Name: כביסה-החוקה בסיוע מחדש של רקומביננטי דרוזולה אטלסטין ליפוזומים בשביל השומנים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: למד שחזור חלבון Drosophila atlastin לליפוזומים באמצעות מדידת ערבוב שומנים מבוססת FRET. שיטה זו מאפשרת חקר יעיל של חלבוני ממברנה ומנגנוני התמזגות תאית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד ר מיכאל שטרן והמעבדה שלו על התובנות והמשוב שלהם על פרויקטים הקשורים באטלסטין. עבודה זו נתמכת על ידי המכון הלאומי של מדעי הרפואה הכללית [R01GM101377] ואת המכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות שבץ [R01NS102676].

1. טיהור של GT-DAtl-His8
<ol><li>
ביטוי חלבונים והכנה ליפוסט
	<ol>
<li>המרה BL21 (DE3) E. coli עם מבנה Gt-datl-His8 בpGEX4-T32 ובחר על צלחת אמפיצילין.</li>
		<li>בחר טרנספורנט בודד ו-האיחסן 5 מ ל של LB + אמפיצילין (5 μL של 100 mg/mL אמפיצילין) בצינור התרבות 14 מ ל ו-דגירה ב -25 ° צ' עם טלטול ב 200 סל ד עבור 6-8 h. הערה: בשל ביטוי דולף, זה לא מומלץ לדגירה בטמפרטורות גבוהות יותר. גידול ב -25 ° c מפחית את צבירת החלבון בתקופת גידול זו.</li>
		<li>איחסן 200 mL של LB + אמפיצילין עם 1 מ ל של התרבות 5 מ"ל ו-דגירה לילה (~ 15-18 h) ב 25 ° c.</li>
		<li>למחרת בבוקר, לקצור את התאים על ידי צנטריפוגה (2,000 x g עבור 10 דקות) ו להשעות מחדש ב 5 מ ל של LB.</li>
		<li>אינוחסן 4 L של LB + אמפיצילין ולמדוד OD600 (0.05 – 0.15). מודטה ב -25 ° c עם טלטול. הערה: שמור חלק מהמדיה לשמש ריק עבור OD600 מדידות לפני הוספת חיידקים.</li>
		<li>למדוד OD600 כל שעה עד שהוא מגיע OD בין 0.4 – 0.5. בשלב זה, הפחת את הטמפרטורה ל -16 ° c.</li>
		<li>לגרום עם 0.2 mM IPTG (800 μL של 1 M מניות), 10 דקות לאחר החממה מגיע 16 ° c. דגירה לילה (~ 15 – 18 h) ב 16 ° c. הערה: הטמפרטורה התחתונה משפרת את התשואה של חלבון פונקציונלי על ידי הפחתת הצבירה של atlastin.</li>
		<li>למחרת בבוקר, לקצור את התאים על ידי תפרידו ב 7,500 x g ב 4 ° c.</li>
		<li>השהה מחדש את התאים ב-200 mL של A200 (25 מ"מ HEPES (pH 7.4) ו 200 mM KCl).</li>
		<li>צנטריפוגה את התאים ב 11,000 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.</li>
		<li>להשעות את הגלולה ב 40 mL של מאגר שבירת (A200 ועוד 10% גליצרול, 2 מ"מ 2-mercaptoethanol, 4% טריטון X-100 (TX100), הסרבזים 40mM, ואחד EDTA ללא מעכב פרוטאז הלוח קוקטייל. הערה: הוסף TX-100 לאחר השעיית מחדש כדי להימנע מיצירת בועות קצף.</li>
		<li>לעבור דרך המחט 18 גרם ולהפעיל את התאים באמצעות המשטר תא שלוש פעמים ב ~ 10,000 psi.</li>
		<li>צנטריפוגה את התמצית ב 125,000 x g עבור 1 h. הערה: באופן אופציונלי לפזר את הגלולה 1:2 (w:v) ב 8 M אוריאה ו nutate בטמפרטורת החדר בלילה. אוריאה כמו denaturant יהיה לפזר באיטיות כל החלבון מלא מסיסים בניתוח SDS-PAGE. שמור 1 μL לצורך ניתוח כתמי הנייר של SDS-PAGE ו-Coomassie.</li>
		<li>לסנן את התמצית באמצעות 0.45 יקרומטר צלולוזה מסנן קרום סטרילי כדי להסיר חיידקים פסולת בקטריאלי גדול. הערה: באופן אופציונלי, שמור 1 μL לצורך ניתוח הכתמים בעמוד SDS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
טיהור חלבונים באמצעות כרומטוגרפיה של אהדה
	<ol>
<li>טען את הליפוסט המסונן אל מכרומטוטור מתכת כרומטוגרפיה (IMAC) שרף מטען עם Ni2 +, טרום באופן מבוקר עם מאגר הסרמזים נמוך (A100 ועוד 10% גליצרול, 2 מ"מ 2-mercaptoethanol, 1% TX-100, 40 מ"מ הסרמדול) בקצב של 1 מ"ל/ דקות ב-4 ° c.</li>
		<li>שטוף את הטור עם 25 מ ל של A100 ועוד 10% גליצרול, 2 מ"מ 2-mercaptoethanol, 0.1% Anapoe X-100, 40 מ"מ שנאפיאזול עם שיעור של 1 מ"ל/min ב 4 ° c. החלבון עם מעבר ליניארי של 30 מ ל של שנדוראזול מ 40 מ"מ עד 500 מ"מ, ו 5 מ ל לשטוף ב 500 mM.</li>
		<li>בריכה יחד שיא שברים ו-מודטה עבור 1 h ב 4 ° c עם חרוזים מתנפחות GSH-Agarose בעבר נפוחות במים ו משקל ב A100 עם 10% גליצרול, 2 מ"מ 2-mercaptoethanol, 0.1% Anapoe X-100, ו 1 מ"מ EDTA. הערה: חרוזים GSH-Agarose יכול להיות נפוח בשנת 50 mL של מים ביום לפני ו מודבטים לילה ב 4 ° c, או עבור 1 h ב RT. כדי להסיר מים ומאגר השפה, צנטריפוגה ברוטור דלי מנופף ב 500 x g עבור 1 דקות ללא בלם. . עם מחט בעלת 26 גר'</li>
		<li>גלולה GSH-Agarose חרוזים על ידי תפרידו ברוטור דלי מנופף ב 500 x g ללא בלימה ולהסיר supernatant ליפוסט על ידי השאיפה עם מחט g 26.</li>
		<li>להעביר את החרוזים ל 10 mL בטור polyprep ולשטוף חמש פעמים עם 5 מ ל של מאגר equilibration (עם 10% גליצרול, 2 מ"מ 2-mercaptoethanol, 0.1% Anapoe X-100, ו 1 מ"מ EDTA) על ידי תפרידו ב 500 x g.
</li>
		<li>החלבון עם 1 – 1.5 מ ל של מאגר שיווציה בתוספת 10 מ"מ מופחת הגלוטתיון. . והקפאת מבזק בחנקן נוזלי חלבון יכול להיות מאוחסן ב-80 ° c ללא הגבלה. הערה: התאם את ה-pH של מאגר משחרל 7.4.</li>
		<li>מכמת ריכוז חלבון על ידי שיטת החלבון שחור amido9 ולהעריך טוהר על ידי sds-עמוד וכתמים coomassie.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. החוקה של רקומביננטי אטסטין ליפוזומים
<ol><li>ליפוכמה הפקה על ידי שיטת ההבלטה מיכל עשור<ol>
<li>להפוך מניות לערבב השומנים ב כלורופורם (10 מ"מ השומנים הכולל). השומנים הנחוצים הם 1-palmitoyl-2-oleoyl-גליקו-3-פוספולולין (POPC), 1, 2-dioleoyl-sn-גליקו-3-פואהו-ל-סרין (DOPS), 1, 2-dioleoyl-sn-גליצארו-3-פוספולאנאואמין-N-(7-ניטרו-2-1, 3-בנזוקסאזיול -4-yl) (NBD-DOPS), ו-1, 2- דיפלמיטאואיל-sn-גליקו-3-פוספופאנאואמין-N-(lissamine rhodamine B) (Rh-DPPE). איקטור ליפוזומים מורכב POPC: DOPS (85:15 היחס הטוחנת) ואת ליפוזומים התורם של POPC: לחות: Rh-PE: NBD-PE (83:15:1.5: היחס הטוחנת של 1.5). הערה: בעוד POPC: השומנים DOPS תערובות שימשו באופן מסורתי עבור השומנים שומנים מבחנה assays, קומפוזיציות שומנים חלופיים עשוי להיות מותאם למטרות ניסיוני שונים. POPC: ליפוזומים DOPS הם יציבים מאוד קשה לפתיל, ולכן הוא מערכת מחמירה מאוד עבור היתוך.</li>
		<li>להוסיף 1 μCi/mL של L-α-dipalmitoyl-פוספריסטיליולין (כולין מתיל-3H) לתערובות שומנים על מנת לקבוע ריכוזי השומנים בשלבים מאוחרים יותר על ידי ספירת הטעמים הנוזליים. שמור לפחות 8 μL של מניה זו.</li>
		<li>העבר כמות רצויה של תערובות השומנים לצינורות זכוכית חלמיש.</li>
		<li>יבש את תערובות השומנים תחת זרם עדין של N2 גז עבור ~ 10 דקות עד לא כלורופורם יותר הוא גלוי.</li>
		<li>יבש את הסרט השומנים עוד יותר בdesiccator על ידי שואב אבק במשך 30 דקות.</li>
		<li>להוסיף מספיק מימית A100 עם 10% גליצרול, 2 מ"מ 2-mercaptoethanol, ו 1 מ"מ EDTA לסרט השומנים ולהחזיר את הריכוז 10 מ"מ. להשעות את סרט השומנים על ידי vortexing בקלות עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר. מומלץ לספק מורטקסר שיכול להכיל צינורות זכוכית חלמיש.</li>
		<li>הקפא את שומנים הנוזלים בחנקן נוזלי עשר פעמים. לאחר הקפאת חנקן נוזלי, להפשיר את הליזומים על ידי מאפשר לפתרון לשבת בטמפרטורת החדר במשך 30 s, ואז להעביר למים עבור החלקה מהירה יותר. האופניים האלה להפשיר את ההקפאה מצמצמים שלפוחיות של מולטיצ'יני. זהירות: צינורות עלולים לפצח אם הם מכילים אמצעי אחסון גדולים יותר מ 0.5 mL ואם הם מועברים ישירות בטופס חנקן נוזלי למים.</li>
		<li>להעביר את השומנים באמצעות מסנני פוליקרבונט עם 100 בגודל נקבובית ננומטר 19 פעמים באמצעות מיני מכבש.</li>
		<li>קביעת ריכוז השומנים הכולל של ליפוזומים על-ידי ספירת שומנים הערה: חלק השומנים ניתן להשאיר מאחור צינורות זכוכית ו-mini-הבלטת der.<ol>
<li>הוסף 4 μL של מלאי שומנים וליפוזומים ב 3 מ ל של קוקטייל של שלוש הטעמים.</li>
			<li>מדידת ספירות ממוצע לדקה (CPMA) עבור מלאי וליפוזומים. ולחשב ריכוז ליפוזומים עם הנוסחה הבאה:<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59867/59867equ01.jpg">
</li>
		</ol>
</li>
		<li>אחסן את הליזומים ב -4 ° c עד שבוע. אחסון ארוך יותר אינו מומלץ כיפוזומים עשוי לצבור זמן ולהקטין את יעילות החוקה החוזרת.</li>
	</ol></li>
	<li>חוקה על ידי ניקוי התאגדות בסיוע ליפוזומים טרום בנוי
	<ol>
<li>לחשב את כמות המאגר, חלבון, ליפוזומים תוספת אבקת להיות מעורב יחד:<ol>
<li>קבע את אמצעי האחסון הכולל הרצוי. כרך זה מורכב של מאגר A100 עם 10% גליצרול, 2 מ"מ 2-mercaptoethanol, ו 1 מ"מ EDTA. כרכים פחות מ-250 μL אינם מתערבבים היטב בצינורות מיקרוצנטריפוגה של 0.5 mL.</li>
			<li>לחשב את נפח של ליפוזומים הדרושים לתת ריכוז השומנים הסופי של כ 1 מ"מ. הפחת את עוצמת הקול מאמצעי האחסון של המאגר.</li>
			<li>לחשב את נפח החלבון הדרוש כדי לתת את החלבון הרצוי יחס טוחנת שומנים (בדרך כלל 1:400). הפחת בהתאם את אמצעי האחסון של המאגר.</li>
			<li>לקבוע כמה אבקת כביסה נוספת יש להוסיף לרוויה הליזומים מכוון לניקוי יעיל ליחס השומנים(R אף) בין 0.64 – 0.8. זכור לשקול את תכשיר הניקוי המוסף עם החלבון. The (Rאף) נקבע על ידי המשוואה <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59867/59867equ02.jpg"> Dסך הכל ריכוז חומרי ניקוי ומים D הוא הריכוז של אבקת הניקוי monomeric (0.18 MM עבור TX-100 ו anapoe X-100 בנוכחות של חומרי ניקוי)4, . בסדר, 11</li>
		</ol>
</li>
		<li>ערבב את הפתרונות יחד בשפופרת 0.5 mL בסדר הבא: מאגר, חומרי ניקוי, חלבונים וליפוזומים. להוסיף את ליפוזומים במהירות מערבולת מיד עבור 5 s כדי המגון את התערובת.</li>
		<li>מודפה את התגובה בשעה 16:00. ב -4 ° c</li>
		<li>הפוך 0.2 g/mL ללא פוליסטירן מוקצף מכופף "להשתהות" במים. הערה: הפוך את הפוליסטירן מכופף חרוז "להשתהות" במהלך הקודם 1 h הדגירה בשלב 2.2.3.</li>
		<li>שוקלים 0.2 g של פוליסטירן מחרוזים כפופות והעברה לצינור מיקרוצנטריפוגה.</li>
		<li>דגה את החרוזים על ידי הוספת 1 מ ל של מתנול לצינור ולערבב עבור 1 דקות.. חרוזים של הדתחת ישקעו</li>
		<li>ממתנול ומוסיפים מים לחרוזים. תן את החרוזים לערבב עם מים עבור 5 דקות, ואז לבשל את המים. חזור ארבע פעמים, ולאחר מכן להביא את הפוליסטירן מכופף חרוז "משקה" לנפח 1 מ ל עם מים וריכוז סופי של 0.2 g/mL. הערה: החרוזים עדיין צריכים. להתיישב בתחתית הצינור . אם לא, דגה שוב להשתמש 21 G או מחט גבוה כדי להשקות מתנול ומים מחרוזים.</li>
		<li>לחשב את כמות הפוליסטירן מוקצף החרוזים הדרושים כדי לקלוט את כל חומרי הניקוי בכל מדגם. 1 גר' פוליסטירן מוקצף החרוזים סופג 70 מ ג של TX-100. כדי לחשב את עוצמת הקול של פוליסטירן adsorbent חרוז הצורך עבור כל תגובה, לחלק את הניקוי הכולל של התגובה (שלב 2.2.1.4) על ידי 70 mg, ולאחר מכן על ידי ריכוז של שאיפה חרוז (0.2 g/mL (שלב 2.2.7).</li>
		<li>העברת כמות מחושבת של קלקר adsorbent חרוז לתוך שפופרת 0.5 mL ומפתי את המים. הערה: גזור את סופו של 20-200 μL עצה כדי להעביר את החרוזים, מערבולת את הצינור רק לפני ליטוף כדי להשעות מחדש חרוזים התיישבו.</li>
		<li>הוסיפו את הדגימות לצינור ה0.5 mL המכיל פוליסטירן מחרוזים ומודטים את הדגימה של 1 h ב -4 ° c.</li>
		<li>חזרו פעמיים והשאירו חרוזים ישנים מאחור והעבירו את הדגימה לחרוזים טריים.</li>
		<li>הוסיפו את הדגימה לצינור רביעי עם חרוזים טריים ומודלון לילה (~ 15-18 שעות) ב -4 ° c.</li>
	</ol></li>
	<li>בבוקר, להסיר את המדגם מקלקר adsorbent חרוזים וכדורי אגרגטים מסיסים חלבון ידי תפרידו עבור 10 דקות ב 16,000 x g ב 4 ° c.</li>
	<li>לשחזר את הסופרנטאנט ולקבוע את הריכוז הסופי של השומנים על ידי ספירת הטעמים הנוזליים (ראה שלב 2.1.9.2). באופן אופציונלי, ריכוז החלבון עשוי להיקבע על ידי שיטת באמת חלבון שחור9. הערה: כדי לקבל הפרוטזיזומים, אנזימטיות מצריך להתבצע עם ליפוזומים טריים. אחסון ארוך ב-4 ° צ' או הקפאה מוביל להפסד משמעותי בפעילות atlastin.</li>
</ol>3. השומנים ערבוב Assays
<ol><li>הביאו את התורם והקבלה פרוטאוליפוזומים לריכוז של 0.15 mM כל אחד A100 עם 10% גליצרול, 2 מ"מ β-mercaptoethanol, 1 מ"מ EDTA ו 5 מ"מ MgCl2. כל תגובה (50 μL) יש להוסיף גם טוב בלבן שטוח 96 צלחת הבאר מתאים קריאות הזריחה. הכינו לפחות 4 תגובות כולל טרילקביט, ושליטה לא-GTP שלילית.</li>
	<li>מניחים את הצלחת בקורא לוחית מחוממת ב 37 ° c. למדוד את הזריחה NBD (עירור 460 nm ו פליטה 535 nm) עבור 5 דקות כל דקה.</li>
	<li>לגרום פיוז'ן על ידי הוספת 5 מ"מ GTP (5 μL של 50 mM GTP).</li>
	<li>מדוד את הקרינה הפלואורסצנטית כל דקה עבור 1 h.</li>
	<li>הוסף 5 μL של 2.5% w/v n-Dodecyl β-D-maltoside כדי לפזר את הפרוטאוליפוזומים ולמדוד את מקסימום NBD הזריחה. קרא את הזריחה של NBD במשך 15 דקות בכל דקה.</li>
</ol>4. ליפוקו מעבר באופן רציף12
<ol><li>אופציונלי לנתח את היעילות של החוקה מחדש על ידי הפלוציה בחני מאמר13.</li>
	<li>הכינו 80% ו-30% w/v iohexol ב A100 עם 10% גליצרול, 2 מ"מ 2-mercaptoethanol, ו 1 מ"מ EDTA. איוהקנול אינו מתמוסס בקלות, לכן יש להכין את היום לפני השינה ב -4 ° c.</li>
	<li>לערבב ביסודיות 150 μL של 80% iohexol מלאי עם 150 μL של מדגם פרוטאוליפוזומים כדי להביא אותו ל-40% iohexol. להוסיף את זה 5 x 41 mm2 שפופרת אולטרה ברור הימנעות בועות.</li>
	<li>שכבה 250 μL של 30% iohexol מלאי באיטיות על גבי המדגם כדי ליצור שכבה אמצעית. הימנע בועות והטרידה את השכבה התחתונה. על גבי השכבה האמצעית, לאט להוסיף 50 μL של A100 עם 2 מ"מ 2-mercaptoethanol ו 1 מ"מ EDTA.</li>
	<li>צנטריפוגה את מעבר הצבע ברוטור דלי מנופף ב 220,000 x g עבור 4 h ב 4 ° c עם האצה איטית ללא הפסקה.</li>
	<li>לקצור את השכבות של מעבר הצבע ולנתח ידי SDS-PAGE ו Coomassie כתם, הכמת ניתן לעשות על ידי densi, try. חלבון מחדש צריך לצוף לשכבה העליונה, בעוד אגרגטים חלבונים ושומנים בדם יהיה משקע בתחתית או בשכבה האמצעית.</li>
</ol>5. ניתוח כיוון של חלבון מחדש על ידי תרומבין פרוטפוליזיס
הערה: במבנה האטלסטין שדווח כאן יש מקום לחתוך את התרומבין בין סוף התגית של מסוף N-טרמינל לבין תחילת האטלסטין. Atlastin בכיוון הנכון יהיה לחתוך את האתר הזה נגיש הפרוטאז, בעוד חלבון בכיוון הלא נכון יהיה מוגן על ידי bilayer ליפיד.
<ol><li>כדי לאמת התמצאות לפחות 8 μL של מחדש את האוריינטציה החדשה.</li>
	<li>הוסף 8 μL של הפרוטאוליזומים ו 1 μL של 1 U/μL של תרומבין. מודטה ב 37 ° c בשביל 1 h.</li>
	<li>כיבוי הפרוטאז עם 1 μL של 5 מ"ג/mL של הקוקטייל מעכב הפרוטאז EDTA חינם ו דגירה של 30 דקות ב 37 ° c.</li>
	<li>לנתח את המדגם על ידי SDS-PAGE ו Coomassie כתם. חלק של חלבון ביקע ומלא ביקע עשוי להיקבע על ידי densi, try.</li>
</ol>

<ol><li>Chernomordik, L. V., Kozlov, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanics of membrane fusion.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 15, 675-683 (2008).</li>
<li>Orso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homotypic+fusion+of+ER+membranes+requires+the+dynamin-like+GTPase+Atlastin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Homotypic fusion of ER membranes requires the dynamin-like GTPase Atlastin.</a> Nature. 460, 978-983 (2009).</li>
<li>McNew, J. A., Sondermann, H., Lee, T., Stern, M., Brandizzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTP-dependent+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">GTP-dependent membrane fusion.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 529-550 (2013).</li>
<li>Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes%3A+application+to+energy-transducing+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1231, 223-246 (1995).</li>
<li>Düzgüneş, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Assays+for+Liposome+Fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Assays for Liposome Fusion.</a> Methods in Enzymology. 372, 260-274 (2003).</li>
<li>Wilschut, J., Duzgunes, N., Fraley, R., Papahadjopoulos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+mechanism+of+membrane+fusion%3A+kinetics+of+calcium+ion+induced+fusion+of+phosphatidylserine+vesicles+followed+by+a+new+assay+for+mixing+of+aqueous+vesicle+contents%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Studies on the mechanism of membrane fusion: kinetics of calcium ion induced fusion of phosphatidylserine vesicles followed by a new assay for mixing of aqueous vesicle contents.</a> Biochemistry. 19, 6011-6021 (1980).</li>
<li>Ellens, H., Bentz, J., Szoka, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton-+and+calcium-induced+fusion+and+destabilization+of+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Proton- and calcium-induced fusion and destabilization of liposomes.</a> Biochemistry. 24, 3099-3106 (1985).</li>
<li>Meers, P., Ali, S., Erukulla, R., Janoff, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+inner+monolayer+fusion+assays+reveal+differential+monolayer+mixing+associated+with+cation-dependent+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Novel inner monolayer fusion assays reveal differential monolayer mixing associated with cation-dependent membrane fusion.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1467, 277-243 (2000).</li>
<li>Schaffner, W., Weissmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+sensitive%2C+and+specific+method+for+the+determination+of+protein+in+dilute+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid, sensitive, and specific method for the determination of protein in dilute solution.</a> Analytical Biochemistry. 56, 502-514 (1973).</li>
<li>MacDonald, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-volume+extrusion+apparatus+for+preparation+of+large%2C+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Small-volume extrusion apparatus for preparation of large, unilamellar vesicles.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1061, 297-303 (1991).</li>
<li>Paternostre, M. T., Roux, M., Rigaud, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+membrane+protein+insertion+into+liposomes+during+reconstitution+procedures+involving+the+use+of+detergents.+1.+Solubilization+of+large+unilamellar+liposomes+%28prepared+by+reverse-phase+evaporation%29+by+Triton+X-100%2C+octyl+glucoside%2C+and+sodium+cholate%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents. 1. Solubilization of large unilamellar liposomes (prepared by reverse-phase evaporation) by Triton X-100, octyl glucoside, and sodium cholate.</a> Biochemistry. 27, 2668-2677 (1988).</li>
<li>Scott, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome+Fusion+Assay+to+Monitor+Intracellular+Membrane+Fusion+Machines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Liposome Fusion Assay to Monitor Intracellular Membrane Fusion Machines.</a> Methods in Enzymology. 372, 274-300 (2003).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+an+orthomyxovirus+matrix+protein+reveals+mechanisms+for+self-polymerization+and+membrane+association%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of an orthomyxovirus matrix protein reveals mechanisms for self-polymerization and membrane association.</a> PNAS. 114, 8550-8555 (2017).</li>
<li>Parlati, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+fusion+of+phospholipid+vesicles+by+the+%CE%B1-helical+core+of+a+SNARE+complex+in+the+absence+of+an+N-terminal+regulatory+domain%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient fusion of phospholipid vesicles by the α-helical core of a SNARE complex in the absence of an N-terminal regulatory domain.</a> PNAS. 96, 12565-12570 (1999).</li>
<li>Sugiura, S., Mima, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+lipid+composition+is+vital+for+homotypic+ER+membrane+fusion+mediated+by+the+dynamin-related+GTPase+Sey1p%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Physiological lipid composition is vital for homotypic ER membrane fusion mediated by the dynamin-related GTPase Sey1p.</a> Scientific Reports. 6, 20407(2016).</li>
<li>Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+tubular+endoplasmic+reticulum+network+with+purified+components%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components.</a> Nature. 543, 257-260 (2017).</li>
<li>Betancourt-Solis, M. A., Desai, T., McNew, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+atlastin+membrane+anchor+forms+an+intramembrane+hairpin+that+does+not+span+the+phospholipid+bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The atlastin membrane anchor forms an intramembrane hairpin that does not span the phospholipid bilayer.</a> Journal of Biological Chemistry. 293, 18514-18524 (2018).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

השיטה מתארת שיטה יעילה לטיהור, העצמה מחדש ומדידת פעילות היתוך של רקומביננטי atlastin. כדי להבטיח תשואה גבוהה של atlastin פונקציונלי כמה צעדים קריטיים יש לשקול. הביטוי של atlastin חייב להיעשות בטמפרטורות נמוכות (16 ° c) כדי למנוע צבירה ואחד צריך לכוון ריכוז סופי בין 0.4 – 1.5 mg/mL. מאוד חלבון מדלל לא יהיה מחדש בצורה אופטימלית ב 1:400 חלבון ליחס שומנים בדם. יעילות החוקה ניתן לנתח באופן אופציונלי על ידי התקליטונים המתואר כאן (איור 2). אחד היתרונות של ליפוזומים ציפה בחני הוא שהם יכולים להיות מו...

פיוז'ן ממברנה הוא תהליך קריטי בתגובות ביולוגיות רבות. בתנאים ביולוגיים, פיוז'ן ממברנה אינה ספונטנית ודורשת היתוך מיוחדים חלבונים כדי לזרז תגובות כאלה1. היתוך ממברנה הומוטיפקס מתווכת בעלי חיים על ידי הדינמיט הקשורים GTPase atlastin2. תפקידה של אטסטין במיזוג הומוטיפקס הינו יסוד לצמתים תלת-כלאליים ב-ER היקפית, המהווה רשת מחוברים באופן גדול של tubules הנמתחים ברחבי התא. Atins יש מורפולוגיה תחום שימור המורכב GTPase גדול, שלושה צרור סליל התחום האמצעי, עוגן ממברנה הידרופובי, וזנב קצר cytoplasmic C-טרמינל3. במחקרים בעלי מבחנה עם רקומביננטי דרוסופילה אטלסטין הראו שכאשר היוו ליפוזומים, הוא שומר על המאפיינים הפוגניים שלה. לא הצליחו ללכוד. את הפיוז במבחנה אנו מתארים כאן מתודולוגיה לטיהור GT ו-פולי היסטידין מתויג רקומביננטי דרוסוילה אטלסטין, ממנה אותו ליפוזומים, ואומר היתוך.
לימוד פיוז'ן ממברנה בחוץ גופית מציג אתגר כמו חלבונים fusogenic בדרך כלל יש עוגן קרום. כדי ללמוד אותם, יש צורך ליצור מחדש אותם למודל השומנים bilayers. Unilamellar שלפוחיות גדולות (אהובה) הם כלי שימושי כדי ללמוד אינטראקציות חלבון השומנים. אנו מציגים כאן מערכת כדי להפוך LUVs של קומפוזיציות השומנים שונים לחידוש חלבון והיתוך assays. החוקה של חלבונים אינטגרליים לתוך LUVs יכול להיות מושגת על ידי מגוון רחב של שיטות כולל, אורגני הממס בתיווך מחדש, מנגנונים מכניים, או חומרי ניקוי סיוע החוקה4. אנו מציגים כאן שיטה ליצור מחדש את דרוסופילה אטלסטין ליפוזומים מראש על ידי הסרת חומרי ניקוי. היתרונות של שיטת החוקה הזאת כוללים תשואות גבוהה לחוקה הכיוון הנכון של atlastin ב bilayer השומנים. בנוסף, באמצעות שיטה זו, החלבון אינו מיובש או חשוף ממיסים אורגניים ובכך שמירה על מבנה ותפקוד. בין החסרונות שלה, הנוכחות של דטרגנטים לא יכול להיות אידיאלי עבור כל החלבונים ואת פרוטאוליזומים הסופי יכול להיות כמה אבקת כביסה שולבו bilayer השומנים. דיאליזה נוספת ניתן להשתמש כדי לחסל יותר של כביסה. עם זאת, דיאליזה עשויה להימשך זמן רב ולכן יכול להוביל לאובדן פעילות החלבון.
הערכת פעילות היתוך של atlastin יכול להיקבע על ידי ערבוב שומנים בדם כפי שמתואר בעבר2. כאן, אנו להתוות שיטה עבור מדידת atlastin בתיווך פיוז'ן דרך N-(7-ניטרובנץ-2-oxa-1, 3-diazol-4-yl (NBD)/Lissamine rhodamine-B סולוניל (rhodamine) התווית שומנים. הסדר הזה דורש היתוך של התורם (מתויג) פרוטאוליפוזומים וקבלה (ללא תווית) פרוטאוליפוזומים. ניתן למדוד את השחרור במהלך התגובה כדילול של תורם – קבלה של זוג "שכותרתו" ליפוזומים "ליפוזומים" ללא תווית כתוצאה של ערבוב שומנים במהלך היתוך ממברנה (איור 1)5. בעוד שהוא משמש כפרוקסי לפיוז ממברנה, הוא מוגבל בהבחנה בין פיוז'ן ממברנה המיפיוז, מדינה שבה רק את העלונים החיצוניים לערבב. כדי לטפל בבעיה זו, חלופה היא מקופת העלעל החיצוני של NBD על ידי dithionite. בעקבות אותה מתודולוגיה כמו NBD/rhodamine ערבוב השומנים, לאחר העלעל העלון החיצוני כל שחרור הסריג NBD על ידי היתוך יהיה עקב העלון הפנימי ערבוב8.
היתוך אלטרנטיבי חלופי על ידי תוכן פנימי מימית ערבוב כתובת היתוך מלא רק5. דוגמאות לכך הם טרביום (Tb)/dipicolinic חומצה (dpa) בחני ו חומצה trisulfonic (נמלים)/pt-קסילן bis (pyridinium) ברומיד (dpa) בחני. בשחפת/DPA assays, בריכה של ליפוזומים עם שחפת מתחת למים מעורבבים והתמזגו עם ליפוזומים עם DPA שבאנקפסולציה; עם היתוך, הקרינה הפלואורסצנטית מוגברת באמצעות העברת אנרגיה פנימית מ DPA ל-Tb בתוך [Tb (DPA)3] קומפלקס3- כלציה6. לעומת זאת, עבור נמלים/DPX assays אומר, הנמלים פלואורסצנטי מוקף על ידי DPX7. בעוד מערכות אלה כתובת תוכן פנימי ערבוב, יותר מעמיק הכנה של ליפוזומים נדרש להסרת ריאגנטים שאינם מסופף, כמו גם אינטראקציה לא מכוונת של fluorophores.

<table><tbody><tr><td>10 מ"ל עמודות כרומטוגרפיה פולי-הכנה</td><td>Biored</td><td>731-1550</td><td></td></tr><tr><td>10 מ"מ x 75 מ"מ צינורות זכוכית צור</td><td>VWR</td><td>608225-402</td><td></td></tr><tr><td>קוטר 47 מ"מ, 0.45 &mu; m נקבוביות Whatman מסנני ממברנה סטריליים</td><td>Whatman</td><td>7141 104</td><td></td></tr><tr><td>96 צלחת לבנה היטב</td><td>NUNC</td><td>437796</td><td></td></tr><tr><td>Anapoe X-100</td><td>Anatrace</td><td>9002-931-1</td><td></td></tr><tr><td>משבש תאים</td><td>Avestin</td><td>Avestin Emulsiflex C3</td><td></td></tr><tr><td>DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (מלח נתרן))</td> <td>Avanti</td><td>840035P-10mg</td><td>DOPS</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Research organics Inc.</td><td>6381-92-6</td> קוקטייל מעכב פרוטאז נטול EDTA <td>חומצה אתילנדיאמין-טטראצטית</td></tr><tr><td>רוש</td><td></td><td>11873580001</td><td>מעכב פרוטאז מלא</td></tr><tr><td>Extruder</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z373400&nbsp;</td><td>מכבש בסיסי ליפוזופסאט</td></tr><tr><td>מערכת כרומטוגרפיה נוזלית GE Akta Prime</td><td>GE Pharmacia</td><td>8149-30-0006</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי אגרוז גלוטתיון</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>G4510-50 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>EMD</td><td>GX0185-5</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>36051-31-7</td><td>גואנוזין 5' טריפוספט נתרן מלח הידרט</td></tr><tr><td>HEPES, ללא חומצה</td><td>Omnipur</td><td>5330</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>fluka</td><td>5670</td><td></td></tr><tr><td>עמודת שרף כרומטוגרפיה של זיקה מתכתית (IMAC)</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>17040801 1 מ"ל HiTrap Chelating עמודות כרומטוגרפיה של זיקה מתכתית משותקת</td></tr><tr><td>Iohexol</td><td>תאגיד כימי ומדעי מדויק</td><td>AN 7050 BLK</td><td>Accudenz/Nycodenz</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>מוצרי מחקר בינלאומיים corp.</td><td>I56000-100.0</td><td>IPTG, L-גלוטתיון נטול דיאוקסאן</td></tr><tr><td></td><td>מופחת סיגמא-אולדריץ</td>' <td>G4251-5 גרם</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>פישר</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>אומניסולב</td><td>MX0488-1</td><td></td></tr><tr><td>NBD-DPPE (1,2-דיפלמיטויל-sn-גליצרו-3-פוספואתנולמין-N-(7-ניטרו-2-1,3-בנזוקסדיאזול-4-יל) (מלח אמוניום))</td> <td>Avanti</td><td>236495</td><td>NBD-DPPE</td></tr><tr><td>n-Dodecyl &beta;-D-maltoside</td><td>Chem-Impex International</td><td>21950</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי סופח פוליסטירן לא קוטביים</td><td>BioRad</td><td>152-3920</td><td>SM2 Biobeads</td></tr><tr><td>Nuclepore מסלול תחריט פוליקרבונט 19 מ"מ 0.1 &mu; m קרום נקבוביות</td><td>Whatman</td><td>800309</td><td></td></tr><tr><td>Optima LE80K צנטריפוגה אולטרה</td><td>בקמן קולטר</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פוספטידילכולין, L-&alpha;-dipalmitoyl [כולין מתיל-3H]</td> <td>ARC</td><td>ART0284</td><td>שומנים טיטריים</td></tr><tr><td>קורא צלחות</td><td>TECAN</td><td>TECAN אינסופי M200 קורא</td><td></td>צלחות</tr><tr><td>POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine)</td> <td>Avanti</td><td>850457C-25 מ"ג</td><td>POPC</td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>MP</td><td>151944</td><td></td></tr><tr><td>Rh-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (מלח אמוניום)))</td> <td>Avanti</td><td>236495</td><td>Rh-DPPE</td></tr><tr><td>נצנוץ קוקטייל</td><td>לאומי אבחון</td><td>LS-272</td><td>Ecoscint XR תמיסת נצנוץ לדגימות מימיות או לא מימיות</td></tr><tr><td>נצנוץ בקבוקונים</td><td>בקמן</td><td>592928</td><td>כובע סיבוב מהיר מיני פולי-Q בקבוקון</td></tr><tr><td>תרומבין</td><td>סיגמא</td><td>T1063-1kU</td><td>תרומבין מפלזמה אנושית</td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>פישר</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה ברורים במיוחד 5 מ"מ x 41 מ"מ</td><td>בקמן</td><td>344090</td><td></td></tr><tr><td>מערבולת 9 עד 13 מ"מ מחזיק צינור</td><td>VWR</td><td>58816-138</td><td>הכנס למערבולת צינורות</td></tr> <tr><td>זכוכית צורמחזיק הכנסת מערבולת</td><td>VWR</td><td>58816-132</td><td>מחזיק דרוש למחזיק צינור</td></tr><tr><td>מערבולת Vortexer</td><td>VWR</td><td>2.235074</td><td>Vortex Genie 2 דגם G560</td></tr> <tr><td>&beta;-mercaptoethanol ביולוגיה מולקולרית כיתה</td><td>Calbiochem</td><td>444203</td><td></td></tr></tbody></table>

כביסה-החוקה בסיוע מחדש של רקומביננטי דרוזולה אטלסטין ליפוזומים בשביל השומנים

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

פיוז'ן ממברנה הוא תהליך מכריע בתא איקריוטית. חלבונים מיוחדים נחוצים כדי לזרז את הפיוז. האצנים הם רשתית פלזמית (אר) חלבונים תושב מעורבים במיזוג הומוטיפקס של ER. אנו מפרטים כאן שיטה לטיהור של גלוטתיון S-transferase (GT) ו פולי היסטידין מתויג דרוסופילה אטלסטין על ידי שני סיבובים של כרומטוגרפיה של זיקה. לימוד תגובות היתוך בחוץ גופית דורש חלבונים היתוך מטוהרים להיות מוכנס bilayer ליפיד. ליפוזומים הם ממברנות מודל אידיאלי, כמו הרכב השומנים וגודל ניתן לכוונן. למטרה זו, אנו מתארים שיטת החוקה על ידי הסרת חומרי ניקוי עבור Drosophila ילה atlastin לתוך ליפוזומים טרום. בעוד כמה שיטות מחדש החוקה זמינים, החוקה על ידי הסרת חומרי ניקוי יש מספר יתרונות הופכים אותו מתאים עבור atins וחלבונים דומים אחרים. היתרון של שיטה זו כולל תשואה גבוהה לחוקה וכיוון נכון של חלבון מחדש. שיטה זו ניתן להרחיב חלבונים ממברנה אחרים עבור יישומים אחרים הדורשים פרוטאוליפוזומים. בנוסף, אנו מתארים שומנים בהתבסס על השומנים מבוסס ערבוב של פרוטאוליפוזומים המשמשים כמדידה של היתוך הממברנה.

היעילות של החוקה החוזרת מוצגת באיור 2. . במעבר הדרגתי מקוטע חלבון בלתי משולב היה מימדי בשכבה התחתונה (ב) או בשכבה האמצעית (M). חלבון מחדש צף לשכבה העליונה (T). דגימות של מעבר הצבע נקצרו ונותחו על ידי כתמים של מערכות SDS-PAGE ו-Coomassie הקוונפיקציה של הג על ידי densi, try מראה יעילות גבוהה מאוד של החוקה עם מאבדים זניח; 96% של החלבון הכולל נמצא הפרוטאוליזומים צף לשכבה העליונה (T). פחות מ-1% מהחלבון לא היווה ונמצא בשכבה האמצעית (M), ורק 3% לא היוו או נצבר והוא מונעד לשכבה התחתונה (B).
<p c...

היתוך ממברנה ביולוגי מזרז על ידי חלבונים היתוך מיוחדים. מדידת תכונות fusogenic של חלבונים ניתן להשיג על ידי ערבוב שומנים בעלי. אנו מציגים שיטה לטיהור רקומביננטי דרוסוילה אטלסטין, חלבון המרפא הומוטיפקס של המיון, ממנה את המבנה ליפוזומים מראש ובדיקת קיבולת היתוך.

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

פרוטוקול ההיתוך וההיתוך המפורט כאן הוא דרך יעילה לחקור חלבונים הקשורים לממברנה במודל של תערובת שומנים ושומנים על ידי חלבוני היתוך. כאן אנו מתארים התחדשות בסיוע חומר ניקוי של אטסטין דרוסופילה רקומביננטי, חלבון היתוך ER, לתוך ליפוזומים phosphatidylcholine מעוצב מראש. היתוך של פרוטאוליפוזום אטסטין נמדד לאחר מכן על ידי מוצף ערבוב שומנים מבוססי FRET.אחד היתרונות העיקריים של התחדשות בסיוע חומר ניקוי הוא החלבון בחומרי ניקוי אינו חשוף לייבוש או ממסים. אנו גם מראים כאן כי אוריינטציה מחדש של אטסטין היא יעילה מאוד. יתרון נוסף של ההטעיה על ערבוב שומנים מבוסס FRET הוא שאין צורך להטעין את ליפוזומים בצבע כלשהו, ואין צורך בצעדי דיאליזה נוספים.כדי להתחיל בהליך זה, הכן את מניות תערובת השומנים בכלורופורם, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הוסף microcurie אחד למיליליטר של DPPC לתערובות השומנים, הקפד לשמור לפחות שמונה microliters של מלאי זה. מעבירים את הכמות הרצויה של תערובת השומנים לצינורות זכוכית צור.ואז לייבש את השומנים מתערבב תחת זרם עדין של גז חנקן במשך כ 10 דקות עד לא יותר כלורופורם גלוי. יבש את הסרט השומנים וכתוצאה מכך עוד יותר במייבש על ידי שאיבת אבק במשך 30 דקות. לאחר מכן, הוסיפו מספיק A100 עם 10%גליצרול, שני מילימולרים 2-mercaptoethanol, ו EDTA מילימולר אחד לסרט השומנים כדי להחזיר את הריכוז ל 10 מילימולר.תדליק מחדש את סרט השומנים על ידי מערבולת קלה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. להקפיא את השומנים hydrated בחנקן נוזלי. כדי להפשיר את ליפוזומים, תן תספורת לשבת בטמפרטורת החדר במשך 30 שניות, ולאחר מכן להעביר אותם בחזרה למים להפשרה מהירה יותר.חזור על מחזור הפשרת הקפאה זה בסך הכל 10 פעמים. לאחר מכן, להשתמש mini-extruder להעביר את השומנים דרך מסנני פוליקרבונט, עם גודל נקבובית של 100 ננומטר, 19 פעמים. כדי לקבוע את ריכוז השומנים הכולל של ליפוזומים, להוסיף ארבעה microliters של מלאי השומנים ו lysosomes לשלושה מיליליטר של קוקטייל scintillation.למדוד את הספירות הממוצעות לדקה עבור מלאי ליפוזומים, ולחשב את ריכוז ליפוזום, כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחסן את ליפוזומים בארבע מעלות צלזיוס עד שבוע. ראשית, מערבבים את הכמות המתאימה של חיץ, חומר ניקוי נוסף וחלבון בצינור של 0.5 מיליליטר, כמתואר בפרוטוקול הטקסט.מוסיפים במהירות את ליפוזומים, ומיד מערבולת במשך חמש שניות כדי הומוגניזציה של התערובת. חממה התגובה במטורף בארבע מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. במהלך הדגירה הזו, שוקלים 0.2 גרם של בחנורי פוליסטירן ומעבירים אותם לצינור מיקרוצנטריפוגה.מוסיפים מיליליטר אחד של מתנול לצינור, ומערבבים במשך דקה אחת כדי לדגום את חרוזים. לאחר מכן, שאף את מתנול עם מחט 21-מד או גבוה יותר. כדי להתחיל לשטוף את החמרוזים, מוסיפים להם מים.תן את חרוזים לערבב עם המים במשך חמש דקות, ולאחר מכן שאף את המים. חזור על תהליך שטיפת מים זה ארבע פעמים. לאחר מכן, להוסיף מים כדי להביא את תרחיף תריס פדירה פוליסטירן לנפח של מיליליטר אחד, עם ריכוז סופי של 0.2 גרם למיליליטר.חשב את כמות חרוזי הפוליסטירן הדרושים כדי לספוג את כל חומר הניקוי בכל דגימה, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. חותכים טיפ פיפטה כדי לאסוף את תרחיף חרוזים. מעבירים את הכמות המחושבת של תרחיף חרוזים לצינור 0.5 מיליליטר, ושואפים את המים.מוסיפים את הדגימות לצינור המכיל את חרוזים, ודגירה במטורף בארבע מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. מעבירים את הדגימות לצינור טרי המכיל חרוזים חדשים, ומוודאים להשאיר את חרוזים ישנים מאחור. דגירה שוב באמצעות אותם תנאים.חזור על תהליך זה של העברה ודגירה של חרוזים פעמיים. לאחר מכן, מעבירים את הדגימה לצינור חדש המכיל חרוזים טריים ודגירה על ידי אגוזים לילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, להסיר את המדגם מן חרוזים צנטריפוגה ב 16, 000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי גלולה אגרגטים חלבון מסיסים.לשחזר את supernatant, ולקבוע את ריכוז השומנים הסופי על ידי ספירת נצנוץ נוזלי, כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי להתחיל, להביא את התורם ואת proteoliposomes מקבל לריכוז של 0.15 מילימולר כל אחד ב A100 המכיל גליצרול, בטא-mercaptoethanol, EDTA, ומגנזיום כלורי. מעבירים כל תגובה ל הבאר בצלחת שטוחה של 96 באר המתאימה לקריאת פלואורסצנטיות, ומוודאים להכין לפחות ארבע תגובות, כולל שליש ושליטה שלילית ללא GTP.מניחים את הצלחת לתוך קורא צלחת שחומם מראש ב 37 מעלות צלזיוס. למדוד את הפלואורסצנטיות NBD כל דקה במשך חמש דקות. לאחר מכן, להוסיף GTP חמישה מילימולר כדי לגרום היתוך.למדוד את הפלואורסצנטיות NBD כל דקה במשך שעה אחת באמצעות אותה העירור וההפחתה כמו קודם. לאחר מכן, להוסיף חמישה microliters של 2.5%n-Dodecyl בטא-D-maltoside ל הבארות כדי להמיס את proteoliposomes, ולמדוד את הפלואורסצנטיות NBD המרבי כל דקה במשך 15 דקות באמצעות אותה קריאה ו פליטה. במחקר זה, אטלסטין Drosophila רקומביננטי מטוהר ו מחדש לתוך ליפוזומים מעוצבים מראש.היעילות של התחדשות אטסטין נקבעת על ידי פרוטאוליפוסמים צף מחדש ב iohexol הדרגתי לא רציפה. דגימות של השכבות ההדרגתיות העליונות, האמצעיות והתחתונות נקצרות ומנותחות על-ידי כתמי SDS-PAGE ו- Coomassie. כימות הג'ל על ידי densitometry מראה יעילות גבוהה מאוד של התחדשות עם הפסדים זניחים, עם 96% מכלל החלבון נמצא פרוטאוליפוזום שצף לשכבה העליונה.פחות מ-1% מהחלבון אינו מפוסס ומימצאות בשכבה האמצעית, ורק 3% אינו מצטבר או מצטבר ומותן לשכבה התחתונה. האוריינטציה של אטסטין לאחר התחדשות הוא כימת על ידי מחשוף טרומבין מחשוף. דגימות מנותחות עם כתמי SDS-PAGE וקומאסי וממותמות על ידי צפיפות.רוב החלבון המשוחזר הוא מחשוף, עם רק 7% להיות מוגן מפני פרוטאז. הקינטיקה והיקף ההיתוך הפרוטאוליפוזום בתתיווך אטלסטין מנותחים על ידי תיסים מערבבים שומנים. דגירה של חמש דקות מתבצעת לפני גרימת היתוך עם GTP בנקודת הזמן אפס.לאחר שעה אחת, n-Dodecyl בטא-D-maltoside התווסף כדי לבודד את proteoliposomes ולקבל את שחרור העברת תהודה פלואורסצנטי מקסימלית. מקסימום ההיתוך בהפעלה נראה 11% של פלואורסצנטיות מקסימלית. שומנים מומסים בכלורופורם.בעת הכנת השומנים מתערבב, הקפד לעשות זאת במהירות, על מכסה המנוע הכימי, ועל הקרח, כדי למנוע כל אידוי. ניתן לנתח פרוטאוליפוזום אטלסטין על ידי מיקרוסקופיה כדי לדמיין את ההשפעות של עוגן קרום על צורה liposome וגודל. שיטה זו הורחבה כדי ללמוד חלבונים אחרים מעוגן קרום וכיצד להתנהג bilayer השומנים מודל.פרוטוקול זה משתמש שומנים titrated לכמת את תערובות השומנים. הקפד לנקוט באמצעי הזהירות הדרושים בעת עבודה עם חומרים רדיואקטיביים.

detergent-assisted-reconstitution-recombinant-drosophila-atlastin

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

הליכים לכינון מחדש של אב טיפוס ערוץ אשלגן מתח מגודרת לממברנות שומנים בדם מלא מתוארים. הערוצים המשוחזרים מתאימים למבחנים ביוכימיים, הקלטות חשמל, הקרנת יגנד ומחקרים קריסטלוגרפיים אלקטרונים. שיטות אלה עשויות להיות יישומים כלליים למחקרים המבניים ותפקודיים של חלבוני קרום אחרים.

כינונה מחדש של ערוץ Kv לממברנות שומנים בדם למבני ותפקודיים ללימודים

אנו מתארים בדיקה מבוססת פלואורסצנטית למדידת ערבול פוספוליפידים בליפוזומים חד-צדדיים גדולים שהורכבו מחדש עם אופסין.

Assay מבוסס-הקרינה של פעילות פוספוליפידים Scramblase

מאמר זה מתאר שיטה להערכת האינטראקציות וההרכבות של חלבוני ממברנה אינטגרליים במבחנה עם גורמים שותפים שונים בסביבה שומנית-פרוקסימלית.

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים במבחנה

כאן אנו מציגים שני פרוטוקולים מרביים הכינון של קרום חלבונים לתוך fusogenic proteoliposomes, פיוז'ן של proteoliposomes כזה עם היעד bilayers השומנים למסירה ללא אבקת החלבונים האלה ממברנה לתוך bilayer postfusion. השילוב של גישות אלה מאפשר הרכבה מהירה וקלה לשליטה של מערכות ממברנה רב רכיבים מורכבים.

ללא דטרגנט מרביים להתחדשות ומבנה של קרום חלבונים לתוך השומנים Bilayers באמצעות Fusogenic משלימים טעונה Proteoliposomes.

אנו מספקים פרוטוקול עבור במבחנה מבחני ארגון עצמי של המוח, שלי ליפידית הנתמכות בחדר פתוח. בנוסף, אנו נתאר כיצד הקף וזמינותו של לבושת השומנים microcompartments PDMS לחקות ויוו תנאים על ידי תגובת כליאה.

במבחנה בנייתו מחדש של דפוסי חלבון ב- Bilayers הנתמכים השומנים ארגון-עצמי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לשיקום פעילות החילוץ Msp1 עם רכיבים מטוהרים לחלוטין בפרוטואוליפוזומים מוגדרים.

שחזור פעילות החילוץ Msp1 עם רכיבים מטוהרים לחלוטין

מאמר זה מציג שיטה פשוטה לייצור מהיר של שלפוחיות חד-שכבתיות ענקיות עם חלבוני שלד ציטוסקטליים עטופים. השיטה מוכיחה את עצמה כיעילה לשילוב מחדש מלמטה למעלה של מבנים ציטוסקטליים באינטראקציות כליאה וציטוסקלטון-ממברנה.

אנקפסולציה מהירה של שלד ציטוסקי משוחזר בתוך בועיות יונילאמלריות ענקיות

פרוטוקול זה מתאר את היווצרותם של דו-שכבתיות שומנים נתמכות ואת התוספת של חוטים ציטוסקטליים וחלבונים מוטוריים כדי לחקור את הדינמיקה של רשתות ציטוסקטליות משוחזרות, הקשורות לממברנה, באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

שחזור של קליפות אקטין מינימליות הקשורות לממברנה על דו-שכבתיות שומנים נתמכות

בכתב יד זה, אנו מדגימים את הטכניקות הניסיוניות לתמצת את השלד הציטוסקולרי F-actin לשלפוחיות ליפידים חד-עיניות ענקיות (הנקראות גם ליפוזומים), ואת השיטה ליצירת שכבת F-actin הביולוגית של קליפת המוח בעלון הפנימי של קרום הליפוזום.

במבחנה שחזור של שלד אקטין ציטוסקלטון בתוך שלפוחית אונילמלרית ענקית

אנו מציגים פרוטוקול להרכבה מחדש של חלבוני ממברנה ועטיפת אנזימים ורכיבים מסיסים אחרים במים בשלפוחיות שומנים בגודל תת-מיקרומטר ומיקרומטר.

בניית רשתות מטבוליות מחוץ לשיווי משקל בשלפוחיות בגודל ננו ומיקרומטר

למד שחזור חלבון Drosophila atlastin לליפוזומים באמצעות מדידת ערבוב שומנים מבוססת FRET. שיטה זו מאפשרת חקר יעיל של חלבוני ממברנה ומנגנוני התמזגות תאית.

כביסה-החוקה בסיוע מחדש של רקומביננטי דרוזולה אטלסטין ליפוזומים בשביל השומנים

גלה סרטונים נוספים