הקמת החולה סרטן קיבה-מודלים נגזרים הנגזרות וקווי התא הראשי

מודלים שנגזרו על ידי המטופל Xenograft וקווי תאים ראשוניים הופכים לחלק בלתי נפרד מהתפתחות התרופה והייזום וההתקדמות של מחקר ביולוגיה של הגידול. מודלים שנגזרו על ידי המטופל Xenograft לשמר את המראה ההיסטולוגי של תאים סרטניים, לשמור על הטרוגניות תוך-טבעית, ולשקף טוב יותר את המרכיבים האנושיים הרלוונטיים של microenvironment הגידול. המודלים שלו הם עבור ייצוגים מדויקים יותר של סרטן אנושי אז קווי תאים סרטניים מסורתיים יש פוטנציאל לשפר את ההערכה preclinical של טיפולים נגד סרטן הרומן.

בנוסף, מודלים אלה עשויים להיות שימושיים בהשוואת מאפיינים מולקולריים או חתימות גידול בין תת קבוצות שונות של חולי סרטן. עכברי NSG מומלצים כמודל עכבר כשל חיסוני. בשל כשל חיסוני חמור של העכברים, סטריליות חייבת להישמר בכל הניסויים.

בתנאים סטריליים, השתמש במטלפים ומספריים כדי לנתח בזהירות את רקמות הגידול ולקצץ אותן למספר חתיכות קטנות. לאחר הרדמה של העכבר, השתמש במספריים סטריליים כדי לבצע חתך של סנטימטר אחד בשני האגפים הגביים. השתמש במדפים סטריליים כדי לשבש את הרקמה התת עורית.

לאחר מכן, גזור חתיכה של רקמת הגידול, והכנס אותה לאתר העמוק. סגור את אזור השתל על ידי תפר תת עורי עם מחטי תפר כירורגיות. לעקר את הפצע עם יוד.

לאחר מכן, מניחים בעדינות את העכברים בכלוב ריק תוך שמירה על כור העצם. שים לב לעכברים כפי שהם צריכים להתעורר ולהתחיל ללכת לאחר כשלוש עד ארבע דקות. מקם עכברים שעברו ניתוח בכלוב חדש מופרדים מאלה שאינם נתונים לניתוח.

להעריך את גודל הגידול על ידי דפיקות של אתר ההשתלה ולמדוד אותם עם caliper Vernier פעמיים בשבוע. לאחר המתת חום לעכברים, השתמש במטסים סטריליים ומספריים כדי לבודד לאט את הגידול מהעכברים. לשטוף את רקמות הגידול ב DPBS בצלחת 10 ס"מ.

אתה מלקחיים ומספריים לנתח ולהסיר אזורים נמקיים, רקמת שומן, קרישי דם ורקמות חיבור. לאחר מכן, השתמש בתבנית כדי לחתוך את רקמות הגידול לעובי מרבי של מילימטר אחד. לשטוף את פרוסות הגידול עם DPBS בצלחת 10 ס"מ.

כדי להתחיל את תהליך vitrification, להשתמש מדפים להעביר את הפרוסות לתוך צינור V1 דגירה בארבע מעלות צלזיוס במשך ארבע דקות. מגלגלים והפוך את הצינור לזמן קצר ודגירה בארבע מעלות צלזיוס במשך ארבע דקות נוספות. לאחר מכן, יוצקים את פתרון V1 ופרוסות לתוך צלחת 10 ס"מ ולהשתמש מדפים להעביר את הפרוסות לתוך V2 צינור. דגירה בארבע מעלות צלזיוס במשך ארבע דקות.

מגלגלים ומהירים את הצינור לזמן קצר ומדרגים אותו בארבע מעלות צלזיוס למשך ארבע דקות נוספות. לאחר מכן, יוצקים את פתרון V2 ואת הפרוסות לתוך צלחת 10 ס"מ. מעבירים את הפרוסות לצינור V3 ו דגירה בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.

מגלגלים והפוך את הצינור לזמן קצר ודגירה בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות נוספות. ודא כי כל הפרוסות לשקוע לתחתית הצינור. אם כמה פרוסות נשארות צפות, מגלגלים והפוך את הצינור לזמן קצר ודגירה בארבע מעלות צלזיוס עד שכל הפרוסות שוקעות לחלוטין.

לאחר מכן, יוצקים את תסכום V3 ופורסים לתוך צלחת 10 ס"מ. חותכים את מחזיקי הרקמה לאורך הנכון ומ מניחים אותם על גזה סטרילית. מעבירים את הפרוסות למחזיקים.

לעטוף את המחזיקים עם גזה. באמצעות מדפים, מניחים את המחזיקים בחנקן נוזלי ולתת להם דגירה במשך חמש דקות. לאחר מכן, סמן את הבקבוקונים קריוגניים עם מידע הרקמה.

מעבירים את המחזיקים עם פרוסות רקמה לתוך הבקבוקונים, אשר יאוחסנו חנקן נוזלי. ראשית, לקצוץ דגימות סרטן קיבה מדגימות כרותות או רקמות PDX שנקטפו. מניחים את הרקמות על קרח ומעבירים אותן לצלחת תרבות סטרילית באורך 10 ס"מ.

השתמש מלקחיים ומספריים כדי להסיר אזורים נמקיים, רקמת שומן, קרישי דם ורקמות חיבור. לשטוף את רקמות הגידול פעם אחת עם DPBS המכיל פניצילין סטרפטומיצין בצלחת 10 ס"מ. לאחר מכן, חותכים את הגידול לחתיכות על מכסה המנה.

העובי המרבי של כל חתיכה צריך להיות מילימטר אחד. מעבירים את החלקים לצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר המכיל שבעה מיליליטר של קולגן מסוג 1 ופתרון טריפסין. מערבולת את התערובת בקצרה.

דגירה באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 עד 40 דקות, הקפדה על מערבולת את התערובת כל חמש דקות. לאחר מכן, להוסיף נפח שווה של RPMI-1640 בינוני בתוספת 10%FBS ומערבולת את התערובת ביסודיות. העבר תערובת זו לתוך צינור צנטריפוגה חדש 50 מיליליטר על ידי סינון איטי באמצעות מסנן 40 microliter.

צנטריפוגה filtrates במהירות בין 113 ו 163 פעמים g במשך חמש עד שבע דקות בטמפרטורת החדר. הסר בזהירות את העל-טבעי הזה. לשטוף את גלולה עם חמישה מיליליטר של PBS ולהסיר בזהירות את supernatant.

אם גלולה הוא אדום, הוא מכיל אריתוציטים. בעדינות resuspend את גלולה עם 500 microliters של חיץ תות דם אדום דגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לאחר מכן, להוסיף חמישה מיליליטר של PBS.

צנטריפוגה במהירות שבין 113 ל 163 פעמים g במשך חמש עד שבע דקות בטמפרטורת החדר. בזהירות להסיר את supernatant ולתלות את גלולה עם מדיום תרבות ולהעביר את התערובת לתוך צלחת סטרילית 10 ס"מ. הדגירה את התרבות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני, הקפדה להחליף את המדיום עם מדיום המכיל סרום כל יומיים עד שלושה ימים.

במחקר זה, סרטן קיבה מודלים PDX וקווי תאים ראשוניים הוקמו. גידולים מהדור הראשון נראים לגדול לאט יותר מאשר אלה בדורות הבאים, לוקח שלושה שבועות או יותר כדי להגיע לגודל המתאים. שיעור ההצלחה של היווצרות גידול תת עורי מהדור הראשון הוא מעל 80%% זהותם של התאים הסרטניים מדגמי PDX מאושרת ממודלים של PDX על ידי כתמי H&E.

שיעור ההצלחה של היווצרות הגידול מרקמה הגידול cryopreserved נתפס להיות כ 95% תאים סרטניים ניתן לזהות בקלות על ידי הבדלים במורפולוגיה. התאים העיקריים מאומתים באופן עצמאי על ידי שני פתולוגים תחת מיקרוסקופ. לאישור נוסף, כתמי H&E משמשים לצפייה במורפולוגיה של תאים סרטניים לאחר הקיבעון.

שיעור הבידוד המוצלח של קווי תאים ראשוניים הוא כ -40%% מודלים אלה הוכחו כחיזוי של תוצאות קליניות והם משמשים להערכת תרופות פרה-קליניות על ידי זיהוי סמן, מחקרים ביולוגיים ואסטרטגיות רפואה מותאמות אישית.