הוא "מכונה עצבית"1, למרות שקודם לכן לא היה מושג על המטרה של "מכונה" זו. מאוחר יותר הציע מארי שקלט PFs למחשבים מהווה רשת למידה אסוציאטיבית שכבתית משולשת2. הוא גם הציע כי כל CF מעביר הוראה מוחית עבור התנועה האלמנטלים2. הוא הניח כי הפעלה בו זמנית של PFs ו-CF היה לשפר את הפעילות PF-PC סינפציה, ולגרום פוטנציאל לטווח ארוך (LTP) של ה-PF-PC סינפסה. מצד שני, אלבוס הניח כי הפעלה סינכרונית של PFs ו-CF הביא בע מ ב-PF-PC סינפסות3. הן המחקרים לעיל לפרש את המוח הגבוה כהתקן זיכרון ייחודי, שילוב של אשר לתוך הרשת הקרקלית המוח מוביל את היווצרות של דגם מכונת הלמידה של מימאר-אלבוס.
בעקבות תחזיות תאורטיות אלה, שתי שורות של ראיות מרמזות על נוכחות הפלסטיות הסינפטית במוח השני. קו הראיות הראשון הוצע על ידי הארגון האנטומי של הפלוקולוס; כאן MF מסלולים של הגזע שיווי המוני האיברים מסלולים CF של המקור הרשתית להתכנס על מחשבים אישיים4. תבנית ההתכנסות הייחודית הזאת מרמזת כי הפלסטיות הסינפטית המתרחשת בפולוקקולוס גורם ליכולת הסתגלות יוצאת דופן של רפלקס השמיעה. שנית, הקלטת התגובה של המחשבים בתוך הפלוקולוס והלילוקולוס תמכו גם בהשערה המעל5,6,7. יתר על כן, המחשב פריקה דפוס במהלך הסתגלות של תנועת היד של הקוף8 תמך ההשערה הפלסטיות הסינפטית, במיוחד של אלבוס בע מ ההשערה3.
כדי לקבוע את טבעו של הפלסטיות הסינפטית ישירות, וחזר גירוי משלים (Cjs) של צרור של PFs ו-CF כי במיוחד innervates את המחשב ב vivo הוצגה כדי לגרום בע מ עבור יעילות השידור של PF – PC סינפסות9, 10,11. בעקבות בחיפושי מבחנה באמצעות פרוסת מחשב12 ומחשבים בעלי מחשב תרבותי, השילוב של גירוי תא משותף הגרניט ושיתוף של תאים באוליב הזית13 או בצירוף של גלוטמט שהוחלו באופן מתורבת וסומטיים דפולריזציה14,15 גרם בע מ מנגנון התמרה האותות בבסיס האינדוקציה נחקר באופן אינטנסיבי גם בהכנות של מבחנה16,17.
עיבודים של ה-VOR ו-OKR השתמשו לעתים קרובות להערכה כמותית של השפעות מניפולציה גנטית על למידה מוטורית של המוח, בגלל המוח פרוזדור המוח הוכח להיות מקור חיוני בלמידה אדפטיבית של ה-VOR18 ,19,20 ו-okr19,21 הקורלציה בין כישלון של בע מ השראה ופגיעה של למידה מוטורית התנהגותית נלקח כראיה כי בע מ ממלא תפקיד חיוני במנוע מנגנוני למידה22. תצוגות אלה מכונים באופן קולקטיבי ההשערה של למידה מוטורית, או מימאר-אלבוס-היפותזה-איטו23,24,25,26.
למידה אדפטיבית של תנועת העין נמדד באמצעות פרוטוקולים דומים, בעוד מצבים ניסיוניים שונים שימשו כדי לגרום בע מ הכנת פרוסה27,28,29,30,31 . לאחרונה, Schonewille ואח '26 דיווחו כי כמה עכברים מניפולציות גנים הפגינו למידה רגילה מוטוריים, אבל הפרוסות המוח לא הראו בע מ, ובכך סיכם כי בע מ לא היה חיוני ללמידה מוטורית. עם זאת, האינדוקציה של בע מ ניסה רק באמצעות סוג אחד של פרוטוקול בטמפרטורת החדר. לפיכך, השתמשנו במספר סוגים של פרוטוקולים מבוססי בע מ בתנאי הקלטה בסביבות 30 ° c, ואנו אישרו כי בע מ המושרה באופן אמין בעכברים מניפולציות הגן באמצעות פרוטוקולים אלה בסמוך לטמפרטורות פיזיולוגיות32.
עם זאת, נותרו מספר שאלות בנוגע לתכונות הבסיסיות של גירוי משלים. הראשון הוא הקשר בין הצורה של ספייק מורכב משרעת בע מ. שנית, בשילוב עם גירוי של PF ודפולריזציה סומטיים, בין אם מספר הגירויים היה הכרחי או לא היה חמקמק. במחקר הנוכחי, שאלות אלה נחקרו באמצעות סוג פראי (WT) עכברים.

<table><tbody><tr><td>מגבר</td><td>התקנים מולקולריים-Axon</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>נימי זכוכית בורוסיליקט</td><td>Sutter</td><td>BF150-110-10</td><td></td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>התקנים מולקולריים-Axon</td><td>Digidata1322A</td><td></td></tr><tr><td>חולץ אלקטרודות</td><td>סאטר</td><td>דגם P-97</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td><td>26675-46-7</td><td></td></tr><tr><td>מבודד</td><td>A.M.P.I.</td><td>ISOflex</td><td></td></tr><tr><td>פורס ליניארי</td><td>Dosaka EM</td><td>PRO7N</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>NIKON</td><td>Eclipse E600FN</td><td></td></tr><tr><td>משאבה פריסטלטית</td><td>גילסון</td><td>MP1 משאבת</td><td></td>ערוץ יחיד</tr><tr><td>Picrotoxin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1675</td><td></td></tr><tr><td>יצרנית מים טהורים</td><td>Merck-Millipore</td><td>MilliQ 7000</td><td></td></tr><tr><td>תוכנה לניסוי</td><td>בדיקה מולקולרית-Axon</td><td>pClamp 10</td><td></td></tr><tr><td>תוכנה לסטטיסטיקה</td><td>KyensLab</td><td>KyPlot 5.0</td><td></td></tr><tr><td>ממריץ</td><td>WPI</td><td>DS8000</td><td></td></tr><tr><td>בקר טמפרטורה</td><td>וורנר</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>טטרודוטוקסין</td><td>Tocris</td><td>1078</td><td></td></tr></tbody></table>

הערכה של האינדוקציה לטווח ארוך של דיכאון פרוסות למבוגרים בלבד

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

הפלסטיות הסינפטית מספק מנגנון ללמידה ולזיכרון. עבור למידה מוטורית מוטוריים, דיכאון לטווח ארוך (בע מ) של שידורים סינפטית מסיבים מקבילים (PF) כדי Purkinje תאים (PC) נחשב בסיס ללמידה מוטורית, והליקויים של הן בע מ ולמידה מוטורית נצפו במגוון בעלי חיים מניפולציות בגנים. מערכות למידה נפוצות מוטוריות, כגון הסתגלות של רפלקס האופקינטי (OKR), רפלקס השמיעה העינית (VOR), ומבחן rotarod שימשו להערכת יכולת למידה מוטורית. עם זאת, התוצאות שהתקבלו מן הGluA2-קרבוקסיקהטרמינוס שונה בעכברים הראו הסתגלות נורמלית של ה-VOR ו-OKR, למרות החסר PF-LTD. בדוח זה, האינדוקציה של בע מ ניסה רק באמצעות סוג אחד של פרוטוקול גירוי בטמפרטורת החדר. כך, התנאים כדי לגרום המוח בע מ נחקרו באותו מוטציות נקישה-באמצעות פרוטוקולים שונים בסמוך לטמפרטורה פיזיולוגית. בסופו של דבר, מצאנו פרוטוקולים גירוי, אשר ניתן לגרום בע מ בעכברים אלה מניפולציות גנים. במחקר זה, קבוצה של פרוטוקולים מוצעים להערכת בע מ אינדוקציה, אשר לאפשר באופן מדויק יותר את הבדיקה של היחסים סיבתי בין בע מ ולמידה מוטורית. לסיכום, תנאים ניסיוניים הם קריטיים בעת הערכת בע מ בעכברים מניפולציות גנים.

ארבעה פרוטוקולים שימשו במחקר זה כדי לגרום המוח בע מ. בשני הפרוטוקולים הראשונים (פרוטוקול 1 ו-2), השילוב של גירוי ה-PF והגירוי הCF הוחל בתנאי מלחציים נוכחיים. בשני הפרוטוקולים האחרים (פרוטוקול 3 ו-4), הוחלף בדפולריזציה של הסומונים עבור גירוי ה-CF בתנאים של מהדק מתח. סימני מתח או מרשמים נוכחיים במהלך גירוי משלים הושוו (איור 2).
השילוב של גירוי של 1 PF ו-1 הגירוי CF בתנאים הנוכחיים-קלאמפ (פרוטוקול -1) היו משמשים להכנת פרוסה26,<sup c...

בכמה בעלי חיים מניפולציות גנים, באמצעות פרוטוקול אחד עלול להיכשל כדי לגרום בע מ בתאים Purkinje המוח, וייתכן שקיים פער בין בע מ ללמידה מוטורית. פרוטוקולים מרובים נחוצים כדי להעריך את האינדוקציה בע מ בעלי חיים בעלי מניפולציה גנטית. פרוטוקולים רגילים מוצגים.

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...

כאשר פונקציית חלבון מסוימת משתנה על ידי מניפולציה גנים, תיאום של כשל גירוי ליקוי ריצה מוטורית נחשב תנאי הכרחי עבור קשר סיבתי בין LTD ולמידה מוטורית. כאן אנו מדגימים את השימוש בפרוטוקולים מרובים כדי להעריך בע"מ אשר יכול להיות המושרה באמצעות מנגנוני פיצוי בבעלי חיים גנים מניפולציה. לפני קצירת המוח, לצנן ולחמצן שתי 50 מיליליטר מקורים של ACSF על קרח.כאשר טמפרטורת הפתרון מגיעה מתחת לארבע מעלות צלזיוס, מוסיפים 50 מיקרוליטרים של טטרודוטוקסין מילימולרי אחד לאחת הנקניקיות הקרות בקרח. כדי לקצור את המוח, להחזיק את הראש ולהשתמש מספריים עיניים לחתוך את העור השטחי לאורך קו האמצע. באופן ידני לסגת את העור כדי לחשוף באופן נרחב את פני השטח של הגולגולת ולהשתמש במספריים לחתוך לאורך הגולגולת אופקית מן החור spinocerebellar הגדול רק מעל העיניים והאוזניים לפני חיתוך הגולגולת לאורך קו מעל שתי העיניים.השתמש באזמל כדי לחתוך את המוח באמצע המוח הגדול ולבודד את החלק caudal של המוח, כולל המוח הקטן, מהגולגולת. לטבול את המדגם בפקעת קרה קרח של ACSF ולהתאים את צינורות הבועה, כך שהוא לא לעורר את בלוק המוח בפקעת. לאחר שבע דקות לפחות, השתמש במתת כדי להרים את בלוק המוח ולהשתמש בפיסת נייר סינון כדי לספוג כל ACSF עודף.הר את הצד הגחוני של הרקמה על חתיכת אגר באורך 2 על 2 ס"מ עם דבק רפואי מתאים. השתמש בלהב כדי לחתוך את חצי הכדור הימני של רקמת המוח במקביל למישור הדני של תאי Purkinje ככל האפשר. חותכים ומסירים את הצד השני של חצי הכדור וחותכים את המוח בין הקוליקולי העליון והנחיתות.חותכים את חוט השדרה ולהדביק את הצד הימני של המוח הקטן גזוז עם בלוק אגר על מגש הדגימה מקורר מראש. לאחר מכן, הטיית מגש הדגימה, יוצקים ACSF על המדגם כדי לתקן את הרקמה ולשטוף כל דבק עודף. כדי לחתוך את דגימת המוח, לכוון את הדגימה כך הצד הגבי של המוח הקטן הוא בחזית ויוצקים מספיק של קרח קר חיתוך ACSF בתוספת tetrodotoxin לחלוטין לטבול את המוח הקטן.מניחים צינור גז לתוך פתרון החיתוך וליזום מבעבע עם תערובת גז פחמן דו חמצני חמצן. באמצעות פינצטה עדין וזכוכית מגדלת, להסיר את מאטר ארכנואידים בלו את peduncle המוח הקטן. לאחר הסרת גזע המוח וגוש אגר, לסובב את המגש 180 מעלות, כך פני השטח הגביים של המוח הקטן פונה סכין הגילוח של הרטט ולהתאים את מיקום החיתוך הראשון.הגדר את משרעת הרטט ל-5.5 ותדירות ל-85 הרץ, את המהירות ל-3 עד 4 ואת עובי הפרוסה ל-300 מיקרומטר. כאשר הפרוסות המוח הקטן מתקבלות, השתמש ברשת ניילון כדי להעביר את החלקים לחממה אקרילית באמבט מים של 26 מעלות צלזיוס ולטבול לחלוטין את הדגימות ב- ACSF מחומצן טרי למשך שעה אחת לפחות. עבור דיווח מהדק תיקון תא שלם, להמיס picrotoxin מיקרומולרי אחד ב- ACSF על ידי אולטסוניקה במשך שלוש דקות לפני perfusing תא הקלטה 30 מעלות צלזיוס עם פתרון רעלן בקצב זרימה של שני מיליליטר לדקה.לאחר מספר דקות, מעבירים פרוסה מוחית לתא ההקלטה ומסדרים את הרקמה עם משקל פלטינה וחוט ניילון. לאחר מכן מלאו אלקטרודה מגרה ב-ACSF טרי. כדי לעורר את הסיבים המקבילים, מניחים את האלקטרודה הממריצה על פני השטח של השכבה המולקולרית כ -50 מיקרומטרים משכבת התא Purkinje.לגירוי של סיבי הטיפוס, מניחים את האלקטרודה המעוררת בתחתית שכבת התא Purkinje ולהשתמש microloader כדי למלא אלקטרודה הקלטה עם שמונה microliters של 0.45 מיקרומטר אשלגן מסונן או פתרון פנימי מבוסס צסיום. החל לחץ חיובי חלש על האלקטרודה הקלטה לפני טבילת האלקטרודה לתוך ACSF. ההתנגדות לאלקטרודה צריכה להיות 2-4 מגה-ם ויש לתקן את פוטנציאל הצומת הנוזלי.התקרב לגוף התא הבהיר הבריא של תא Purkinje עם האלקטרודה הקלטה ולדחוף את פני השטח של התא Purkinje מעט. לאחר מכן להפסיק להפעיל את הלחץ החיובי ולהחיל לחץ שלילי עד חותם gigaohm נוצר. לאחר מכן השתמש בלחץ שלילי כדי ליצור תצורת תא שלם, שמירה על פוטנציאל הממברנה במינוס 70 מילי-וולט והחלת מינוס שני פולסים של מילי-וולט 100 אלפיות שנייה ב- 0.1 הרץ, ניטור רציף של התנגדות הקלט, התנגדות לסדרה ו קיבוליות קלט.עבור אינדוקציה דיכאון לטווח ארוך, לעורר את השכבה המולקולרית עם דופק 0.1 אלפית השנייה ולהחיל גירוי דופק כפול כדי לזהות את זרמים סינפטית סינפטית סיבים מקבילים. יש לצפות בהנחיית דופק מזווגת ובעלייה הדרגתית משרעת ביחס לעלייה בעוצמת הגירוי. כדי לתעד את תגובת הבדיקה, יש למרוח פעימת הרץ יחידה של 0.1 ולהתאים את עוצמת הגירוי כך משרעת המעוררת היא סביב 200 picoamps.לעורר את הסיבים המטפסים בתחתית שכבת התא Purkinje ולזהות את הזרמים הפוסט סינפטיים המעוררים סיבים מקבילים על ידי הפעלת סיבים מטפסים, להחיל גירוי דופק כפול. דיכאון דופק מזווג יש לראות באופן כל או אף אחד בקורלציה עם העלייה בעוצמת הגירוי. בניסוי מייצג זה, בשילוב של גירוי סיבים מקביל אחד וגירוי סיב טיפוס אחד בתנאי מהדק הנוכחי שימשו להכנת הפרוסה.צורתו של היתד המורכבת שהושרתה על ידי הגירוי ההחדרה הייתה דומה לזו שהושרתה על ידי גירוי הסיבים המטפס לבדו עם הספימלט התלול הראשון ואחריו שניים עד שלושה ספייפלים. ספייק מורכב בצורת דומה נצפתה כאשר גירוי סיבים מקביל אחד היה אחריו 50 אלפיות שנייה מאוחר יותר על ידי מקבילה שנייה משכנעת וגירוי סיבים מטפס. בבדיקה זו בתנאי מהדק מתח באמצעות פתרון פנימי מבוסס צסיום, גירוי סיבים מקבילים היה ואחריו 50 אלפיות שנייה מאוחר יותר על ידי יישום במקביל של גירוי סיבים מקבילים שני depolarization סומטי.זרם פנימי התעורר על דפולאריזציה סומטית ממינוס 70 לאפס מיליבולטים זרם הזנב התעורר גם לאחר קוטביות. לבסוף, חמישה גירויים סיבים מקבילים ב 100 הרץ ניתנו בו זמנית עם depolarization סומטי בתנאי מהדק מתח. שוב, דור חוזר ונשנה של זרמים פנימיים עורר במהלך depolarization ואת זרם הזנב היה המושרה לאחר repolarization.כדי להעריך את הקשר בין cerebellar בע"מ ולמידה מוטורית בבעלי חיים גנים מניפולציה, פרוטוקולים מרובים יש להשתמש כדי לגרום בע"מ בתנאים פיזיולוגיים נעימים. אם המוח הקטן בע"מ הוא דמיינה בבעלי חיים שעברו מניפולציה גנטית לאחר למידה מוטורית, הקשר הסיבתי ביניהם יכול להיבדק באופן ישיר יותר.

assessment-long-term-depression-induction-adult-cerebellar

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מאמר זה מתאר פרוצדורות להכנת פרוסות בהיפוקמפוס של חולדות העכברים הטרנסגניים לחקר שינויים סינפטיים הקשורים להזדקנות המוח הקשורים לגיל מחלות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר.

הכנת פרוסות בהיפוקמפוס של חולדות חריפה העכברים הטרנסגניים לחקר שינויים Synaptic במהלך ההזדקנות עמילואיד פתולוגיה

שיטה זו מתארת ​​את הדור של תרבויות cerebellar organotypic ואת ההשפעה של גירויים מסוימים אפופטוטיים על הכדאיות של סוגי תאים שונים cerebellar.

תרבויות cerebellar Organotypic: אתגרים אפופטוטיים וזיהוי

בסרטון זה, נעשה שימוש בפרוסת מוח מוח של עכבר כדי לחקור אינטראקציות סינפטיות בין סיבים מקבילים, סיבים מטפסים ותאי פורקינג'ה, החיוניים לשליטה מוטורית. גירוי של סיבים מטפסים גרם לדיכאון ארוך טווח (LTD) בתאי פורקינג'ה, החליש את החוזק הסינפטי וכתוצאה מכך תגובה מופחתת לגירוי סיבים מקבילים.

אינדוקציה של דיכאון ארוך טווח בנוירונים של פורקינג'ה במוח הקטן בפרוסת מוח של עכבר

מחקרים הראו שגירוי זרם ישר טרנס-גולגולתי קתודלי יכול לייצר השפעות מדכאות על התקפים עמידים לתרופות. במחקר זה, תוכנן מערך ניסוי במבחנה שבו הוערכו גירוי הזרם הישר ורישום מערך מרובה אלקטרודות של פעילות דמוית התקף בהכנת פרוסות מוח של עכברים. פרמטרי הגירוי בזרם ישר הוערכו.

גירוי ישיר שוטף הקלטת מערך רבה-אלקטרודה של פעילות כמו-תפיסת עכברי הכנת פרוסת המוח

פרוטוקול זה מדגים יישום אופטימיזציה N-מתיל-D-glucamine (NMDG) שיטת שחזור מגן המוח פרוסה ההכנה. ניסוח מדיה בודד משמש להשיג באופן אמין פרוסות המוח בריא של בעלי חיים בכל גיל, וגם עבור יישומים שונים ומגוונים ניסיוני.

הכנת פרוסות המוח חריפה באמצעות אופטימיזציה N-מתיל-D-שיטת שחזור מגן glucamine

פרוטוקול זה מתאר את הייצוב של רמת החמצן נפח קטן של מאגר ממוחזר, היבטים מתודולוגיים של הקלטה פלסטיות סינפטית תלויי-פעילות המשוקע פרוסות בהיפוקמפוס חריפה.

הקלטה הפלסטיות הסינפטית בפרוסות בהיפוקמפוס חריפה, בהשתתפות של מיחזור - בנפח מצומצם, זלוף- ומערכת ועלייתו-סוג תא

כאן אנו מציגים שיטה להכין organotypic פרוסה תרבויות מן המוח הקטן העכבר מיאלין, צביעת על-ידי אימונוהיסטוכימיה מתאים לחקור מנגנונים של myelination ו- remyelination במערכת העצבים המרכזית.

Immunostaining של Myelinating Organotypic פרוסה אסטרוציטומה תרבויות והכנה

תרביות פרוסות אורגאותיות הן כלי רב-עוצמה לחקר תהליכים נוירוהתפתחותיים או ניווניות. כאן, אנו מתארים פרוטוקול כי מודלים המוות הנוירולוגי של תאים Purkinje בתוך העכבר המוח פרוסה בתרבויות. שיטה זו עשויה להועיל מחקר בגילוי של תרופות נוירוהגנה.

הישרדות התאים purkinje בתרביות פרוסה בלבלר

זהו פרוטוקול להכנת פרוסה חריפה מהיפוקמפוס עכבר מבוגר ומזדקן המנצל את התסיסה הקרדיאלית וחיתוך פרוסה עם NMDG-aCSF קר כקרח כדי להפחית את הנזק היפוקסי לרקמות. הפרוסות המתוברות נשארות בריאות במשך שעות רבות, ומתאימים לטלאים ארוכי טווח ולהקלטות שדה.

מזעור היפוקסיה בפרוסות היפוקמפוס מעכברים מבוגרים ומזדקנים

כאן, הוא מדגים כיצד מודל של פגיעת ראש סגור ער יכול לשמש לבחינת ההשפעות של פגיעה מוחית טראומטית קלה חוזרת ונשנית (r-mTBI) על פלסטיות סינפטית בהיפוקמפוס. המודל משכפל תכונות חשובות של r-mTBI בחולים ומשמש בשילוב עם אלקטרופיזיולוגיה חוץ גופית .

הערכת שינויים בפלסטיות סינפטית באמצעות מודל פגיעת ראש סגורה ערה של פגיעה מוחית טראומטית קלה

חקור אינדוקציה של דיכאון לטווח ארוך בתאי פורקינייה במוח הקטן בחיות עם מניפולציה גנטית. שיטות אלקטרופיזיולוגיות מסייעות להבנת הפלסטיות הסינפטית וקשרה ללמידה מוטורית.

הערכה של האינדוקציה לטווח ארוך של דיכאון פרוסות למבוגרים בלבד

גלה סרטונים נוספים