ניתוח של השומנים שומנים תוכן ביקוע והנצה ליעדים באמצעות עיבוד תמונה אוטומטית
17 ביולי 2019
כאן, אנו מציגים יישום MATLAB של זיהוי אוטומטי ותיאור כמותי של טיפות שומנים בתמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטית של ביקוע ותאי שמרים.
פרוטוקול זה מאפשר ניתוחים כמותיים בקנה מידה קטן עד גדול של תוכן השומנים באחסון התאים במגוון מיני שמרים והוא עושה זאת בצורה לא משוחדת ומתקנת. הטכניקה מאפשרת עיבוד מהיר של תמונות מיקרוסקופיות ומספקת יציאות כמותיות מפורטות כדי להשוות בקלות דגימות כגון מוטנטים ותאים שונים הגדלים בתנאים מגוונים. כדי להתחיל, בצע בפרוטוקול הטקסט הנלווה כדי להכין את פתרונות הכתמים, המדיה התרבותית והתאים.
ודא כי התאים בריאים בשלב הצמיחה הרצוי לפני הפעלת הניסוי. לאחר מכן, הכינו כיסוי מיקרוסקופ כדי שכל דגימה תדמיין. מורחים מיקרוליטר אחד של פתרון ציפוי שקופיות על גבי כיסוי נקי באמצעות הצד הארוך של קצה פיפסה במיקום אופקי.
אפשר לפתרון הציפוי להתייבש לחלוטין, ולאחר מכן אחסן את הכיסויים בסביבה נטולת אבק. לאחר מכן, למדוד את הצפיפות האופטית של תרבויות התא, ועל תרבויות להיות מנותח באותו שלב הצמיחה, לנסות להגיע לערכים דומים בין כל התרבויות שנבדקו כדי להבטיח תנאים ניסיוניים דומים. לאחר מכן, פיפטה מיליליטר אחד של תרבות התא לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר.
עבור תאי S.cerevisiae בלבד, להוסיף חמישה microliters של פתרון ציפוי שקופית לצינור גם כן. לאחר מכן, בקצרה מערבולת כל צינורות microcentrifuge, ו דגירה אותם ב 30 מעלות צלזיוס עם רועד במשך חמש דקות. לאחר מכן, מוסיפים מיקרוליטר אחד של פתרון כתמי השומנים לכל עליקוט תרבות, ומערבולת אותם בקצרה.
לאחר מכן, הוסף 10 מיקרוליטרים של פתרון הדמיה של גבול התא, ומערבולת אותם לזמן קצר בפעם השנייה. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה אותם ב 1, 000 פעמים כוח הכבידה במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. בסיום הסיבוב, הסר 950 מיקרוליטרים מהעל-טבעי ולהשתמש מחדש בתאים בעל-טבעי הנותר באמצעות פיפטה.
לאחר מכן, פיפטה שני מיקרוליטרים של ההשעיה התא צפוף על כיסוי מצופה לטין. לאחר מכן, מניחים את הכיסוי על שקופית מיקרוסקופ נקי כדי ליצור monolayer תא, ולהמשיך מיקרוסקופיה מהר ככל האפשר כדי למזער ממצאים בהדמיה. הגדרת המיקרוסקופ דורשת חשיפות ארוכות למקורות אור חזקים העללים לגרום נזק לדגימה ולהטות תוצאות.
לכן, להגדיר את תנאי ההדמיה באמצעות שקופית מדגם ייעודי כי לא ישמש עוד יותר עבור כימות טיפת השומנים. מקם את הדגימה הייעודית על הבמה של ניגודיות פאזה או הגדרת מיקרוסקופ ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית, והתמקד בתאים. בתוכנת המיקרוסקופ, הגדר את הגדרות מחסנית Z כך שהן ישתרעו על-פני כל אמצעי האחסון של התא.
המרחק האנכי הכולל תלוי בגודל התא, ומספר הפרוסות האופטיות תלוי בצמצם המספרי של המטרה. לאחר מכן, הגדר את המוקד כך שזז יחסית למישור המוקד המרכזי. כדי לדמיין טיפות שומנים, הגדר באופן ניסיוני את עוצמת האור ותזמן החשיפה בערוץ הירוק.
להיות זהיר בעת הדמיה, כמו BODIPY הוא פלואורוכרום בהיר מאוד שעשוי להיות photobleached במהירות. בנוסף, למזער את זמן החשיפה כדי למנוע תיסה יתר. לכוד תחילה את מחסנית Z בערוץ הירוק המלא לפני המעבר לערוץ הכחול כדי למנוע טשטוש טיפות השומנים הניידות.
לתדמית גבולות תא, קבעו באופן ניסיוני את עוצמת האור ואת זמן החשיפה בערוץ הכחול. במידת האפשר, הגדר ולהשתמש בזרימת עבודה ניסיונית אוטומטית בתוכנת הבקרה של המיקרוסקופ כדי להקל על הדמיה של דגימות מרובות בתנאים סטנדרטיים. חשוב לציין שיש לרכוש את כל התמונות באמצעות אותן הגדרות כדי לאפשר השוואה מתאימה בין דוגמאות.
לאחר אופטימיזציה של תנאי ההדמיה, התמקדו בתאים ודמיינו אותם בערוצים הירוקים והכחולים. תמונה שדות תצוגה מרובים לכל דוגמה כדי להשיג נתונים חזקים ומייצגים. שמרו את תמונות הערימה Z בערוץ הכחול והירוק כקובצי TIFF מרובי שכבות של 16 סיביות.
הקפד לכלול את המילים ירוק או כחול בשמות הקבצים המתאימים. פתח תמונות מיקרוסקופיות ב- ImageJ, והסר את כל ערימות התמונות המכילות מספר ניכר של תאים שהוזזו במהלך הרכישה. אלה מופיעים במיקומים שונים במקטעי Z בודדים.
לאחר מכן, הסר את כל ערימות התמונות המכילות חלקיקים פלואורסצנטיים מאוד שאינם תאים בתעלה הכחולה. זה נגרם לעתים קרובות על ידי לכלוך על משטח ההדמיה או זיהומים במדיום הטיפוח ועשוי להפריע לגילוי תאים בסביבתם. כמו כן, הסר את כל ערימות התמונות המכילות חלק גדול מהתאים המתים.
תמונות אלה יציגו תאים עם פלואורסצנטיות כחולה מוגברת בהשוואה לתאים החיים. בעוד נוכחותם של כמה תאים מתים המדגם היא בדרך כלל לא בעיה ותאים אלה נמחקים באופן אוטומטי במהלך הניתוח, כמה תאים מתים או גוססים עשויים מדי פעם להיות מזוהים כתאים חיים על ידי אלגוריתם פילוח ובכך להטות את התוצאות שדווחו. כדי להתחיל בניתוח ב- MATLAB, צור תחילה תיקיה ראשית והעתק את כל קבצי ה- Script של MATLAB למיקום זה.
לאחר מכן, צור תיקיות משנה עם השמות של מיני השמרים השונים, והעתק את תמונות TIFF המתאימות למיקומים אלה. עכשיו, להתחיל MATLAB, לפתוח את התסריט הראשי. ותריץ את התסריט.
בתפריט, בחר את מיני השמרים שיש לנתח והתחל בעיבוד תמונה. בדוק ועיבד את קבצי הפלט כנדרש באמצעות עורך גיליון אלקטרוני או חבילה סטטיסטית. זרימת העבודה מפיקה קבצי CSV מופרדים באמצעות נקודה-פסיק וקבצי TIFF מקופלים עם אובייקטי תא שזוהו ו טיפות שומנים.
מוצגים כאן תאי S.pombe מסוג פראי שגודלו במדיום YES המורכב או במדיום EMM המוגדר. בהשוואה לתאים הגדלים במדיום YES, זוהו פחות טיפות שומנים ועוצמת כתמים גבוהה יותר ליחידת נפח תאים במדיום EMM. יתר על כן, טיפות שומנים בודדים שנוצרו במדיום EMM היו גדולים יותר והוצגו בעוצמת כתמים כוללת מוגברת.
זאת בהסכמה עם ממצאים קודמים של תוכן שומנים מאוחסן מוגבר בתאים הגדלים ב- EMM. לאחר מכן, תמונות אלה מראות תאי S.japonicus מתרבויות אקספוננציאליות ותחילת נייחות גדל במדיום כן. תאים שנכנסו לשלב נייח הראו ירידה ניכרת במספר טיפות השומנים ליחידת נפח התאים, בעוד שעוצמת פלואורסצנטיות טיפת השומנים מנורמלת בנפח ירדה מעט בין שני התנאים.
טיפות השומנים הראשונות בשלב נייח היו בדרך כלל גדולות יותר במתינות בגודלן ועוצמת הפלואורסצנטיות הכוללת גבוהה למדי בהשוואה ל טיפות מתאים הגדלים באופן אקספוננציאלי. בתאי S.cerevisiae שגדלו לשלב אקספוננציאלי לעומת נייח, תאים נייחים הכילו מעט פחות טיפות שומנים ליחידת נפח בהשוואה לתאים הגדלים באופן אקספוננציאלי. עם זאת, עוצמת פלואורסצנטיות טיפה מנורמל נפח שלהם כמעט הוכפל.
עלייה חדה זו בתתוכן טיפת השומנים הכולל נבעה מעוצמת פלואורסצנטיות גבוהה בהרבה ונפח של טיפות שומנים בודדים בשלב נייח. בעקבות הליך זה, ניתן לצבור נתוני פלט בחבילה סטטיסטית כגון R כדי ליצור התוויות של תוצאות מסוכמות ולהפעיל בדיקות סטטיסטיות על כל ההבדלים שנצפו בתוכן טיפת השומנים. באופן עקרוני, צינור עיבוד התמונה יכול לשמש לניתוח של תוכן טיפת השומנים במיקרואורגניזמים אחרים או לנתח מבנים תת-תאיים אחרים דמויי נקודה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג זרימת עבודה סטנדרטית ואוטומטית לניתוח כמותי של טיפות ליפידים בתאי שמרים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וניתוח תמונות. הפרוטוקול מאפשר הערכה אמינה ובסביליות גבוהה (high-throughput) של אגירת ליפידים בשלושה מיני שמרים מודליים, ומספק נתונים כמותיים מפורטים המתאימים לניתוח סטטיסטי בהמשך.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מטבוליזם של ליפידים
- ביולוגיה של התא
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית
- ניתוח כמותי של תמונות
רקע
- מטבוליזם של ליפידים הוא קריטי הן במחקר בסיסי והן בביוטכנולוגיה.
- מיני שמרים משמשים כמודלים חשובים לחקר תהליכים מטבוליים של ליפידים ולייצור ליפידים תעשייתי.
- טיפות ליפידיות הן אברוני אחסון דינמיים, וכמותן משקפת את המצב המטבולי התאי של הליפידים.
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מאפשרת ניתוח מפורט של טיפה בודדת ויכולה להיות ממוטבת עבור מחקרים בסריקה רחבה (high-throughput).
מטרת המחקר
- פיתוח ותיאור של זרימת עבודה (workflow) לזיהוי אוטומטי וניתוח כמותי של טיפות ליפידים בתאי שמרים.
- מתן אפשרות להשוואת תכולת טיפות הליפידים בין מיני שמרים שונים ותנאי גידול שונים.
- אספקת שיטה המפיקה נתונים המתאימים לניתוח סטטיסטי המשכי.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת תרביות שמרים וצביעה ב-BODIPY 493/503 עבור טיפות ליפידים ובדקסטראן פלואורסצנטי עבור גבולות התאים.
- מיקרוסקופיית אפיפלוורסצנציה בתלת-ממד בערוצים ירוק (טיפות ליפידים) וכחול (גבולות התאים), תוך רכישת תמונות Z-stack.
- עיבוד תמונות אוטומטי באמצעות pipeline של MATLAB לסגמנטציה של תאים וטיפות ליפידים.
- שלבי בקרת איכות ב-ImageJ להסרת ארטיפקטים, תאים מתים וחלקיקים שאינם תאיים.
- ייצוא נתונים כמותיים בפורמט CSV לצורך ניתוח המשך.
תוצאות עיקריות
- תהליך העבודה מאפשר כימות מהיר ולא מוטה של טיפות ליפידים ב- Schizosaccharomyces pombe, Schizosaccharomyces japonicus, ו- Saccharomyces cerevisiae.
- תנאי גידול משפיעים באופן משמעותי על מספר טיפות הליפידים, גודלן ועוצמת הפלואורסצנציה בשלושת מיני השמרים.
- תאים שגודלו במצעים מוגדרים או בשלב סטציונרי מראים לעיתים קרובות פחות טיפות ליפידים, אך אלה גדולות יותר ובעלות צביעה אינטנסיבית יותר.
- השיטה מניבה נתונים עקביים וניתנים לשחזור, המתאימים להשוואה סטטיסטית בין זנים ותנאים.
מסקנות
- פרוטוקול זה מספק גישה סטנדרטית ואוטומטית לניתוח כמותי של טיפות ליפידים בשמרים.
- תהליך העבודה ניתן להתאמה למיקרואורגניזמים אחרים או למבנים תת-תאיים בעלי מאפייני דימוי דומים.
- הוא מאפשר מחקרים השוואתיים בעוצמה גבוהה (high-throughput) של מטבוליזם ליפידים תחת תנאים ניסיוניים מגוונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
ניתוח כמותי אוטומטי של טיפות ליפידים במודלים של שמרים מאפשר בחינה סטנדרטית ובעלת תפוקה גבוהה של מטבוליזם של ליפידים, ובכך תומך הן במחקר בשלב הגילוי והן בביוטכנולוגיה תעשייתית. הפלטים החסונים והניתנים לשחזור של זרימת העבודה מקלים על ביצוע מחקרי השוואה בין זנים ותנאים שונים, ובכך מגבירים את הביטחון החזוי באפיון של מסלולים מטבוליים. יכולת זו רלוונטית ישירות לתיקוף מטרות ולצמצום סיכונים מכניסטיים בהנדסה מטבולית ובמחקר ופיתוח של ביו-פרמה בשלבים מוקדמים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר הערכה כמותית של מצבים מטבוליים של ליפידים בזנים שונים גנטית של שמרים.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות במסלולים מטבוליים באמצעות מדידות סטנדרטיות של טיפות ליפידים.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי אספקת נתונים לא מוטים על אחסון ליפידים הספציפיים למצב הניסיוני.
- משפר את רמת הביטחון החזויה לאסטרטגיות של הנדסה מטבולית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין מערכות שמרים עוברות תיקוף עבור זרימות עבודה של סריקת תרכובות או סריקה גנטית בהמשך התהליך.
- מספק תוצרים כמותיים הניתנים לשחזור, המתאימים לסטנדרטיזציה של בדיקות ולביצוע Benchmarking.
- מאפשר ניתוח תמונות אוטומטי וניתן להרחבה עבור יישומי סריקה בכימות גבוה (high-throughput screening).
- תומך בהערכה מהימנה של התערבויות המשפיעות על חילוף חומרים של ליפידים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את פלטי מודל השמרים לפיתוח ביומרקרים תרגומיים במחקר מטבולי.
- מספקת רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של מטרות מטבólicas.
- מאפשרת קבלת החלטות על קידום מבוסס התאמה לסיכון, בהסתמכות על פנוטיפים כמותיים חסונים.
- תומכת בהפחתת סיכונים חזוית עבור אסטרטגיות של מודולציה של מסלולים מטבוליים.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
תהליך עבודה אוטומטי זה של דימוי וניתוח משלב שלבים החל מגילוי ראשוני ועד לזיהוי מובילים (lead identification) במחקר של מסלולים מטבוליים, ותומך הן בבדיקת היפותזות והן בסריקות המשך.
- ביולוגיה של הגילוי: ניתוח כמותי של טיפות ליפידים מבהיר את התפקוד של מסלולים מטבוליים ותומך בתיקוף מטרות המבוסס על היפותזות.
- סריקה: תוצאות סטנדרטיות וניתנות לשחזור מאפשרות מוכנות של הבדיקה ומקלות על השוואות בין תנאים שונים.
- אנליזה: נתונים כמותיים עשירים ותוצרי סטטיסטיקה תומכים בהשוואות חסונות של תנאים וגנוטיפים.
- מחקר תרגומי: מאפשר התאמה של ממצאים ממודל שמרים עם אסטרטגיות של ביומרקרים פרה-קליניים במידת הרלוונטיות.
- שימוש חוזר ארגוני: זרימת העבודה ניתנת להתאמה לצורך ניתוח של מבנים תת-תאיים דמויי-נקודה אחרים, ובכך תומכת בשימושי מו"פ רחבים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי מסלולים מטבוליים.
- ערך תפעולי: מספק כימות מבוסס תמונה סטנדרטי, ניתן להרחבה וניתן לשחזור.
- ערך אסטרטגי: תומך בהחלטות מושכלות של המשך או עצירה (go/no-go) ובקידום יעיל של פורטפוליו מבחינת הון.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעוד וסדרי עדיפויות מותאמי סיכון עבור פרויקטים של הנדסה מטבולית ותיקוף מטרות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות במיקרוסקופיה פלואורסצנטית ובניתוח כמותי של תמונות.
- נדרשת גישה למיקרוסקופיית אפי-פלואורסצנציה בתלת-ממד ותשתיות ניתוח מבוססות MATLAB.
- נדרש סטנדרטיזציה בין צוותים של פרמטרי הדמיה וניתוח לצורך השוואה.
- ניתן להתאמה למיני שמרים אחרים או למיקרואורגניזמים בעלי מאפייני הדמיה דומים.
- תלוי בבקרת איכות להדרה של ארטיפקטים, תאים מתים וחלקיקים שאינם תאיים.
שאלות נפוצות בתחומי הביופארמה
Chapters in this video
0:04
Title
0:31
Lipid Droplet Staining
2:39
Imaging Setup and Acquisition
4:40
Image Analysis: Quality Check
5:39
Image Analysis: MATLAB
6:27
Results: Changes in Lipid Droplet Number, Size, and Lipid Content in Three Morphologically Distinct Yeast Species
8:06
Conclusion
