Name: זיהוי של אינוזיטול פוספט או זרחן אינטראקציה חלבונים על-ידי כרומטוגרפיה של אהדה מצמידים לאבן חשופה מערבית או ספקטרומטר המסה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: למד לזהות חלבונים המקשרים לאינוזיטול פוספט וזרחן אינטראקציה באמצעות כרומטוגרפיית אהדה. שיטה רגישה ולא רדיואקטיבית לבידוד חלבונים וניתוחם בספקטרומטריית מסה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מדעי הטבע והמועצה לחקר ההנדסה של קנדה (NSERC, RGPIN-2019-04658); השקת NSERC גילוי תוספת עבור חוקרים קריירה מוקדמת (DGECR-2019-00081) ועל ידי אוניברסיטת מקגיל.

. לסופר אין מה לגלות

הזיהוי של חלבונים התאגד ל-IPs או לפיס הוא קריטי להבנת התפקוד התאי של מטבוליטים אלה. כרומטוגרפיה של אהדה מצמידים לאבן החשופה המערבית או לספקטרומטר מסה מציעה הזדמנות לזהות את החלבונים באינטראקציה של IP או PI ומכאן לקבל תובנות על התפקוד הרגולטורי שלהם. שב ס או פיס כימית מתויג [למשל, Ins (1, 4, 5) P3 כימית מקושרים biotin] ו מקושרות לחרוזי agarose דרך streptavidin או נתפס על ידי חרוזים streptavidin מגנטיים מאפשר את הבידוד של אינטראקציה חלבונים אשר יכול להיות מזוהה על ידי המוני ספקטרומטריה או אבן חשופה מערבית. הפרוטוקולים המתו...

אינוסיטול פוספטים (IPs) ו פוספהונוסידים (פיס) לשחק תפקיד מרכזי בביולוגיה איקריוטים באמצעות התקנה של תהליכים סלולריים כגון השליטה בביטוי הגנים1,2,3, שלפוחית הסחר 4, שינוי האותות של5,6, מטבוליזם7,8,9, ופיתוח8,10. הפונקציה התקינה של מטבוליטים אלה תוצאות מהיכולת שלהם אינטראקציה עם חלבונים ובכך לווסת את תפקוד החלבון. עם כריכה על ידי חלבונים, IPs ו-פיס עשויים לשנות את היווצרות חלבון11, פעילות קטליטי12, או אינטראקציות13 ומכאן להשפיע על הפונקציה התאית. שב ס ו-פיס מופצים בתאי משנה מרובים, כגון: גרעין2,3,14,15, אנפלזמית ברשת16,17, פלזמה ממברנה1 ו ציטוסול18, המשויכים לחלבונים3,19 או עם rnas20.
המחשוף של הממברנה המשויכת PI (4, 5) P2 ידי פוספוליפדאז C תוצאות בשחרור של Ins (1, 4, 5) P3, אשר יכול להיות זרחנים או deated על ידי הקיסים IP ו פוספאטטיות, בהתאמה. שב ס מולקולות מסיסים שיכולות לאגד חלבונים ולהפעיל פונקציות רגולטוריות. לדוגמה, Ins (1, 4, 5) P3 ב מטזוזה יכול לשמש כשליח השני על ידי מחייב IP3 קולטנים, אשר מעורר שינויים בקולטן ובכך לשחרר של Ca2 + מן חנויות תאיים11. Ins (1, 3, 4, 5) P4 נקשר לקומפלקס הימרחליקלז ומסדיר הרכבה ופעילות של מורכבות חלבון13. דוגמאות אחרות של הפונקציה התקינה של IPs כוללות את השליטה של ארגון כרומטין21, rna תחבורה22,23, RNA עריכה24, ושעתוק1,2,3 . לעומת זאת, הפיס משויך לעתים קרובות לגיוס חלבונים לקרום הפלזמה או לקרומים האורגונל25. עם זאת, המאפיין המתעוררים של פיס הוא היכולת לקשר עם חלבונים בסביבה לא קרומי3,15,19,26. זהו המקרה של הגורם לקולטן גרעינית, אשר פונקציה שליטה ההמרה מוסדר על ידי PI (3, 4, 5) P319, ו-פולי פולימראז אשר פעילות אנזימטית מוסדר על ידי הגרעין PI (4, 5) P226. תפקיד רגולטורי עבור IPs ו-פיס הוצג באורגניזמים רבים כולל שמרים22,27, תאים מוחיים19,23, דרוסוהילה10 ותולעים28. המשמעות היא התפקיד של מטבוליטים אלה בטריאנוזומים, אשר התפצל מוקדם מן השושלת איקריוטית. מטבוליטים אלה לשחק תפקיד חיוני בטריאנוסומה ברוסייס1 בקרת שליטה,3, פיתוח8, ארגונית biogenesis ו חלבון התנועה 29,30 , מיכל בן 31 , 32, והם מעורבים גם פיתוח וזיהום של פתוגנים T. cruzi33,34,35, טוקסופלזמה36 ו פלמודיום מיכל 5 , 37. מכאן, הבנת התפקיד של IPs ו-הפיס בטריאנוזומים עשויים לסייע להבהיר פונקציה ביולוגית חדשה עבור מולקולות אלה ולזהות מטרות של סמים חדשניים.
הספציפיות של חלבון ו-IP או כריכת PI תלוי בתחומים של אינטראקציה חלבונים ואת המצב זירחון של אינוזיטול13,38, למרות אינטראקציות עם החלק השומנים של פיס גם מתרחשת19. מגוון של כתובות ה-Ip ו-פיס ושינוי שלהם מספק מנגנון הסלולר גמיש לשליטה בתפקוד החלבון אשר מושפע על ידי זמינות מטבוליזם ושפע, המצב של זירחון של inositol, וחלבון אהדה של אינטראקציה1,3,13,38. למרות כמה תחומים חלבונים מאופיינים היטב39,40,41, למשל, pleckstrin הומולוגיה תחום42 ו SPX (SYG1/Pho81/XPR1) תחומים43 ,44,45, כמה חלבונים אינטראקציה עם IPs או הפיס על ידי מנגנונים שאינם ידועים. לדוגמה, חלבון activator 1 (RAP1) של T. brucei חסר הקאנוני התחומים מחייב pi אבל אינטראקציה עם pi (3, 4, 5) P3 ושליטה שעתוק של גנים המעורבים וריאציה אנטי הגניים3. כרומטוגרפיה וניתוח הספקטרומטר ההמוני של החלבונים בעלי אינטראקציה של ip או pi מתוך טריאנומין, שמרים או תאי מיונקים זיהו מספר חלבונים ללא מחשבים מבוססי IP או pi-כריכה מסוג8,46, 47. הנתונים מציעים מחשבים נוספים שאינם מאופיינים בחלבון שתאגד לאותם מטבוליטים. מכאן, הזיהוי של חלבונים האינטראקציה עם IPs או הפיס עשוי לחשוף מנגנונים חדשניים של האינטראקציה חלבון-מטבוליט ופונקציות חדשות הרגולציה הסלולר עבור אלה מולקולות קטנות.
השיטה המתוארת כאן מעסיקה כרומטוגרפיה של אהדה בשילוב עם הדגמים המערביים או ספקטרומטר המסה כדי לזהות חלבונים הקושרים ל-IPs או לפיס. הוא משתמש ב-IPs biotinylated או ב-"פיס" המקושרים לstreptavidin בעלי מבטים לחרוזים או לחילופין, שנתפסו באמצעות חרוזים מגנטיים streptavidin-מצוייביים (איור 1). השיטה מספקת זרימת עבודה פשוטה רגישה, לא רדיואקטיבית, ליפומי-חינם, והיא מתאימה לזיהוי הכריכה של חלבונים מתאי ליטים או חלבונים מטוהרים3 (איור 2). ניתן להשתמש בשיטה ללא תווית8,46 או מצמידים לחומצות אמינו ממותגים בעלי שמות מספרים מבוססי חומצה אמימטריה47 כדי לזהות חלבונים של IP או PI-מחייב מדגימות ביולוגיות מורכבות. מכאן, שיטה זו היא חלופה לכמה שיטות זמין ללמוד את האינטראקציה של IPs או הפיס עם חלבונים סלולריים יסייע להבין את התפקוד הרגולטורי של מטבוליטים אלה בטריאנוזומים ואולי eukaryotes אחרים.

<table><tbody><tr><td>אצטון</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>650501</td><td>קטון</td></tr><tr><td>אצטוניטריל</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>271004</td><td>ממס&nbsp;</td></tr><tr><td>אמוניום ביקרבונט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A6141</td> צנטריפוגת <td>מלח אנאורגנית</td></tr><tr><td>Avanti J6-MI</td><td>בקמן קולטר</td><td>אוונטי J6-MI</td><td>צנטריפוגה לנפחים גדולים (למשל, 1 ליטר)</td></tr> <tr><td>בקבוקי צנטריפוגה</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>B1408</td><td>בקבוקים לצנטריפוגה של 1 ליטר של תרבית</td></tr><tr><td>חרוזי בקרת</td><td>Echelon</td><td>P-B000-1 מ"ל</td><td>מגיב כרומטוגרפיה זיקה - בקרה</td></tr><tr><td>סוכר D-(+)-גלוקוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G8270</td><td>, מוסף ב-PBS כדי לשמור על תאים ברי קיימא</td></tr><tr><td>דיתיותרייטול (DTT)&nbsp;</td><td></td><td>חומר מפחית</td> <td>1610610 Bio-Rad</td></tr><tr><td>Dynabeads M-270 Streptavidin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>65305</td><td>חרוזי סטרפטווידין לקשירה לליגנדים ביוטין</td></tr><tr><td>מעכב פרוטאז ללא EDTA קוקטייל</td><td>מעכבי פרוטאז</td><td>11836170001 רוש</td><td></td></tr><tr><td>חוצץ ריצה מאגר ריצה</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td>25 מ"מ Tris, 192 מ"מ גליצין, 0.1% SDS, pH 8.3</td></tr><tr><td>פלקון 15 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטיים</td><td>קורנינג מדעי החיים</td><td>430052</td><td>לצנטריפוגה תרביות 10 מ"ל</td></tr><tr><td>חומצה פורמית חומצה 106526</td><td>סיגמא-אולדריץ</td><td></td><td></td></tr>' <tr><td>גליצין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G7126</td><td>חומצת אמינו</td></tr><tr><td>HMI-9 מדיום תרבית תאים</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ME110145P1</td><td>מדיום תרבית תאים לצורות</td></tr> <tr><td>זרם הדם T. bruceiכתם חלבון אימפריאלי</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>24615</td><td>צביעת Coomassie לזיהוי חלבון ב-SDS/PAGE</td></tr><tr><td>Ins(1,4,5)P3 חרוזים</td><td>Echelon</td><td>Q-B0145-1ml</td><td>מגיב כרומטוגרפיה זיקה&nbsp;</td></tr><tr><td>מיידי&nbsp; ללא שומן&nbsp; יבש&nbsp; מילק</td><td>תומאס סיינטיפיק</td><td>C837M64</td><td>מגיב חוסם לכתמים מערביים</td></tr><tr><td>יודואצטמיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>I6125</td><td>מגיב אלקילציה לחלבוני ציסטאין או פפטידים</td></tr><tr><td>Lab&nbsp; מסובב</td><td>תומאס סיינטיפיק</td><td>1159Z92</td><td>לבדיקות קשירה</td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה LoBind</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13-698-793</td><td>צינורות קשירה נמוכים לחלבון לספקטרומטריית מסה</td></tr><tr><td>Nonidet&nbsp; P-40 (Igepal CA-630)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>21-3277</td><td>חומר ניקוי</td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010031</td><td>מצע</td></tr><tr><td>פרוקסידאז פיזיולוגי לכימילומינסנציה</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>32106</td><td>מצע לזיהוי נפיחות מערבית של חלבונים</td></tr><tr><td>טבליות קוקטייל מעכב פוספטאז</td><td>PhosSTOP Roche</td><td>4906845001</td><td>פוספטאז מעכבים</td></tr><tr><td>PI(3)P PIP חרוזים</td><td>Echelon</td><td>P-B003A-1ml</td><td>מגיב כרומטוגרפיה זיקה&nbsp;</td></tr><tr><td>PI(3,4)P2 PIP חרוזים</td><td>Echelon</td><td>P-B034a-1ml</td><td>מגיב כרומטוגרפיה זיקה&nbsp;</td></tr><tr><td>PI(3,4,5)P3 diC8</td><td>Echelon</td><td>P-3908-1mg</td><td>מגיב כרומטוגרפיה של זיקה&nbsp;</td></tr><tr><td>PI(3,4,5)P3 PIP חרוזים</td><td>Echelon</td><td>P-B345a-1ml</td><td>מגיב כרומטוגרפיה זיקה&nbsp;</td></tr><tr><td>PI(3,5)P2 PIP חרוזים</td><td>Echelon</td><td>P-B035A-1ml</td><td>מגיב כרומטוגרפיה זיקה&nbsp;</td></tr><tr><td>PI(4)P PIP חרוזים</td><td>Echelon</td><td>P-B004A-1ml</td><td>מגיב כרומטוגרפיה זיקה&nbsp;</td></tr><tr><td>PI(4,5)P2 diC8</td><td>Echelon</td><td>P-4508-1mg</td><td>מגיב כרומטוגרפיה של זיקה&nbsp;</td></tr><tr><td>PI(4,5)P2 PIP חרוזים</td><td>Echelon</td><td>P-B045A-1ml</td><td>מגיב כרומטוגרפיה זיקה&nbsp;</td></tr><tr><td>PI(5)P PIP חרוזים</td><td>Echelon</td><td>P-B005A-1ml</td><td>מגיב כרומטוגרפיה זיקה&nbsp;</td></tr><tr><td>תמיסת Ponceau S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7170</td><td>צביעת חלבון (0.1% [w/v] ב-5% חומצה אצטית)</td></tr><tr><td>אשלגן הקסציאנופרט(III)</td><td>מלח אשלגן Sigma-Aldrich</td><td></td><td>702587-nbsp;</td></tr><tr><td>PtdIns PIP חרוזים</td><td>Echelon</td><td>P-B001-1ml</td><td>מגיב כרומטוגרפיה זיקה&nbsp;</td></tr><tr><td>PVDF ממברנה</td><td>Bio-Rad</td><td>1620177</td><td>לכתמים מערביים&nbsp;</td></tr><tr><td>צנטריפוגה מקוררת</td><td>Eppendorf</td><td>5910 R</td><td>מיקרוצנטריפוגה לנפחים קטנים (למשל, 1.5 מ"ל)</td></tr> <tr><td>נתרן דודציל סולפט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>862010</td><td>חומר ניקוי</td></tr><tr><td>נתרן תיוסולפט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>72049</td><td>כימיקלים&nbsp;</td></tr><tr><td>רכזי ואקום</td><td>SpeedVac ThermoFisher Scientific</td><td>SPD120-115</td><td>ריכוז דגימה (למשל, לספקטרומטריית מסה)</td></tr><tr><td>צלוחיות T175 לתרבית תאים&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>159910</td><td>לגידול 50 מ"ל T. brucei תרבית</td></tr><tr><td>טריפסין, ספקטרומטריית מסה בדרגה</td><td>Promega</td><td>V5280</td><td>טריפסין לעיכול חלבון</td></tr><tr><td>אוריאה</td><td>סיגמה-אולדריץ'</td><td>U5128</td><td>ריאגנט דנטורינג</td></tr><tr><td>מערבולת</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>02-215-418</td><td>לתגובות</td></tr><tr><td>ערבוב מאגר העברת כתמים מערביים</td><td>Bio-Rad</td><td>1610734</td><td>25 מ"מ טריס, 192 מ"מ גליצין, pH 8.3 עם 20% מתנול</td></tr><tr><td>ווטמן&nbsp; נייר 3 מ"מ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>WHA3030861 נייר להעברת ווסטר</td></tr><tr><td>2-מרקפטואתנול (14.2 מ')</td> <td>Bio-Rad</td><td></td><td>1610710 חומר מפחית</td></tr><tr><td>2x Laemmli מאגר דגימה</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0737</td><td>מאגר טעינת חלבון</td></tr><tr><td>4&ndash; 20% מיני-פרוטיאן&nbsp; ג'ל חלבון טרומיים TGX</td><td>Bio-Rad</td><td>4561094</td><td>ג'ל לאלקטרופורזה של חלבון</td></tr><tr><td>4x Laemmli מאגר דגימה</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0747</td><td>מאגר טעינת חלבון</td></tr></tbody></table>

זיהוי של אינוזיטול פוספט או זרחן אינטראקציה חלבונים על-ידי כרומטוגרפיה של אהדה מצמידים לאבן חשופה מערבית או ספקטרומטר המסה

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

מלחי אינוזיטול ופוספוליזידים מווסת מספר תהליכים סלולריים ב-eukaryotes, כולל ביטוי גנטי, סחר בסמים, התמרה של אותות, חילוף חומרים, ופיתוח. מטבוליטים אלה לבצע פעילות תקינה זו על ידי איגוד לחלבונים, ובכך שינוי היווצרות חלבון, פעילות קטליטי, ו/או אינטראקציות. השיטה המתוארת כאן משתמשת בכרומטוגרפיה של זיקה בשילוב עם הספקטרומטר המסה או הכתמים המערביים כדי לזהות חלבונים הפועלים באינטראקציה עם מלחי אינוזיטול או פוספופנוסיידים. הפוספטים inositol או פוספיונוסיידים הם כימית מתויג עם biotin, אשר נלכד אז באמצעות streptavidin מצועם מעלה או חרוזים מגנטיים. חלבונים מבודדים על ידי הזיקה שלהם של קשירה המטולוליט, ולאחר מכן הודללו וזוהו על ידי ספקטרומטר המסה או בלוק המערבי. השיטה יש זרימת עבודה פשוטה רגיש, לא רדיואקטיבי, ליפומי-חינם, להתאמה אישית, תמיכה בניתוח של חלבון ואינטראקציה מטבלייט עם דיוק. גישה זו יכולה לשמש ללא תווית או בחומצה אמינית מתויג כמותית שיטות המסה כדי לזהות אינטראקציות חלבון-מטבוליט בדגימות ביולוגיות מורכבות או באמצעות חלבונים מטוהרים. פרוטוקול זה מותאם במיוחד לניתוח של חלבונים מטריאנוסומה ברוסייבי, אך ניתן להתאים אותו לטפילים פרוטוזוקיים, שמרים או מהיונקים.

אנליזה של RAP1 ו-PI (3, 4, 5) P3 אינטראקציה באמצעות כרומטוגרפיה של אהדה ובלוק מערבי דוגמה זו ממחישה את היישום של שיטה זו כדי לנתח את הכריכה של RAP1 מ t. brucei ליפוסט או על ידי רקומביננטי t. brucei RAP1 חלבון. ליזוטים של T. brucei מחזור הדם צורות לבטא hemagglutinin (HA)-מתויגים RAP1 שימשו בכריכה assays. RAP1 הוא חלבון מעורב השליטה transcript של פני השטח של שונות גליקופרוטאין (vsg) גנים3,48, אשר קידוד עבור חלבונים פני...

פרוטוקול זה מתמקד בזיהוי של חלבונים התאגד כדי אינוזיטול פוספטים או פוספופנוסיידים. היא משתמשת בכרומטוזיקה באמצעות מלחי הביוטיטול או פוספופנוסידים הנמצאים בדרך streptavidin לחרוזים או חרוזי מגנטים. אינוזיטול פוספט או פוספוליזיסיטייז מחייב חלבונים מזוהים על ידי בלוק מערבי או ספקטרומטריה מאסיבית.

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

אינוזיטול פוספט ופוספוינוזיטידים הם מטבוליטים שיש להם מספר פונקציות רגולטוריות באוקריוטים, כולל שליטה בביטוי גנים, סחר בחלבון, התמרת אותות ופיתוח תאים. הם מבצעים את התפקוד הרגולטורי הזה על ידי קשירה לחלבונים, ובכך משנים את קונפורמציית החלבון, הפעילות הקטאליטית או אינטראקציות החלבון. זיהוי חלבונים שנקשרים אינוזיטול פוספט או phosphoinositides חיוני כדי להבין כיצד מטבוליטים אלה לבצע את תפקידם הרגולטורי.פרוטוקול זה כולל זרימת עבודה פשוטה, שאינה רדיואקטיבית, נטולת ליפוזום ומשתמשת בריאגנטים הזמינים מסחרית. בשיטה זו, כרומטוגרפיה מוגמרת עם אינוזיטול פוספט ביוטינול או phosphoinositides, משמש כדי לבודד חלבונים אינטראקציה, הם מזוהים לאחר מכן על ידי כתם מערבי, או ספקטרומטריית מסה. לצורות זרם דם, לגדל תאי T.brucei לשלב יומן אמצע במדיה HMI-9, בתוספת 10% FBS, ב 37 מעלות צלזיוס, עם 5% פחמן דו חמצני.שמור על צפיפות התאים בין 800, 000 ל-1.6 מיליון תאים למיליליטר. כאשר מוכן, צנטריפוגה התאים ב 1600 פעמים G, ו בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. השליכו את העל-טבעי, והתינו בעדינות את גלולת הכדור ב-10 מיליליטר של PBS-G מחוממים מראש ב-37 מעלות צלזיוס כדי לשטוף את התאים.צנטריפוגה התאים ב 1600 פעמים G ו בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות כדי להשלים את הכביסה. חזור על הליך כביסה זה פעמיים נוספות. ואז תן שימוש חוזר את גלולה במיליליטר אחד של PBS-G.העבר השעיה זו לנקודה אחת חמש צינור מיליליטר, אז צנטריפוגה ב 1600 פעמים G במשך חמש דקות. השליכו את העל-טבעי, והתינו מחדש את גלולת האפס בנקודה אפסית חמישה מיליליטר של חיץ תיזה, בתוספת נקודה אחת חמש קוקטייל מעכבי פרוטאז X, וקוקטייל מעכב פוספטאז X אחד שהוקרן מראש על הקרח כדי לתפור את התאים. צנטריפוגה ליאזט ב 1400 פעמים G ו בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.לאחר מכן לאסוף את supernatant, אשר מכיל את חלבוני הטפיל שחולצו, לתוך נקודה אחת חדשה חמש מיליליטר צינור עבור משגיחי מחייב. הניחו בצד 5% מסך ה-lysate לניתוח כתם מערבי. לאסוף 50 microliters של אינוזיטול פוספטים או phosphoinositides גדמו חרוזים אגרוז, ולהוסיף להם 500 מיליליטר של חיץ מחייב.צנטריפוגה ב 1000 פעמים G לדקה אחת. השליכו את העל-טבעי, והתינו מחדש ב-50 מיקרוליטרים של חיץ מחייב כדי לצייד את חרוזים. השתמש חרוזים שאינם נדנוד כפקד, ולהשתמש חרוזים עם תצורות פוספט שונות כולל צורות שאינן פוספוריאט, כדי לשלוט עבור אינטראקציות ספציפיות.לאחר מכן, הוסיפו 50 מיקרוליטרים של חרוזי IP או PI לתא ליאזט או לחלבונים המטוהרים. שמור את נפח חרוזים בטווח של 10% מסך ה- lysate. במידת הצורך, השתמש במאגר איגוד כדי לכוונן את עוצמת הקול של תגובת האיגוד.הדגירה את התגובה במשך שעה אחת או לילה בארבע מעלות צלזיוס, תוך סיבוב בשעה 50 סל"ד. לאחר מכן, צנטריפוגה את התערובת ב 1000 פעמים G, וב ארבע מעלות צלזיוס במשך דקה אחת. הסר את supernatant, ולשמור את גלולה, הקפד לשמור על 5% של supernatant לניתוח כתם מערבי.לאחר מכן הוסיפו מיליליטר אחד של חיץ כביסה והקש או ערבב את הצינור כדי להשתמש שוב בסרף. צנטריפוגה התגובה ב 1000 פעמים G, וב ארבע מעלות צלזיוס לדקה אחת, ולהשליך את העל טבעי. חזור על תהליך זה עבור סך של חמש שטיפות.לאחר מכן, להוסיף 50 microliters של חיץ 2X Laemmli בתוספת 710 מילימולר 2-mercaptoethanol כדי חרוזים. הקש או מערבולת כדי לערבב, ולדלל את החלבונים. לאחר מכן, מחממים ב 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, וצנטריפוגה ב 10, 000 פעמים G במשך דקה אחת.לאסוף את supernatant, או להקפיא את eluate במינוס 80 מעלות צלזיוס, או להמשיך לניתוח כתם המערבי. השיטה המוצגת כאן משמשת לניתוח הכריכה של PIs על ידי חלבון מפעיל מדכא 1 מ T.brucei lysate, או על ידי חלבון רקומביננטי T.brucei מדכא-activator 1 חלבון. כמו RAP1 חסר תחומים מחייב PI קנוני, בדיקות מחייב מבוצעות עם PIs שאינם זרחן, או כי הם זרחן בעמדות שונות של טבעת אינוזיטול, ועם חרוזים עלה שאינם גדומים.ניתוח מערבי מראה כי RAP1 נקשר באופן מועדף על חרוזי PI(3, 4, 5)P3, אך הוא גם נקשר במידה פחותה ל- PI(4, 5)P2 חרוזים. עם זאת, הוא לא נקשר לכל PIs אחרים או גם חרוזים. כדי לבדוק אם RAP1 נקשר ישירות PIs, C מתויג סופני 6XHis חלבון RAP1 רקומביננטי מבוטא ומטוהר הומוגניות מ E.Coli.כתמים מערביים מראים כי הגדלת הריכוז של PI(3, 4, 5)P3, אך לא PI(4, 5)P2, מעכבת את האינטראקציה של RAP1 רקומביננטי עם חרוזים PI(3, 4, 5)P3. התוספת של אנזים PIP5Pase מטוהר T.brucei לתגובה משוחזר PI(3, 4, 5)P3 מחייב על ידי RAP1 רקומביננטי. זאת בשל PIP5Pase dephosphorylation של PI חינם(3, 4, 5)P3, ולכן מציין כי דפוס זרחון של מטבוליט זה חיוני עבור RAP1 שלנו מחייב.חלבוני T.brucei שנקשרים ל- Ins(1, 4, 5)P3 מזוהים לאחר מכן על ידי כרומטוגרפיה של זיקה ואחריה ספקטרומטריית מסה. ניתוח SDS-PAGE מראה העשרה בחלבונים שחמקו חטוזי Ins(1, 4, 5)P3, בהשוואה לחלבונים שחמקו מקרני הבקרה. ניתוח ספקטרומטריית מסה של החלבונים האלוטים זיהה מעל 250 חלבונים מהם 84 הועשרו ב- Ins(1, 4, 5)P3, בהשוואה לחרוזי בקרה.העשרת חלבונים הקשורים Ins(1, 4, 5)P3, לעומת חמוזי בקרה, בקורלציה עם אות החלבון שזוהה על ידי SDS-PAGE. שלב קריטי בפרוטוקול זה הוא השימוש בפקדים מתאימים, כדי להפלות ספציפי מאינטראקציות לא ספציפיות. אנו ממליצים להשתמש גם פדרוזים שאינם גדומים, וחרוזים עם אינוזיטול פוספט או פוספוינוזיטידים, תוך שימוש בתצורות פוספט שונות, כולל צורות שאינן פוספוסוריאטים.שיטה זו יכולה להיות מיושמת על טפילי פרוטוזואן חד-תאיים אחרים, כגון טריפאנוסומה קרוזי, לישמניה או פלסמודיום. זה יכול גם להיות מותאם בקלות אורגניזמים אחרים, כולל שמרים או תאים יונקים. שיטה זו יכולה להיות מצמד ספקטרומטריית מסה כמותית, כגון SILAC, כדי לזהות אינטראקציות דינמיות של חלבונים עם אינוזיטול פוספט או phosphoinostides.ב יכול גם להיות משולב עם שבר תת תאי, כדי לזהות חלבונים ספציפיים organelle להיקשר מטבוליטים אלה. גישה זו סייעה לזהות חלבונים שנקשרים אינוזיטול פוספט ופוספוינוזיטידים ב T.brucei, תאים יונקים, ושמרים. היא סייעה בזיהוי תחומי חלבון חדשים שנקשרים לפוספוינוזיטידים.היא סללה את הדרך להבנת הפונקציה הרגולטורית של מטבוליטים אלה, תפקידם בביטוי גנים, התפתחות תאים והתמרת אותות באוקריוטים. חלק מהריגנסים בפרוטוקול זה רעילים, או דליקים. השתמש בציוד מגן אישי, ובמידת הצורך, לעבוד ברדס אדים.

identification-inositol-phosphate-or-phosphoinositide-interacting

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

Pyrophosphates אינוסיטול לשחק תפקיד חשוב פתולוגיות אדם כגון סרטן, סוכרת, והשמנה, אך מנגנון הפעולה המדויק אינו עניין של מחלוקת. חוסר pyrophosphates אינוסיטול זמינים מסחרית הופכת מחקרים מפורטים בעייתי. כאן אנו מתארים פרוטוקול פשוט לייצר ולבודד מיליגרם של pyrophosphates אינוסיטול.

הכנת Pyrophosphates אינוסיטול איכות

Phosphoinositides מאותת שומנים שיחסית שפע במהירות משתנה בתגובה לגירויים שונים. מאמר זה מתאר שיטה למדידת השפע של phosphoinositides ידי תאים מטבולית תיוג עם -inositol מיו 3 H-, ואחרי חילוץ וdeacylation. glycero-inositides חולץ אז מופרדים על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעל ביצועים גבוהים ולכמת ידי זרימת נצנץ.

Radiolabeling וכימות של רמות סלולריות של Phosphoinositides ידי נצנץ זרימה מצמיד כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים

PI (4,5) P 2 מסדיר פונקציות סלולריות שונות, אך הארגון ננו שלה בקרום פלזמת התא הוא הבין היטב. על ידי PI תיוג (4,5) P 2 עם בדיקה ניאון כפול צבע התמזגו תחום Pleckstrin הומולוגיה, אנו מתארים גישה חדשנית ללמוד את PI (4,5) P 2 הפריסה המרחבית בקרום פלזמה ב ננומטר סולם .

הדמיה סופר-רזולוציה מולקולה בודדת של 4,5-bisphosphate phosphatidylinositol בקרום פלזמה עם רומן פלורסנט בדיקות

כאן אנו מציגים bilayer שומנים בדם בהקשר של פלטפורמת microfluidic ללמוד אינטראקציות חלבון- phosphoinositide בשיטה ללא תווית המבוססת על אפנון pH.

PIP על שבב: מחקר ללא תווית של אינטראקציות חלבון- phosphoinositide

המטרה של פרוטוקול זה היא תווית להעשיר, לזהות סובסטרטים של קינאז CK2 מתוך מדגם ביולוגיים מורכבים כגון תא lysate או homogenate הרקמה. שיטה זו ממנפת את ההיבטים הייחודיים של הביולוגיה CK2 למטרה זו.

זיהוי של סובסטרטים קינאז CK2 הרומן תוך שימוש בגישה הביוכימי רב-תכליתי

אנו מאופיינים חלבון קינאז חדש באמצעות גישות ביוכימיים חזקים: ניתוח כתמי אבן מערבית עם נוגדן ספציפי ייעודי על קווי תאים שונים ורקמות, אינטראקציות על ידי ניסויים coimmunoprecipitation, הפעילות של קינאז שזוהו על ידי המערב כתם באמצעות נוגדן ספציפי פוספהו ועל ידי γ [32P] ATP תיוג.

אפיון ברמה המולקולרית באמצעות גישות ביוכימיות איתנות של חלבון קינאז חדש

מתוארים היא זרימת עבודה פרוטאומניקה לזיהוי שותפים אינטראקציה חלבונים מתוך שבר גרעיני subcellular באמצעות העשרת זיקה חיסונית של חלבון נתון של ריבית ותוויות המסה חינם התווית. זרימת העבודה כוללת שבירה תת-תאית, immunoprecipitation, סינון הכנה לדוגמה, ניקוי לא מקוון, ספקטרומטר מסה וצינור ביואינפורמטיקה במורד הזרם.

Immunoprecipitation ללא תווית של זרימת עבודה בהיקפים גדולים של החברה ליצירת פרופיל רב-ממדי של Interactome גרעינית

כאן אנו מתארים חילופי אניון חזקים כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים של [3H]-מיו-אינוזיטול תווית שתילים אשר היא שיטה רגישה מאוד כדי לזהות ולכומת פוליפוספטים אינוזיטול בצמחים.

מיצוי וכימות של פוליפוספטים לאנוזיטול מסיסים עם תיבול רדיו ממין צמחי שונים באמצעות SAX-HPLC

מתואר הליך לאלקטרופורזה נימית אלקטרופורזה ספקטרומטריית מסת יינון עבור הכמות המוחלטת של אינוזיטול פירופוספטים מתמציות תאי יונקים.

כמות מוחלטת של אינוזיטול פירופוספטים על ידי אלקטרופורזה נימית אלקטרוספריי ספקטרומטריית מסה יינון

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הכנת דגימה וניתוח נתונים לכימות זרחון חלבונים באמצעות מבחן משיכה משופר של מולקולה בודדת כלפי מטה (SiMPull).

בדיקה ממוטבת של משיכה במולקולה בודדת לכימות של זרחון חלבונים

כאן אנו מציגים פרוטוקול להעשרת פוספטזות פוספופרוטאין אנדוגניות והחלבונים המתקשרים ביניהן מתאים ורקמות וזיהוי וכימות שלהם על ידי פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסות.

גישה מבוססת ספקטרומטריית מסות לזיהוי פוספטזות פוספופרוטאין והאינטראקציות שלהם

למד לזהות חלבונים המקשרים לאינוזיטול פוספט וזרחן אינטראקציה באמצעות כרומטוגרפיית אהדה. שיטה רגישה ולא רדיואקטיבית לבידוד חלבונים וניתוחם בספקטרומטריית מסה.

זיהוי של אינוזיטול פוספט או זרחן אינטראקציה חלבונים על-ידי כרומטוגרפיה של אהדה מצמידים לאבן חשופה מערבית או ספקטרומטר המסה

גלה סרטונים נוספים