Name: ניתוח של השומנים שומנים תוכן ביקוע והנצה ליעדים באמצעות עיבוד תמונה אוטומטית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: למדו לנתח טיפות שומן ב-Saccharomyces cerevisiae ומיני שמרים נוספים באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה ועיבוד תמונה אוטומטי ב-MATLAB. שיטה זו מאפשרת הערכה כמותית מהירה ובלתי מוטה של אחסון שומנים תוך-תאי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי אוניברסיטת צ'רלס מענקים פרימוס/MED/26, GAUK 1308217 ו-SVV 260310. אנו מודים Ondřej Šebesta לקבלת עזרה עם מיקרוסקופ ופיתוח של צינור ניתוח תמונה. אנו מודים למעבדת הReGenEx לגבי זנים של מחלת ה-s. cerevisiae ס , והפקנט והירורי ניקי, עבור זנים של היפנים . Ppc1-88 זן סופק על ידי מרכז המשאבים הגנטיים שמרים יפן. המיקרוסקופיה בוצעה במעבדה למיקרוסקופיה ומיקרוסקופית הפלואורסצנטית במימון הקרן האירופית לפיתוח האזור ותקציב המדינה של צ'כיה (פרויקט מס '. CZ. 1.05/4.1.00/16.0347 ו-CZ. 2.16/3.1.00/21515).

1. הכנת פתרונות ומדיה
<ol><li>
הכינו פתרון להשומנים.
	<ol>
<li>כדי להכין מלאי השומנים מכתים פתרון התמוססות 10 מ ג של BODIPY 493/503 ב 10 מ ל של הידרואז DMSO (ריכוז סופי 1 מ"ג/mL). מתמוסס את התוכן כולו של 10 מ"ג BODIPY 493/503 בקבוקון כדי למנוע אובדן של חומר במהלך שקילה. זהירות: . DMSO יכול לעבור דרך העור תלבש ציוד הגנה אישי מתאים.</li>
		<li>להכין עבודה שומנים בצביעת פתרון על ידי ערבוב 100 μL של 1 mg/mL BODIPY 493/503 מניות פתרון ו900 μL של המים DMSO (הריכוז הסופי 0.1 mg/mL).</li>
		<li>הורדה של פתרונות המניה והעבודה, והחנות ב-20 ° c. הערה: מומס BODIPY 493/503 יציב במשך מספר שנים ב-20 ° c. עם זאת, הפתרון צריך להיות מוגן מפני לחות ואור.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כדי להכין את הפתרון מניות עבור הדמיית גבולות התא, לפזר 25 מ ג של כחול מדורגת תוספי (מבחנה שלמה) ב 2.5 mL של מים מאוהים (ריכוז סופי 10 מ"ג/mL). מחלקים את פתרון המניה ואת החנות ב-20 ° c מוגן מפני אור.</li>
	<li>כדי להכין שקופית מיקרוסקופ פתרון ציפוי, לפזר 5 מ ג של סויה לקטין ב 5 מ ל של מים מאוהים (ריכוז סופי 1 מ"ג/mL). מחלקים את פתרון הליטין והחנות ב-80 ° c. הערה: פתרון הקטין יציב למשך מספר שנים ב-80 ° c. ניתן לאחסן כרגע בשימוש ב-20 ° c.</li>
	<li>
הכינו מדיית טיפוח.
	<ol>
<li>כדי להכין 400 mL של מורכבות מדיום טיפוח YES עבור s. ביקוע ו- s. פקוניקוס, לפזר 2 גרם של שמרים לחלץ ו 0.1 g של תוספי הSP (אם נדרש עבור מוטציות auxotrophic) ב 340 ml של מים מיוהים בקבוק 500 mL וחיטוי. הוסף 60 mL של 20% (w/v) של הגלוקוז בנפרד או מסנן-מעוקר סוכר בתנאים אספטי.</li>
		<li>כדי להכין 400 mL של הגדרת מדיום הטיפוח EMM עבור s. ביקוע ו- s. פקוניקוס, התמוססות 4.9 g של ציר EMM ללא דקסטרוז ב 360 ml של מים מיוהים בבקבוקון 500 mL והחיטוי. הוסף 40 mL של 20% (w/v) של הגלוקוז בנפרד או מסנן-מעוקר סוכר בתנאים אספטי. הערה: להנחיות כלליות ב- s. ביקוע ו- s. הטיפוח-תרגול לראות25 ו-26, בהתאמה.</li>
		<li>כדי להכין 300 mL של מורכבות הטיפוח YPAD מורכבים עבור סכביפיסים cerevisiae ס, לפזר 3 גרם של תמצית שמרים, 6 גרם של peptone ו 30 מ ג של אדנוטין סולפט ב 270 מ ל של מים מיווים בבקבוקון 500 mL וחיטוי. הוסף 30 מ ל של 20% (w/v) של הגלוקוז בנפרד או סינון-מעוקר בתנאים אספטי.</li>
		<li>כדי להכין 300 mL של בינוני מינימלי מוגדר עבור S. cerevisiae, התמוססות 2 גרם של בסיס חנקן שמרים (ללא חומצות אמינו) ב 270 מ ל של מים מפוהים בבקבוקון 500 mL ו החיטוי. הוסף 30 מ ל של 20% (w/v) של הגלוקוז בנפרד או סינון-מעוקר בתנאים אספטי. הערה: להנחיות כלליות בנושא הטיפוח-תרגול של ס. צ. מראה27.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. טיפוח התאים
<ol><li>
גידול של בנות או s. יפנית לשלב מעריכי או מוקדם נייח.
	<ol>
<li>בבוקר, איחסן 5 מ ל של YES בינונית עם ביומסה טרי שמרים ביקוע. מודטה ב 32 ° צ' עם טלטול (180 rpm) במשך כמה שעות. הערה: עבור כל הזנים, השתמש מבחנות Erlenmeyer אייר שיש פי 10 נפח של התרבות כדי להבטיח aeration הנכון. מעבדות מסוימות מעדיפות לגדול ב -30 ° c, אבל טמפרטורת הטיפוח של 32 ° c תוצאות בזמני ההכפלה קצרים יותר ללא תופעות מזיקות לתאים, ובכך מפחיתה את הזמן הכולל הנדרש לביצוע ניסוי25,28 .</li>
		<li>בשעות אחר הצהריים המאוחרות של אותו היום (לאחר לפחות 6 שעות של טיפוח), לדלל את התרבות עם טרי YES בינונית עד 10 mL נפח התרבות הסופי כך שהוא מגיע הצפיפות האופטית הרצויה (OD) (או מספר תאים/mL) למחרת בבוקר, ו דגירה ב 32 ° צ' עם s המלך (180 rpm). היתרון הוא לדעת את זמן ההכפלה של כל מאמץ משומש כדי לקבוע במדויק את פקטור הדילול (השתמש במשוואה 1). <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59889/59889eq01v3.jpg"> כאשר התרבות v היא אמצעי האחסון לפני התרבות הדרושים לדילול, vהסופי הוא הנפח הכולל של התרבות החדשה (10 מ"ל עבור זנים סטנדרטיים), odהסופי היא הרצויה כדי להגיע ל לאחר בוקר, odהנוכחי הוא המדד הנכון כיום של טרום תרבות, t הוא הזמן של צמיחת התאים עד לקציר, השהיה הוא משך של שלב ההשהיה (תלוי בתנאי מעבדה, צריך ל להיות מוגדר באמצעות האמפירי) ו- tDT הוא זמן ההכפלה של המתח. הערה: כאשר התאים בשלב מעריכי יש לנתח, לא נותנים לתרבויות קדם להגיע לשלב הנייח כמו זה משתנה באופן דרמטי פיזיולוגיה התא (כולל תוכן LD) עבור מספר דורות הבאים.</li>
		<li>בבוקר יום ההדמיה, אם התרבות הגיעה ממנת יתר גבוהה יותר מהנדרש (במקרה של תאים מעריכי-שלב), לדלל אותו עם כן טרי ולהמשיך הדגירה לפחות שתי פעמים יותר הכפלה לפני הצביעת של המילד. אחרת המשיכו ישירות ל כתמים (סעיף 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
גידול של ביולוגיה לשלב מעריכי ונייח.
	<ol>
<li>בשעות אחר הצהריים, האיחסן 10 מ ל של מדיום YPAD עם כמות קטנה של ביומסה טרי שמרים מחדש ו דגירה לילה ב 30 ° צ' עם טלטול (180 rpm).</li>
		<li>בוקר של יום הדמיה, לדלל את התרבות כדי OD 0.1 ב 10 mL של מדיום YPAD ולצמוח כדי OD הנדרש (למשל, OD 1 עבור שלב מעריכי). בצע כל מדלל תרבות כמתואר בשלב 2.1.2. המשך לצביעת (סעיף 3).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. שומנים בצביעת Droplet
<ol><li>הכן תגית מכסה למיקרוסקופ עבור כל דוגמה ליצירת תמונה. פזר 1 μL של פתרון ציפוי שקופיות אל מכסה כיסוי נקי באמצעות הצד הארוך של קצה ממוקם אופקית של פיפטה. הרשו לפתרון הציפוי להתייבש לחלוטין ולאחסן את פתקי הכיסוי בסביבה נטולת אבק. הערה: ניתן לנקות שקופיות זכוכית וכיסוי לפני השימוש אם יש צורך בכך. תהליך הניקוי כולל כביסה עם ניקוי כלים, שטיפה עם מים, לילה הספוגים 3% חומצה הידרוכלורית, ושטיפת מים מזוקקים. שקופיות נקיות ושמיכות מאוחסנות באתנול טהור עד השימוש.</li>
	<li>מדוד את ה-OD של תרבות התא או מספר התאים/mL, כנדרש. נסה להגיע ערכים דומים בין כל הזנים נבדק כדי להבטיח תנאים ניסיוניים דומים.</li>
	<li>פיפטה 1 מ ל של כל תרבות תא לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL. עבור S. cerevisiae ס בלבד, להוסיף 5 μl של הפתרון ציפוי שקופיות, מערבולת בקצרה, ו דגירה ב 30 ° צ' עם רעד עבור 5 דקות.</li>
	<li>הוסף 1 μL של הפתרון מכתים את השומנים לכל התרבות ומערבולת בקצרה. לאחר מכן להוסיף 10 μL של הפתרון הדמיית גבול התא ומערבולת בקצרה. הערה: אין להכין מראש פתרונות מעורבים של שתי הכתמים כמו זה מוביל לקוצ'ינג הקרינה של BODIPY 493/503.</li>
	<li>לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה (1,000 x g, 3 דקות, RT) ולהסיר כמעט כל supernatant (~ 950 μl). השהה מחדש את התאים בסופרננט הנותר.</li>
	<li>פיפטה 2 μL של השעיית התא צפוף על מכסה לקטין מצופה לכסות ומקום על שקופית מיקרוסקופ נקי. . התאים צריכים ליצור מונאולייר המשך למיקרוסקופ (סעיף 4) מהר ככל האפשר כדי למזער את הפריטים בהדמיה; עבד שתי דגימות לכל היותר בכל פעם.</li>
</ol>4. התקנת מיקרוסקופ ודימות
<ol><li>
מטב את תנאי הדימות. הערה: הגדרת המיקרוסקופ דורשת חשיפות ארוכות למקורות אור חזקים שעלולים לגרום נזק למדגם ולתוצאות ההטיה. לכן, הגדר את תנאי הדימות באמצעות שקופית לדוגמה ייעודית שלא תהיה בשימוש נוסף עבור כימות LD.<ol>
<li>התמקד בתאים באמצעות ניגודיות פאזה או ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC). הערה: ניתן לנקוט בחדות פאזה או בתמונות DIC לצורך התייחסות, אך לא נעשה בהם שימוש במהלך שלב ניתוח התמונה האוטומטי.</li>
		<li>הגדרת הגדרות מחסנית z כדי להקיף את כל אמצעי האחסון של התא. המרחק האנכי הכולל תלוי בגודל התא; מספר הפרוסות האופטיות תלוי בצמצם המספרי של המטרה (הפונקציה התפשטות נקודה בציר z). הגדר את המוקד כדי לנוע ביחס למישור המוקד המרכזי. הערה: מספר הפרוסות האופטימלי מוגדר לעתים קרובות על-ידי תוכנת בקרת המיקרוסקופ ואין צורך לחשב אותה באופן ידני. רוחב התא אופייני הם 3-5 יקרומטר עבור s. ביקוע, 4-7 יקרומטר עבור s. פקוניקוס, ו 3-7 יקרומטר עבור s. cerevisiae ס.</li>
		<li>כדי התמונה הדמות, להגדיר את עוצמת האור ואת זמן החשיפה בערוץ ירוק (עירור ופליטה מקסימה של BODIPY הם 493 ו 503 ננומטר, בהתאמה). הערה: BODIPY 493/503 הוא fluorochrome בהיר מאוד; עם זאת, זה עשוי להיות לולבן במהירות עם עוצמת אור חזקה מדי. יתר על כן, הד הם ניידים בתאים חיים, ובכך למזער את זמן החשיפה וללכוד את מחסנית הערוץ הירוק המלא הראשון (לפני המעבר לערוץ הכחול) כדי למנוע טשטוש חפצים. כמו כן, קח בחשבון את הטווח הליניארי של המצלמה לעוצמת האות כדי למנוע פיקסלים רוויים.</li>
		<li>כדי גבולות תא תמונה, להגדיר את עוצמת האור ואת זמן החשיפה בערוץ הכחול (עירור ופליטה מקסימה תוספי כחול מדורגת הם 400 ו 420 ננומטר, בהתאמה). הערה: עוצמת האות בערוץ הכחול נדרשת לפילוח תמונה, אך היא אינה משמשת לכימות זיהוי זהות עצמה. לכן, הגדרות אופטימליות בערוץ זה אינן קריטיות לניתוח.</li>
		<li>במידת האפשר, צור זרימת עבודה ניסיונית אוטומטית בתוכנת בקרת המיקרוסקופ כדי להקל על הדמיה של דגימות מרובות תחת תנאים סטנדרטיים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאחר שתנאי הדמיה ממוטבים, דגימות תמונה לשימוש עבור כימות. להתמקד בתאים ולדמות אותם בערוצים ירוק וכחול כמתואר בשלב 4.1. הערה: יש לרכוש את כל התמונות באמצעות אותן הגדרות כדי לאפשר השוואה בין דגימות. תמונה של שדות מרובים של תצוגה לכל מדגם כדי לקבל נתונים חזקים ומייצגים.</li>
	<li>שמור את התמונות הכחולות והירוקות של מחסנית z כגון קבצי TIFF בשכבות של 16 סיביות (כלומר, שני קבצים לכל שדה תצוגה). כלול מילים "ירוק" או "כחול" בשמות הקבצים המתאימים. המשך בניתוח תמונה (סעיף 5).</li>
</ol>5. ניתוח תמונה
<ol><li>
בדוק חזותית את איכות התמונות שנרכשו.
	<ol>
<li>תמונות מיקרוסקופיים פתוחות ב-imagej29,30 או תוכנות מתאימות אחרות לניתוח תמונה.</li>
		<li>הסר ערימות של תמונות המכילות מספר ניכר של תאים שהועברו במהלך הרכישה (ולכן יצרו טשטוש פריטים).</li>
		<li>הסר ערימות התמונה המכילה חלקיקי פלורסנט מאוד לא תאים בערוץ הכחול (למשל, לכלוך על שקופית מיקרוסקופ או שובר כיסוי, זיהומים בינוני בטיפוח). הערה: אובייקטים בהירים מאוד שאינם תאים בערוץ הכחול עשויים ליצור ממצאים של זיהוי תאים או עלולים להפריע לזיהוי תאים בסביבתם.</li>
		<li>הסר ערימות תמונה המכילות חלק גדול של תאים מתים (כלומר, תאים עם זריחה כחולה מוגברת בהשוואה לתאים חיים). הערה: בעוד הנוכחות של חלק קטן של תאים מתים במדגם הוא בדרך כלל לא בעיה, תאים אלה נמחקים באופן אוטומטי במהלך הניתוח, כמה תאים מתים או גוססים עלולים להיות מזוהים מדי פעם כתאים חיים על ידי אלגוריתם פילוח ובכך הטות את התוצאות המדווחות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ניתוח תמונות בתוכנת MATLAB.
	<ol>
<li>צור תיקיה ראשית והעתק את כל קבצי ה-script MATLAB למיקום זה.</li>
		<li>צור תיקיית משנה ("פומבה", "cerevisiae" או "יפנית") והעתק קבצי תמונת קלט TIFF למיקום זה.</li>
		<li>הפעל את MATLAB, פתח את ה-script MAIN. m והפעל אותו. בתפריט לבחור את מינים שמרים לנתח ולהתחיל עיבוד תמונה. הערה: חלק מהפרמטרים הדרושים לאיתור תאים וזיהוי LD מוגדרים מראש עבור המינים הספציפיים, אחרים נקבעים באופן אוטומטי במהלך עיבוד תמונה. הערכים שנקבעו מראש נקבעו באופן אמפירי ותלויים במספר גורמים כגון הגדלה אובייקטיבית, סוג מצלמה ורגישות, והגדרות הדמיה. במקרה הצורך, משתמשים יכולים לערוך את קבצי ה-script כדי לשנות את ההגדרות המסוימות הספציפיות לאורגניזם כדי לשקף טוב יותר את ההתקנה הניסיונית שלהם. במילים אחרות, במהלך זיהוי תאים גדלים מקבילים של אובייקטים מקבלים את הפרמטרים "מיניאזור" ו-"maxArea", והחלק המינימלי של אמצעי האחסון המלא בתוך גבולות האובייקט ניתן על-ידי הפרמטר "אחידות". עבור זיהוי LD, סף הבהירות מוענק על-ידי הפרמטר "th" (הערך שלו מושפע בעיקר מעומק סיביות של התמונה ומעוצמת האות הפלואורסצנטית), וגודל הזיהוי המקסימלי המקובל ניתן על-ידי הפרמטר "MaxArea".</li>
		<li>בדוק ועבד את קבצי הפלט כנדרש באמצעות עורך גיליון אלקטרוני או חבילה סטטיסטית; זרימת העבודה מפיקה קבצי CSV מופרדים באמצעות נקודה-פסיק, וקבצי TIFF מקוטעת עם אובייקטי תא שאותרו ומזהה זיהוי. הערה: זרימת העבודה מפלחים תמונות לתוך אובייקטים של רקע ותאים, כאשר כל אובייקט תא עשוי להיות מורכב ממספר תאים סמוכים. לפיכך, הפלט בקבצי "xxxx_cells. csv" אינו מייצג נתונים של תא בודד ויש להשתמש בו רק כדי לחשב מדדי אמצעי אחסון לפי-יחידה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Koch, B., Schmidt, C., Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Storage+lipids+of+yeasts%3A+a+survey+of+nonpolar+lipid+metabolism+in+Saccharomyces+cerevisiae%2C+Pichia+pastoris%2C+and+Yarrowia+lipolytica%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Storage lipids of yeasts: a survey of nonpolar lipid metabolism in Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, and Yarrowia lipolytica.</a> FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 892-915 (2014).</li>
<li>Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+the+fat%3A+lipid+droplets+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Balancing the fat: lipid droplets and human disease.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).</li>
<li>Lazar, Z., Liu, N., Stephanopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Holistic+Approaches+in+Lipid+Production+by+Yarrowia+lipolytica%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Holistic Approaches in Lipid Production by Yarrowia lipolytica.</a> Trends in Biotechnology. 36 (11), 1157-1170 (2018).</li>
<li>Kim, D. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+a+genome-wide+set+of+gene+deletions+in+the+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Analysis of a genome-wide set of gene deletions in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Nature Biotechnology. 28 (6), 1628-1629 (2010).</li>
<li>Giaever, G., Nislow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yeast+deletion+collection%3A+a+decade+of+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The yeast deletion collection: a decade of functional genomics.</a> Genetics. 197 (2), 451-465 (2014).</li>
<li>Meyers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+and+neutral+lipid+composition+of+lipid+droplets+isolated+from+the+fission+yeast%2C+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology+%28Seoul%2C+Korea%29%22%5BJournal%5D)">The protein and neutral lipid composition of lipid droplets isolated from the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe.</a> Journal of Microbiology (Seoul, Korea). 55 (2), 112-122 (2017).</li>
<li>Meyers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Droplets+Form+from+Distinct+Regions+of+the+Cell+in+the+Fission+Yeast+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic+%28Copenhagen%2C+Denmark%29%22%5BJournal%5D)">Lipid Droplets Form from Distinct Regions of the Cell in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 17 (6), 657-659 (2016).</li>
<li>Long, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplet+de+novo+formation+and+fission+are+linked+to+the+cell+cycle+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic+%28Copenhagen%2C+Denmark%29%22%5BJournal%5D)">Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 13 (5), 705-714 (2012).</li>
<li>Yang, H. J., Osakada, H., Kojidani, T., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplet+dynamics+during+Schizosaccharomyces+pombe+sporulation+and+their+role+in+spore+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Lipid droplet dynamics during Schizosaccharomyces pombe sporulation and their role in spore survival.</a> Biology Open. , 8(2016).</li>
<li>Aoki, K., Shiwa, Y., Takada, H., Yoshikawa, H., Niki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+nuclear+envelope+dynamics+via+APC%2FC+is+necessary+for+the+progression+of+semi-open+mitosis+in+Schizosaccharomyces+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+To+Cells%3A+Devoted+To+Molecular+%26+Cellular+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Regulation of nuclear envelope dynamics via APC/C is necessary for the progression of semi-open mitosis in Schizosaccharomyces japonicus.</a> Genes To Cells: Devoted To Molecular & Cellular Mechanisms. 18 (9), 733-752 (2013).</li>
<li>Karolin, J., Johansson, L. B. A., Strandberg, L., Ny, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+and+Absorption+Spectroscopic+Properties+of+Dipyrrometheneboron+Difluoride+%28BODIPY%29+Derivatives+in+Liquids%2C+Lipid+Membranes%2C+and+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Fluorescence and Absorption Spectroscopic Properties of Dipyrrometheneboron Difluoride (BODIPY) Derivatives in Liquids, Lipid Membranes, and Proteins.</a> Journal of the American Chemical Society. 116 (17), 7801-7806 (1994).</li>
<li>Bozaquel-Morais, B. L., Madeira, J. B., Maya-Monteiro, C. M., Masuda, C. A., Montero-Lomeli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+fluorescence-based+method+identifies+protein+phosphatases+regulating+lipid+droplet+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A new fluorescence-based method identifies protein phosphatases regulating lipid droplet metabolism.</a> PloS One. 5 (10), e13692(2010).</li>
<li>Sitepu, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+high-throughput+Nile+red+fluorescence+assay+for+estimating+intracellular+lipids+in+a+variety+of+yeast+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved high-throughput Nile red fluorescence assay for estimating intracellular lipids in a variety of yeast species.</a> Journal of Microbiological Methods. 91 (2), 321-328 (2012).</li>
<li>Rostron, K. A., Lawrence, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nile+Red+Staining+of+Neutral+Lipids+in+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Nile Red Staining of Neutral Lipids in Yeast.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1560, 219-229 (2017).</li>
<li>Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli, M., Pardo, J. P., Guerra-Sánchez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Index+Determination+by+Liquid+Fluorescence+Recovery+in+the+Fungal+Pathogen+Ustilago+Maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis.</a> Journal of Visualized Experiments. (134), 1-6 (2018).</li>
<li>Gupta, A., Dorlhiac, G. F., Streets, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+of+lipid+droplets+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging of lipid droplets in single cells.</a> The Analyst. , (2018).</li>
<li>Wolinski, H., Bredies, K., Kohlwein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+of+lipid+metabolism+in+yeast%3A+from+4D+analysis+to+high+content+screens+of+mutant+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging of lipid metabolism in yeast: from 4D analysis to high content screens of mutant libraries.</a> Methods in Cell Biology. , 108-365 (2012).</li>
<li>Campos, V., Rappaz, B., Kuttler, F., Turcatti, G., Naveiras, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput%2C+nonperturbing+quantification+of+lipid+droplets+with+digital+holographic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">High-throughput, nonperturbing quantification of lipid droplets with digital holographic microscopy.</a> Journal of Lipid Research. 59 (7), 1301-1310 (2018).</li>
<li>Ranall, M. V., Gabrielli, B. G., Gonda, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+imaging+of+neutral+lipid+droplets+with+1%2C6-diphenylhexatriene%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">High-content imaging of neutral lipid droplets with 1,6-diphenylhexatriene.</a> BioTechniques. 51 (1), 35-42 (2011).</li>
<li>Schnitzler, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nile+Red+Quantifier%3A+a+novel+and+quantitative+tool+to+study+lipid+accumulation+in+patient-derived+circulating+monocytes+using+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Nile Red Quantifier: a novel and quantitative tool to study lipid accumulation in patient-derived circulating monocytes using confocal microscopy.</a> Journal of Lipid Research. 58 (11), 2210-2219 (2017).</li>
<li>Bombrun, M., Gao, H., Ranefall, P., Mejhert, N., Arner, P., Wählby, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+high-content%2Fhigh-throughput+microscopy+analysis+of+lipid+droplets+in+subject-specific+adipogenesis+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A+the+journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Quantitative high-content/high-throughput microscopy analysis of lipid droplets in subject-specific adipogenesis models.</a> Cytometry. Part A the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (11), 1068-1077 (2017).</li>
<li>Capus, A., Monnerat, M., Ribeiro, L. C., de Souza, W., Martins, J. L., Sant’Anna, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+high-content+image+analysis+for+quantitatively+estimating+lipid+accumulation+in+oleaginous+yeasts+with+potential+for+use+in+biodiesel+production%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technology%22%5BJournal%5D)">Application of high-content image analysis for quantitatively estimating lipid accumulation in oleaginous yeasts with potential for use in biodiesel production.</a> Bioresource Technology. 203, 309-317 (2016).</li>
<li>Lv, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+gene+products+that+control+lipid+droplet+size+in+yeast+using+a+high-throughput+quantitative+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta.+Molecular+and+Cell+Biology+Of+Lipids%22%5BJournal%5D)">Identification of gene products that control lipid droplet size in yeast using a high-throughput quantitative image analysis.</a> Biochimica et biophysica acta. Molecular and Cell Biology Of Lipids. 1864 (2), 113-127 (2018).</li>
<li>Zach, R., Tvarůžková, J., Schätz, M., Ťupa, O., Grallert, B., Převorovský, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+defects+in+fission+yeast+lipid+metabolism+%E2%80%9Ccut%E2%80%9D+mutants+are+suppressed+by+ammonium+chloride%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Research%22%5BJournal%5D)">Mitotic defects in fission yeast lipid metabolism “cut” mutants are suppressed by ammonium chloride.</a> FEMS Yeast Research. 18 (6), 1-7 (2018).</li>
<li>Petersen, J., Russell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+the+Environment+of+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Growth and the Environment of Schizosaccharomyces pombe.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (3), (2016).</li>
<li>Aoki, K., Furuya, K., Niki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schizosaccharomyces+japonicus%3A+A+Distinct+Dimorphic+Yeast+among+the+Fission+Yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Schizosaccharomyces japonicus: A Distinct Dimorphic Yeast among the Fission Yeasts.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2017).</li>
<li>Curran, B. P. G., Bugeja, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+investigations+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Basic investigations in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). , 1-14 (2014).</li>
<li>Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetics+of+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Molecular genetics of Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods in Enzymology. 470 (10), 759-795 (2010).</li>
<li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ImageJ+ecosystem%3A+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Nakamura, T., Pluskal, T., Nakaseko, Y., Yanagida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+coenzyme+A+synthesis+in+fission+yeast+causes+defective+mitosis%2C+quiescence-exit+failure%2C+histone+hypoacetylation+and+fragile+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">Impaired coenzyme A synthesis in fission yeast causes defective mitosis, quiescence-exit failure, histone hypoacetylation and fragile DNA.</a> Open Biology. 2 (9), 120117(2012).</li>
<li>Furuya, K., Niki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+heterothallic+haploid+and+auxotrophic+mutants+of+Schizosaccharomyces+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Isolation of heterothallic haploid and auxotrophic mutants of Schizosaccharomyces japonicus.</a> Yeast. 26 (4), 221-233 (2009).</li>
<li>Ivnitski-Steele, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Nile+red+as+a+fluorescent+substrate+of+the+Candida+albicans+ATP-binding+cassette+transporters+Cdr1p+and+Cdr2p+and+the+major+facilitator+superfamily+transporter+Mdr1p%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of Nile red as a fluorescent substrate of the Candida albicans ATP-binding cassette transporters Cdr1p and Cdr2p and the major facilitator superfamily transporter Mdr1p.</a> Analytical Biochemistry. 394 (1), 87-91 (2009).</li>
<li>Wolinski, H., Kohlwein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+analysis+of+lipid+droplet+metabolism+and+dynamics+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Microscopic analysis of lipid droplet metabolism and dynamics in yeast.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 457 (1), 151-163 (2008).</li>
<li>Graml, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomic+Multiprocess+survey+of+machineries+that+control+and+link+cell+shape%2C+microtubule+organization%2C+and+cell-cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A genomic Multiprocess survey of machineries that control and link cell shape, microtubule organization, and cell-cycle progression.</a> Developmental Cell. 31 (2), 227-239 (2014).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

הבנת חילוף החומרים של השומנים והרגולציה שלה חשובה הן בביולוגיה הבסיסית והן ביישומים הקליניים והביוטכנולוגיים. תוכן LD מייצג בדיקה נוחה של מצב חילוף החומרים של השומנים של התא, עם מיקרוסקופ פלואורסצנטית להיות אחת השיטות העיקריות המשמשות לקביעת תוכן LD. הפרוטוקול המוצג מאפשר זיהוי אוטומטי ותיאור כמותי של הזהות האישית בשלושה זנים שונים ומורפולוגית שמרים ברורים. לידיעתך, לא קיימים כלים. דומים בשביל הביקוע קבצי ה-script הMATLAB הדרושים לעיבוד תמונה נכללים כקבצים משלימים, והם זמינים גם ממאגר המניות (DOI 10.6084/m9. התמונה) יחד ...

שומנים לשחק תפקידים מהותיים באנרגיה התאית פחמן מטבוליזם, סינתזה של רכיבים ממברנה, וייצור של חומרים אקטיביים. חילוף החומרים ליפיד הוא מכוונן בהתאם לתנאי הסביבה, זמינות מזינים ו-מחזור התא שלב1. בבני אדם, חילוף החומרים ליפיד כבר מחובר למחלות, כגון השמנה, סוכרת סוג II וסרטן2. בתעשייה, שומנים שיוצרו על ידי מיקרואורגניזמים, כגון מיאס, מייצגים מקור מבטיח של דלק דיזל מתחדשת3. תאים מאחסנים שומנים ניטרליים ב שנקרא טיפות שומנים בדם (מקרא). הגופים האבולוצדיים הללו מורכבים מטריליגליליפוספלים, אסטרים של שריר, שריר הפוספוליפיד החיצוני וחלבונים משויכים1. המילד מקורם ברשת האנדופלזמית, מחזור התאים או הצמיחה-שלב התפתחות, והם חשובים עבור הומאוסטזיס שומנים סלולריים1. מספר LD ומורפולוגיה ניתן להשתמש כמו פרוקסי נוח כאשר הדבר מטבוליזם השומנים תחת תנאי צמיחה שונים או בעת הקרנת פאנל של מוטציות. בהתחשב האופי הדינמי שלהם, טכניקות מסוגל לנתח את המאפיינים של האדם היחיד מתעניין מחקרים של מטבוליזם השומנים.
מינים שמרים שונים שימשו לתיאור מסלולים מטבולית הקשורים השומנים ואת הרגולציה שלהם, או בשימוש ביוטכנולוגיה לייצר תרכובות מעניינות או דלקים1. יתר על כן, עבור מודלים של מודל, כגון שמרים לבקוע cerevisiae ס או הקשורים ביקוע הקשורות שמרים שיניים, הגנום-רחב מחיקה הספריות זמינים כי ניתן להשתמש עבור תפוקה גבוהה מסכי4,5. לאחרונה LD קומפוזיציה ודינמיקה תוארו ב -S. ביקוע6,7,8,9, מוטציות הקשורות חילוף החומרים השומנים כבר מבודדים במודל המתעוררים שמרים . כן.
טכניקות רבות זמינות כדי ללמוד תוכן LD ודינמיקה. רוב להעסיק סוג כלשהו של כתמים של המכונה עם ליפופילית צבעים כגון הנילוס אדום או BODIPY 493/503. האחרון מראה עירור צר יותר ספקטרום פליטה, ו מוגברת ספציפיות לעבר שומנים ניטרליים (המכונה) לעומת פוספוליפידים (ממברנות)11. פלואורימטריה וזרימה-cytometry שיטות שימשו בהצלחה מינים פטרייתיים שונים כדי לחשוף גנים ותנאי גדילה המשפיעים על אחסון השומנים תוכן12,13,14,15. בעוד ששיטות אלה מתאימות יישומים בעלי תפוקה גבוהה, הם אינם יכולים למדוד את המספרים ואת המבנה של התעודות הזהות הבודדות בתאים, אשר יכולים להיות שונים באופן דרמטי בין תנאי גדילה לבין גנוטיפים. פיזור ראמאן קוהרנטי או מיקרוסקופ הולוגרפי דיגיטלי הן שיטות ללא תווית המפיקות נתונים ברמת LD, אך דורשות ציוד יקר מיוחד16,17,18. מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית, מצד שני, יכול לספק נתונים מפורטים על תוכן LD, תוך שימוש נפוץ מכשירים וניתוח תמונה כלי התוכנה. קיימות מספר זרימות עבודה של ניתוח התכונות דרגות שונות של תחכום ואוטומציה בזיהוי תא/LD מנתוני תמונה, והם ממוטבים עבור סוגי תאים שונים, כגון תאים מטזובן עם מזהה גדול19,20 , , עשריםושבעה. חלק מגישות אלה פועלות רק ב-2D (לדוגמה, בתמונות הקרנה מרביות), שעשויות להיכשל באופן מהימן בתיאור התוכן התאי של ה-LD. לידיעתך, לא קיימים כלים לקביעת תוכן LD ומורפולוגיה מנתונים מיקרוסקופיים שמרים ביקוע. פיתוח של ניתוח ברמת LD אוטומטי וחסון יביא רגישות מוגברת ועוצמה סטטיסטית משופרת, ולספק מידע עשיר על תוכן ניטרלי השומנים, באופן אידיאלי במינים שמרים מרובים.
פיתחנו זרימת עבודה עבור ניתוח תוכן LD מתוך 3D תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטית של תאים שמרים. תאים חיים מוכתמים עם BODIPY 493/503 ו דטרן כחול מדורגת כדי להמחיש התעודות ולקבוע גבולות התא, בהתאמה. תאים הם מקיבוע על שקופיות זכוכית נתון הדמיה z-מחסנית באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצלי סטנדרטי. התמונות מעובדות לאחר מכן על-ידי צינור אוטומטי מיושם ב-MATLAB, חבילה נפוצה (מסחרית) עבור ניתוחים סטטיסטיים. הצינור מבצע עיבוד מקדים של תמונה, פילוח (תאים לעומת רקע, הסרת תאים מתים) ו-LD זיהוי. נתונים עשירים ברמת LD, כגון גודל LD ועוצמת קרינה, מסופקים לאחר מכן בתבנית טבלאית התואמת לכלי תוכנה מרכזיים בגיליון אלקטרוני. זרימת העבודה שימש בהצלחה כדי לקבוע את ההשפעה של זמינות מקור חנקן על חילוף החומרים לשומנים ב -S. ביקוע24. כעת אנו מדגימים את הפונקציונליות של זרימת העבודה ב -s. ביקוע, s. הפקוניקוס ו -s. cerevisiae ס, באמצעות תנאי צמיחה או מוטציות המשפיעות על תוכן LD סלולרי.

<table><tbody><tr><td>מצלמת CCD מונוכרומטית 12 סיביות Hamamatsu ORCA C4742-80-12AG</td><td>Hamamatsu</td><td>&nbsp;</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>מלח אדנין המיסולפט, &ge; 99%</td><td>Merck</td><td>A9126-25G</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>BODIPY 493/503 (4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3922</td><td>לצביעת שומנים ניטרלית</td></tr><tr><td>D-(+) - גלוקוז, &ge; 99.5%</td><td>Merck</td><td>G7021</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, אניוני, ליזין Fixable</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1976</td><td>לצביעה שלילית של תאים</td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד, &ge; טוהר 99.5%</td> <td>Merck</td><td>D4540</td><td>ומעלה, שמור נטול מים על מסננות מולקולריות</td></tr><tr><td>מרק EMM ללא דקסטרוז</td><td>ניתן</td><td></td><td>להכין מדיום PMD0405 מדיום גם מרכיבים בודדים</td></tr><tr><td>תוכנת פיג'י/ImageJ</td><td>NIH</td><td>&nbsp;</td><td>או שווה ערך; לבדיקה ויזואלית של נתונים מיקרוסקופיים</td></tr><tr><td>משקפי כיסוי דיוק גבוה, 22 מ"מ x 22 מ"מ, מס' 1.5</td><td>VWR</td><td>630-2186</td><td>משתמשים בכל זכוכית כיסוי # 1.5</td></tr><tr><td>ארגז כלים לעיבוד תמונה עבור MATLAB, גרסה 10.0</td><td>Mathworks</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>לקטין מבית גליצין מקס (פולי סויה)</td><td>Merck</td><td>L1395</td><td>לקיבוע תאים בשקופיות</td></tr><tr><td>תוכנת MATLAB, גרסה 9.2</td><td>Mathworks</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>שקופית מיקרוסקופ, 26 מ"מ x 76 מ"מ, עובי 1 מ"מ</td><td>Knittel Glass</td><td>L762601.2</td><td>השתמש בכל שקופית מיקרוסקופ המתאימה לשלב המיקרוסקופ שלך, נקה היטב לפני טעינת תאים</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ Olympus CellR עם תנועת אובייקטיבית אוטומטית של ציר z</td><td>אולימפוס</td><td>&nbsp;</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>סט מסנני פנטבנד</td><td>Semrock</td><td>F66-985</td><td>ערוצים בהירים, ירוקים וכחולים מספיקים</td></tr><tr><td>ארגז כלים לעיבוד אותות עבור MATLAB, גרסה 7.4</td><td>Mathworks</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>תוספי SP</td><td>למדיום</td><td>PSU0101</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>מחשב משרדי סטנדרטי המסוגל להריץ את MATLAB</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ארגז כלים לסטטיסטיקה ולמידת מכונה עבור MATLAB, גרסה 11.1</td><td>Mathworks</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>פפטון אוניברסלי M66 למיקרוביולוגיה</td><td>Merck</td><td>1070431000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>UPLSAPO 60XO אובייקטיבי</td><td>אולימפוס</td><td>&nbsp;</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>Formedium</td><td>YEA03</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>בסיס חנקן שמרים ללא חומצות אמינו</td><td>Formedium</td><td>CYN0405</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

ניתוח של השומנים שומנים תוכן ביקוע והנצה ליעדים באמצעות עיבוד תמונה אוטומטית

Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing

חילוף החומרים ליפיד והרגולציה שלה הם בעלי עניין הן בסיסיות והן מדעי החיים המוחלים וביוטכנולוגיה. בהקשר זה, מינים שמרים שונים משמשים כמודלים במחקר חילוף חומרים לשומנים או לייצור השומנים התעשייתי. טיפות השומנים הם גופי אחסון דינאמי מאוד והתוכן הסלולרי שלהם מייצג הבדיקה נוח של מצב מטבולית השומנים. מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית היא שיטה של בחירה עבור ניתוח כמותי של טיפות שומנים סלולריים, כפי שהוא מסתמך על ציוד זמין נרחב מאפשר ניתוח של טיפות שומנים בודדים. יתר על כן, ניתוח תמונה מיקרוסקופיים יכול להיות אוטומטי, הגדלת מאוד התפוקה הכוללת הניתוח. כאן, אנו מתארים זרימת עבודה ניסיונית ואנליטית עבור זיהוי אוטומטי ותיאור כמותי של טיפות שומנים בודדות בשלושה מינים שונים של שמרים מודל: ביקוע שיאת הביקוע ו . והשמרים השיכחויות טיפות ליפידים הם דמיינו עם bodipy 493/503, ו תוספי תא-הניאון מתווסף למדיית התרבות כדי לעזור לזהות גבולות התא. תאים חשופים למיקרוסקופיה אפיפלואורסצנטית תלת-ממדית בערוצים ירוקים וכחולים והתמונות של מחסנית z מעובדות באופן אוטומטי על-ידי צינור MATLAB. ההליך פלט נתונים כמותיים עשיר על השומנים הסלולר תוכן droplet ומאפיינים בודדים droplet השומנים בפורמט טבלאי מתאים ניתוח במורד הגיליון האלקטרוני או חבילות סטטיסטיות. אנו מספקים למשל ניתוחים של שומנים בתוכן droplet בתנאים שונים המשפיעים על חילוף החומרים של השומנים הסלולריים.

ההליך כולו מסוכם באיור 1 עבור ביקוע (זרימת העבודה של שמרים מדומה מקבילה), ומתחת אנו מספקים דוגמאות לאופן שבו ניתן להשתמש בזרימת העבודה כדי ללמוד תוכן LD בשלוש זנים שמרים שונים בתנאים שונים הידועים להשפיע על תוכן LD סלולרי. כל דוגמה מייצגת ניסוי ביולוגי אחד.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59889/59889fig01v2.jpg"> איור 1: דיאגרמה סכמטית של זרימת העבודה הניסיונית והאנליטית. זרימת העבודה ...

כאן, אנו מציגים יישום MATLAB של זיהוי אוטומטי ותיאור כמותי של טיפות שומנים בתמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטית של ביקוע ותאי שמרים.

Lipid metabolism and its regulation are of interest to both basic and applied life sciences and biotechnology. In this regard, various yeast species are ...

פרוטוקול זה מאפשר ניתוחים כמותיים בקנה מידה קטן עד גדול של תוכן השומנים באחסון התאים במגוון מיני שמרים והוא עושה זאת בצורה לא משוחדת ומתקנת. הטכניקה מאפשרת עיבוד מהיר של תמונות מיקרוסקופיות ומספקת יציאות כמותיות מפורטות כדי להשוות בקלות דגימות כגון מוטנטים ותאים שונים הגדלים בתנאים מגוונים. כדי להתחיל, בצע בפרוטוקול הטקסט הנלווה כדי להכין את פתרונות הכתמים, המדיה התרבותית והתאים.ודא כי התאים בריאים בשלב הצמיחה הרצוי לפני הפעלת הניסוי. לאחר מכן, הכינו כיסוי מיקרוסקופ כדי שכל דגימה תדמיין. מורחים מיקרוליטר אחד של פתרון ציפוי שקופיות על גבי כיסוי נקי באמצעות הצד הארוך של קצה פיפסה במיקום אופקי.אפשר לפתרון הציפוי להתייבש לחלוטין, ולאחר מכן אחסן את הכיסויים בסביבה נטולת אבק. לאחר מכן, למדוד את הצפיפות האופטית של תרבויות התא, ועל תרבויות להיות מנותח באותו שלב הצמיחה, לנסות להגיע לערכים דומים בין כל התרבויות שנבדקו כדי להבטיח תנאים ניסיוניים דומים. לאחר מכן, פיפטה מיליליטר אחד של תרבות התא לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר.עבור תאי S.cerevisiae בלבד, להוסיף חמישה microliters של פתרון ציפוי שקופית לצינור גם כן. לאחר מכן, בקצרה מערבולת כל צינורות microcentrifuge, ו דגירה אותם ב 30 מעלות צלזיוס עם רועד במשך חמש דקות. לאחר מכן, מוסיפים מיקרוליטר אחד של פתרון כתמי השומנים לכל עליקוט תרבות, ומערבולת אותם בקצרה.לאחר מכן, הוסף 10 מיקרוליטרים של פתרון הדמיה של גבול התא, ומערבולת אותם לזמן קצר בפעם השנייה. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה אותם ב 1, 000 פעמים כוח הכבידה במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. בסיום הסיבוב, הסר 950 מיקרוליטרים מהעל-טבעי ולהשתמש מחדש בתאים בעל-טבעי הנותר באמצעות פיפטה.לאחר מכן, פיפטה שני מיקרוליטרים של ההשעיה התא צפוף על כיסוי מצופה לטין. לאחר מכן, מניחים את הכיסוי על שקופית מיקרוסקופ נקי כדי ליצור monolayer תא, ולהמשיך מיקרוסקופיה מהר ככל האפשר כדי למזער ממצאים בהדמיה. הגדרת המיקרוסקופ דורשת חשיפות ארוכות למקורות אור חזקים העללים לגרום נזק לדגימה ולהטות תוצאות.לכן, להגדיר את תנאי ההדמיה באמצעות שקופית מדגם ייעודי כי לא ישמש עוד יותר עבור כימות טיפת השומנים. מקם את הדגימה הייעודית על הבמה של ניגודיות פאזה או הגדרת מיקרוסקופ ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית, והתמקד בתאים. בתוכנת המיקרוסקופ, הגדר את הגדרות מחסנית Z כך שהן ישתרעו על-פני כל אמצעי האחסון של התא.המרחק האנכי הכולל תלוי בגודל התא, ומספר הפרוסות האופטיות תלוי בצמצם המספרי של המטרה. לאחר מכן, הגדר את המוקד כך שזז יחסית למישור המוקד המרכזי. כדי לדמיין טיפות שומנים, הגדר באופן ניסיוני את עוצמת האור ותזמן החשיפה בערוץ הירוק.להיות זהיר בעת הדמיה, כמו BODIPY הוא פלואורוכרום בהיר מאוד שעשוי להיות photobleached במהירות. בנוסף, למזער את זמן החשיפה כדי למנוע תיסה יתר. לכוד תחילה את מחסנית Z בערוץ הירוק המלא לפני המעבר לערוץ הכחול כדי למנוע טשטוש טיפות השומנים הניידות.לתדמית גבולות תא, קבעו באופן ניסיוני את עוצמת האור ואת זמן החשיפה בערוץ הכחול. במידת האפשר, הגדר ולהשתמש בזרימת עבודה ניסיונית אוטומטית בתוכנת הבקרה של המיקרוסקופ כדי להקל על הדמיה של דגימות מרובות בתנאים סטנדרטיים. חשוב לציין שיש לרכוש את כל התמונות באמצעות אותן הגדרות כדי לאפשר השוואה מתאימה בין דוגמאות.לאחר אופטימיזציה של תנאי ההדמיה, התמקדו בתאים ודמיינו אותם בערוצים הירוקים והכחולים. תמונה שדות תצוגה מרובים לכל דוגמה כדי להשיג נתונים חזקים ומייצגים. שמרו את תמונות הערימה Z בערוץ הכחול והירוק כקובצי TIFF מרובי שכבות של 16 סיביות.הקפד לכלול את המילים ירוק או כחול בשמות הקבצים המתאימים. פתח תמונות מיקרוסקופיות ב- ImageJ, והסר את כל ערימות התמונות המכילות מספר ניכר של תאים שהוזזו במהלך הרכישה. אלה מופיעים במיקומים שונים במקטעי Z בודדים.לאחר מכן, הסר את כל ערימות התמונות המכילות חלקיקים פלואורסצנטיים מאוד שאינם תאים בתעלה הכחולה. זה נגרם לעתים קרובות על ידי לכלוך על משטח ההדמיה או זיהומים במדיום הטיפוח ועשוי להפריע לגילוי תאים בסביבתם. כמו כן, הסר את כל ערימות התמונות המכילות חלק גדול מהתאים המתים.תמונות אלה יציגו תאים עם פלואורסצנטיות כחולה מוגברת בהשוואה לתאים החיים. בעוד נוכחותם של כמה תאים מתים המדגם היא בדרך כלל לא בעיה ותאים אלה נמחקים באופן אוטומטי במהלך הניתוח, כמה תאים מתים או גוססים עשויים מדי פעם להיות מזוהים כתאים חיים על ידי אלגוריתם פילוח ובכך להטות את התוצאות שדווחו. כדי להתחיל בניתוח ב- MATLAB, צור תחילה תיקיה ראשית והעתק את כל קבצי ה- Script של MATLAB למיקום זה.לאחר מכן, צור תיקיות משנה עם השמות של מיני השמרים השונים, והעתק את תמונות TIFF המתאימות למיקומים אלה. עכשיו, להתחיל MATLAB, לפתוח את התסריט הראשי. ותריץ את התסריט.בתפריט, בחר את מיני השמרים שיש לנתח והתחל בעיבוד תמונה. בדוק ועיבד את קבצי הפלט כנדרש באמצעות עורך גיליון אלקטרוני או חבילה סטטיסטית. זרימת העבודה מפיקה קבצי CSV מופרדים באמצעות נקודה-פסיק וקבצי TIFF מקופלים עם אובייקטי תא שזוהו ו טיפות שומנים.מוצגים כאן תאי S.pombe מסוג פראי שגודלו במדיום YES המורכב או במדיום EMM המוגדר. בהשוואה לתאים הגדלים במדיום YES, זוהו פחות טיפות שומנים ועוצמת כתמים גבוהה יותר ליחידת נפח תאים במדיום EMM. יתר על כן, טיפות שומנים בודדים שנוצרו במדיום EMM היו גדולים יותר והוצגו בעוצמת כתמים כוללת מוגברת.זאת בהסכמה עם ממצאים קודמים של תוכן שומנים מאוחסן מוגבר בתאים הגדלים ב- EMM. לאחר מכן, תמונות אלה מראות תאי S.japonicus מתרבויות אקספוננציאליות ותחילת נייחות גדל במדיום כן. תאים שנכנסו לשלב נייח הראו ירידה ניכרת במספר טיפות השומנים ליחידת נפח התאים, בעוד שעוצמת פלואורסצנטיות טיפת השומנים מנורמלת בנפח ירדה מעט בין שני התנאים.טיפות השומנים הראשונות בשלב נייח היו בדרך כלל גדולות יותר במתינות בגודלן ועוצמת הפלואורסצנטיות הכוללת גבוהה למדי בהשוואה ל טיפות מתאים הגדלים באופן אקספוננציאלי. בתאי S.cerevisiae שגדלו לשלב אקספוננציאלי לעומת נייח, תאים נייחים הכילו מעט פחות טיפות שומנים ליחידת נפח בהשוואה לתאים הגדלים באופן אקספוננציאלי. עם זאת, עוצמת פלואורסצנטיות טיפה מנורמל נפח שלהם כמעט הוכפל.עלייה חדה זו בתתוכן טיפת השומנים הכולל נבעה מעוצמת פלואורסצנטיות גבוהה בהרבה ונפח של טיפות שומנים בודדים בשלב נייח. בעקבות הליך זה, ניתן לצבור נתוני פלט בחבילה סטטיסטית כגון R כדי ליצור התוויות של תוצאות מסוכמות ולהפעיל בדיקות סטטיסטיות על כל ההבדלים שנצפו בתוכן טיפת השומנים. באופן עקרוני, צינור עיבוד התמונה יכול לשמש לניתוח של תוכן טיפת השומנים במיקרואורגניזמים אחרים או לנתח מבנים תת-תאיים אחרים דמויי נקודה.

analysis-lipid-droplet-content-fission-budding-yeasts-using-automated

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

אנו מתארים שיטה חדשה lipidomics כמותי לזיהוי שומנים מינים רבים שמרים באמצעות סקר סריקה יינון electrospray ספקטרומטריית מסה (ESI / MS). שיטה זו עולה כיום השיטות הזמינות לזיהוי שומנים וכימות ביכולת לפתור צורות מולקולריות שונים של שומנים, רגישות, ומהירות.

הערכה כמותית של Lipidome שמרים באמצעות Ionization electrospray ספקטרומטריית מסה

שתי טכניקות לבידוד טיפות שומנים סלולריות מ1) תאי שמרים ו2) שליות אדם מוצגות. במרכזו של שני ההליכים הוא צנטריפוגה שיפוע הצפיפות, שבו השכבה הצפה וכתוצאה מכך המכילה טיפות ניתן דמיינו בקלות על ידי העין, שחולצה, ולכמת על ידי ניתוח כתם מערבי לטוהר.

בידוד של טיפות שומנים נייד: שתי טכניקות טיהור החל מתאי שמרים ושליות אדם

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול כדי להשיג את השומנים droplet אינדקס (אינדקס LD) ללמוד את הדינמיקה של triacylglycerols בתאים בתרבית בניסויים תפוקה גבוהה. LD אינדקס וזמינותו היא שיטה קלה ומהימנה של המשתמשת BODIPY 493/503. Assay הזה אינו צריך שאיבת השומנים dispendious או ניתוח מיקרוסקופ.

השומנים נחישות אינדקס על-ידי קרינה פלואורסצנטית נוזלי השחזור של פטריות פתוגניות זקן התירס פחמון

פרוטוקול זה מתאר את הניתוח של מסומן בתוך התאים התאיים בתוך שמרים באמצעות מרובת צבעים 4d (זמן הפקיעה 3d) קונפוקלית מיקרוסקופ. הפרמטרים הדמיה נבחרים כדי ללכוד אותות הולמים תוך הגבלת photodamage. תוספים מותאמים אישית של ImageJ מאפשרים מבנים עם תוויות למעקב וניתוח כימות.

4D מיקרוסקופ של שמרים

כאן, אנו מציגים הדמיה תא חי שהיא שיטת מיקרוסקופ לא רעיל המאפשר לחוקרים ללמוד התנהגות החלבון הדינמיקה הגרעינית בתוך חי ביקוע תאים שמרים במהלך מיטוזיס ו meiosis.

בחינת Mitotic ומיוטיק ביקוע הדינמיקה הגרעינית על ידי הזריחה לחיות-מיקרוסקופ התא

אנו מציגים פרוטוקול באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטר מסה דו-מושביים כדי לזהות ולכמת ליפידים סלולריים עיקריים ב סכביסים cerevisiae ס. השיטה המתוארת להערכה כמותית של שיעורי השומנים העיקריים בתוך תא שמרים הוא רב-תכליתי, חסון ורגיש.

ניתוח כמותי של הליפידום הסלולר באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית משולב עם טנדם מסה ספקטרומטריה

במסמך זה, אנו מדגימים פרוטוקול מותאם BODIPY 493/503 מבוסס פלואורסצנטיות לאפיון טיפות שומנים ברקמת הכבד. באמצעות שימוש בהקרנות אורתוגונליות ושחזורים תלת-ממדיים, הפלואורופור מאפשר הבחנה מוצלחת בין סטאטוזיס מיקרו-שלפוחית וסטאטוזיס מקרו-שלפוחית ועשוי לייצג גישה משלימה לפרוטוקולים ההיסטולוגיים הקלאסיים להערכת סטאטוזיס בכבד.

ניתוח טיפות שומנים מוכתמות פלואורסצנטיות עם שחזור תלת ממדי להערכת סטאטוזיס בכבד

המחקר הנוכחי מתאר מתודולוגיות מבוססות דה-צלולריזציה להדמיה וכימות של שקיעת רקמת שומן תוך-שרירית (IMAT) באמצעות נפח שריר שלם, כמו גם כימות מדדים של אדיפוציטים בודדים המרכיבים IMAT.

כימות מבוסס דה-צלולריזציה של חדירת שומן בשרירי השלד

שמרי ביקוע משמשים כאן כפונדקאי הטרולוגי לביטוי חלבוני שלד ציטו-שלד חיידקיים כגון FtsZ ו-MreB כחלבוני היתוך תרגומיים עם GFP כדי להמחיש את הפילמור שלהם. כמו כן, תרכובות המשפיעות על פילמור מזוהות על ידי הדמיה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

שמרי ביקוע כפלטפורמה למסכי תרופות אנטיבקטריאליים המכוונים לחלבוני שלד ציטו-בקטריאלי

ליפופגיה היא צורה סלקטיבית של אוטופגיה הכוללת פירוק של טיפות שומנים. תפקוד לקוי בתהליך זה קשור להתפתחות סרטן. עם זאת, המנגנונים המדויקים עדיין לא מובנים במלואם. פרוטוקול זה מתאר גישות הדמיה כמותית כדי להבין טוב יותר את יחסי הגומלין בין אוטופגיה, מטבוליזם של שומנים והתקדמות סרטן.

חקר הוויסות של קטבוליזם טיפות שומנים באמצעות ליפופגיה

פרוטוקול זה מפרט שתי שיטות לעצירת מחזור תאי שמרים ושחרור אופציונלי, ומרחיב על השימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית לחקר תהליכים תלויי מחזור תא ב-S. cerevisiae.

מניפולציה וניתוח של תהליכים תלויי מחזור התא בשמרים ניצנים

למדו לנתח טיפות שומן ב-Saccharomyces cerevisiae ומיני שמרים נוספים באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה ועיבוד תמונה אוטומטי ב-MATLAB. שיטה זו מאפשרת הערכה כמותית מהירה ובלתי מוטה של אחסון שומנים תוך-תאי.

ניתוח של השומנים שומנים תוכן ביקוע והנצה ליעדים באמצעות עיבוד תמונה אוטומטית

גלה סרטונים נוספים