Semi-אוטומטי PD-L1 אפיון וספירה של תאים סרטניים במחזור בין שאינם קטנים תאים סרטן ריאות חולים על ידי Immunofluorescence

בהתבסס על טכנולוגיה מיקרופלואידית, בידוד ואפיון של CTCs מתאי דם רגילים אינם דורשים שימוש בסמנים ביולוגיים ספציפיים של CTC, והוא תואם לתרבות התאים. פרוטוקול זה מקל על שיעור גבוה של מיצוי CTC, ומספק ניתוח ציטולוגי נרחב של CTCs, על ידי הערכת מאפיינים ציטומורפולוגיים ממאירים. ביטוי PD-L1 על ידי CTCs יש ערך חזוי בניהול סרטן ריאות.

שיפור הזיהוי שלה באמצעות בדיקה זו יכול לקדם ניהול מטופל טוב יותר בטווח הארוך. יישום אחר של פרוטוקול זה כולל זיהוי סטייה גנטית באמצעות FISH, או ביצוע ניתוח תעתיק על CTCs, כמו גם בידוד תאים ממוצא עוברי באימהות. הפגנת ההליך תהיה ג'ולי בלנדייה, טכנאית מהמעבדה שלנו.

להעשרת תאי הגידול לפני הניתוח, אסוף תחילה 7.5 מיליליטר דם לצינור אשלגן EDTA, ושמור את הדגימה תחת תסיסה עדינה כדי למנוע מעים וקרישה של התאים. בתוך שש שעות של איסוף, להשתמש פיפטה סרולוגית תחת ארון בטיחות מיקרוביולוגית, כדי להעביר עד 7.5 מיליליטר של דם שלם לתוך צינור צנטריפוגה חדש 50 מיליליטר, ו צנטריפוגה המדגם במשך 10 דקות ב 1600 פעמים G, בטמפרטורת החדר. בסוף הצנטריפוגה, להשתמש פיפטה העברה כדי לאסוף את שבר הפלזמה מבלי להפריע מעיל באפי, ולדלל את הפלזמה עם נפח שווה ערך של PBS, עד 7.5 מיליליטר.

לאחר מכן, בזהירות להוסיף חיץ תות שדה אדום לתאי הדם לדגימה הדם, לנפח סופי של 30 מיליליטר, בעדינות להפוך את צינור איסוף הדם שלוש פעמים, לפני הצבת הצינור בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. בסוף הדגירה, לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה, בזהירות להסיר את כל אבל האחרון ארבעה עד חמישה מיליליטר של על טבעי. השתמש micropipette מסונן כדי להסיר את העל-טבעי הנותר, ולהשתמש micropipette P1000 עם קצה מסונן כדי להוסיף מיליליטר אחד של מאגר resuspension במורד הקיר של הצינור.

כדי למנוע החדרת בועות, להשתמש שוב את גלולת התא עם צינורות עדינים, עד המדגם הוא הומוגני. כאשר גלולה כבר resuspended, להוסיף שלושה מיליליטר נוספים של חיץ ההתפלה לקיר של הצינור, מבלי להציג בועות, בעדינות לערבב את התאים שוב. עבור מכשיר מיקרופלואידי ספירלי במחזור העשרת תאים סרטניים, טען תחילה שבב מיקרופלואידי ספירלי חדש על המכשיר, וטען צינור צנטריפוגה ריק אחד של 50 מיליליטר לכל אחת מיציאות הקלט והפלט.

לחץ על פריים כדי ליצור את ההתקן המיקרופלואידי הספירלי למשך שלוש דקות. הסרת צינורות הקלט והפלט בסוף המחזור. טען את דגימת הדם המתווסת ליציאת הקלט, וטען צינור חרוט 15 מיליליטר ברור ליציאת הפלט.

לאחר מכן לחץ על הפעל, ובחר תוכנית שלוש ליזום את 31 דקות במחזור תוכנית העשרת תאים סרטניים. בסוף המחזור להעביר את צינור הפלט לצנטריפוגה, ולהשתמש פיפטה סרולוגית חמישה מיליליטר כדי להסיר את כל אבל שני המיליליטרים האחרונים של supernatant. לאחר מכן השתמש micropipette כדי להסיר את כל אבל האחרון 100 microliters של על טבעי.

עבור כתמי שפעת חיסונית, לספור את התאים בהמוציטומטר, ולדלל את המדגם המועשר לאחד פעמים עשרה עד חמישי תאים לכל 100 microliters של 0.2% ריכוז פתרון אנטי מחייב. לאחר מכן, השתמשו במטלית כותנה ספוגה ב-50 מיקרוליטרים של פתרון אנטי-מחייב כדי להנחית את קווי המתאר של תא הדגימה, ולהנחת מגלשת זכוכית פוליצינית בתא הדגימה. סגור את התא, ואת פיפטה למעלה ולמטה שלוש פעמים כדי לצפות קצה micropipette עם פתרון הכריכה לפני resuspending המדגם האחרון 100 microliters של supernatant.

מעבירים את פתרון התא לתא הדגימה ומציתים את הדגימה בצנטריפוגה ייעודית ב-400 סיבובים לדקה למשך ארבע דקות, בתאוצה נמוכה. בסוף הצנטריפוגה, מניחים מבודד סיליקון סביב אזור התצהיר ולתת את השקופית להתייבש תחת ארון בטיחות מיקרוביולוגי במשך שתי דקות, ולאחר מכן לתקן את מדגם cytospun עם 100 microliters של 4% paraformaldehyde במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ואחריו שלוש שתי דקות שוטף עם 200 microliters של PBS לכל לשטוף, בטמפרטורת החדר. לאחר הכביסה האחרונה, לחסום כל כריכה לא ספציפית עם דגירה 30 דקות בחסימת reagent בטמפרטורת החדר, ואחריו תיוג עם 100 microliters של פתרון הנוגדן של עניין.

מניחים את השקופית המסומנים בצלחת פטרי 100 על 15 מיליליטר על פיסת נייר סופגת לחה עם שני מיליליטר של מים סטריליים, ומנחים את המנה סגורה, בארבע מעלות צלזיוס בן לילה, מוגנת מפני אור. למחרת בבוקר, לשטוף את המדגם שלוש פעמים עם PBS כפי שהודגם, ולהרים את המדגם עם 10 microliters של פתרון הרכבה מתאים להחליק כיסוי זכוכית. ואז לאטום את החלקת הכיסוי עם לק ברור.

כדי לדמיין את דגימות הציטוספון, העמיסו את הגלישה על מיקרוסקופ פלואורסצנטי ישר עם פלטפורמה ממונעת X Y, ובחרו מטרה של פי 20 ואת הערוצים המתאימים בהתאם לפילואורופורים המשמשים לתיוג הנוגדנים. הפעל את מנורת הכספית ולהתאים את המיקרוסקופ ואת התוכנה הקשורה לצילומים חצי אוטומטיים. כאשר המנורה מוכנה, בתפריט הרכישה, הגדר את ארבעת הערוצים, הגדר את זמן החשיפה והגדר את האריחים לסריקה.

לחץ על אריחים ועל ניסוי מתקדם והגדר את האזור לסריקה. לאחר מכן התאימו את המוקד על המסך ולחצו על 'התחל ניסוי'. בסוף הניסוי, לייצא את קבצי TIF עבור כל ערוץ, ובמיוחד שם הקובץ לכלול את המדגם, מספר פעמים, צבע, ומספר אריחי משנה.

לניתוח תמונות, פתחו את התוכנה לניתוח תמונות מאתר האינטרנט של מכון ברוד ולחצו על קובץ, צינור מקובץ וניתוח ארבעה ערוצים CTC. שחרר קבצים ברשימת הקבצים ועדכן את המטה-נתונים כדי לקבץ את הקבצים לפי אריחים. לאחר מכן לחץ על נתח תמונות כדי לפתוח את קובץ הגיליון האלקטרוני המתאים לפרמטרים של עוצמת המידה.

ללא פרוטוקול טיהור אופטימיזציה, זיהום חיידקי גבוה נצפתה בתרבות רקמות של קווי תאים מועשרים A549 לאחר 24 שעות בלבד, גרימת מוות ושינויים ציטומורפולוגיים בתאים האוקריוטיים. לעומת זאת, לאחר פרוטוקול הניקוי, תאים חיים A549 מתקבלים בתרבויות 2D לאחר 10 שעות של תרבות רקמות והסרה בינונית, תחת תנאי תרבות 3D, ובתוך דגימות המטופל. באמצעות בדיקת כתמים נוזלית immunofluorescent או בדיקת כתמים immunofluorescent על שקופיות מצופות פוליצין עם ציטוספין, הבחנה ברורה במספר הגרעינים המוספרים בין שתי בדיקות ניתן לראות.

ללא שלב הציטוספין, קשה להבדיל את תאי הדם הלבנים מתאי הגידול, בשל קווי המתאר המטושטשים בהכנה לתאים שאינם ציטוספין. כאן ניתן לראות ממצאים מייצגים שונים מדגימות שונות של מטופלים, כאשר הספירה השיורית של תאי הדם הלבנים בפרט נקבעה להיות משתנה מאוד, ותלויה בכל דגימת הדם. שונות גבוהה נצפתה גם בתת-האוכלוסיות של תאי הגידול המסתובבים שהושגו.

כל תא בציטוספין מזוהה על ידי תוכנת ניתוח התמונה, ומאפשר מעקב אחר תאים ובידיד כדי לאשר את התוצאות לפי הצורך. ואכן, ניתוח פיילוט הראה קונקורדציה בין ספירת הידנית לבין ספירת התוכנה לניתוח תמונה. ההתקנה של צלחת פטרי לחה מעוצבת עבור הכלאה נוגדן חלבון הוא קריטי, כמו המכשיר נשאר לח מספיק לאורך כל זמן הדגירה.