שיטת היווצרות טרום-סינפסה באמצעות חרוזי סדרן ותרבות "תא כדור"

פרוטוקול זה מתאים לחקור היכן נובעים חלבונים קדם-סינפטיים:גופי תאים או אקסונים. וכיצד חלבונים פרה-סינפטיים מצטברים ב presynapses באופן מאורגן במהלך היווצרות הסינפסה. טכניקה זו יכולה לגרום לאלפי presynapses בו זמנית, ואינו משתמש בכל מנגנון מיוחד כדי לשמור על אקסונים בתרבות המאפשר ניתוח יעיל של היווצרות של presynapses רבים אקסונים.

יחד עם סטודנט לתואר שני, הונאמי, המדגים הליך זה יהיה רי אישיאי, סטודנט לתואר ראשון במעבדה שלי. התחל הליך זה עם המתת חסד של העכבר כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לנתח את הבטן כדי להשיג עוברים E16.

הסר את המוחות מעוברים בזהירות בעזרת ממטרים עדינים, ולהעביר אותם לתוך 60 מילימטר תאים תכלית מנות המכילות ארבעה מיליליטר של תווי מלח מאגר HEPES או HBSS. הסר את קרום ההת קרום והלב וחותך את נורת הריח. יש להפריד את הקורטיקס מכל חצי כדור מוחי באמצעות קצות מלקחיים עדיפים מתחת למיקרוסקופ הסטריאו ולהעביר לצלחת נוספת של 60 מ"מ המכילה HBSS טרי.

השתמש לפחות בשלושה עד חמישה עוברים עבור כל תרבות כדור נוירון נפרדת. חותכים את קליפות המוח לחתיכות קטנות עם מספריים האביב microdissecting במכסה המנוע של תא זרימה למינארית. עכשיו, להעביר קליפות טחון לצינור 15 מיליליטר.

טריפסין קליפת המוח טחון בארבעה מיליליטר של 0.125% טריפסין ב HBSS במשך 4.5 דקות באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס. העבר את צבירות התא לצינור חדש של 15 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של HBSS על ידי פיפטה העברה סטרילית. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות לפני לחזור על שלב זה עוד פעם אחת.

לאחר מכן העבר את צבירות התאים לצינור חדש של 15 מיליליטר המכיל שני מיליליטר של NGB בינוני, 0.01%DNase I ו- 10% סרום סוסים. Triturate קליפות טריפסיה על ידי צינורות שוב ושוב אותם למעלה ולמטה שלוש עד חמש פעמים באמצעות פיפטה פסטור זכוכית מלוטש אש. להכנת כדורי נוירון, להתאים את צפיפות התא בהשעיית התא למיליון תאים למיליליטר באמצעות מדיום NGB.

הוסף שבעה מיליליטר של PBS לחלק התחתון של מנות התרבות. תרבות הנוירונים קליפת המוח כמו 10 טיפות תלויות microliter המכיל 10, 000 תאים לכל טיפה בתוך המכסים העליונים של מנות תרבות 10 ס"מ. שמור את הכלים באינקובטור במשך שלושה ימים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 בתנאים לחים כדי לאפשר היווצרות כדור נוירון.

מעיל פולי-L-ליסין או PLL על כיסוי זכוכית חרוזים פרפין מחליק במנות 60 מילימטר באמצעות תווי PLL 15 מיקרוגרם למיליליטר במאגר borate. שמור אותם לפחות שעה אחת באינקובטור CO2 ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר שטיפה ארבע פעמים עם PBS, להעביר את החלקות כיסוי מצופה PLL לצלחת ארבע באר המכיל 350 microliters של מדיום NGB עם שלושה micromolar AraC בכל באר.

AraC מתווסף לתקשורת כדי להרוג תאים מתחלקים. הדגירה של ארבע צלחות היטב המכילות את החלקות כיסוי מצופה PLL באינקובטור CO2 לפחות 20 דקות כדי להבטיח את הטמפרטורה של המדיום מגיע 37 מעלות צלזיוס לפני העברת כדורי הנוירון. ב DIV 3 כאשר כדורי נוירון נוצרים היטב, להעביר אותם על תלושי כיסוי מצופה PLL.

בתוך צלחת ארבע באר, להוסיף חמישה כדורי נוירון לכל באר. ב DIV 11 להעביר 20 microliters מן ההשעיה של חלקיקים מגנטיים מצופים סטרפטבידין לצינור מיקרוצנטריפוגה. לשתק את חרוזים מכשיר בעבודת יד מחובר עם מגנטים קבועים ניאודימיום ולשטוף שלוש פעמים עם 100 microliters של PBS-MCBC ב 1.5 מיליליטר מיקרוצנטריפוגה צינורות.

לאחר הסרה מוחלטת של PBS-MCBC מהחרוזים, הוסף נפח קבוע מראש של מניית LRRTM2 לקדימות השטופות. דגירה את התערובת באמצעות מסובב בארבע מעלות צלזיוס במשך שעה עד שעתיים. לאחר הדגירה, לשטוף את חרוזים פעמיים עם 100 microliters של PBS-MCBC.

לאחר מכן, לשטוף את חרוזים עם 100 microliters של בינוני NGB. תן שימוש חוזר ב-LRRTM2 ב-50 מיקרוליטרים של מדיום NGB ליישום לתרבות כדור הנוירונים. עכשיו לחתוך את הקצה של קצה צהוב בזווית של 45 מעלות עם סכין גילוח מתחת למיקרוסקופ סטריאו.

שים את קצה הקצה הצהוב על אזור גוף התא של כדור נוירון ולהסיר את גופי התא על ידי יניקה. החל את LRRTM2 ולשלוט חרוזים על תרבות כדור נוירון. ואז להטביע את חרוזים לתחתית הצלחות של תרבות כדור נוירון במשך דקה אחת באמצעות מגנטים פריט להתחיל היווצרות טרום סינפסה.

הליך זה מבטיח טאצ'דאון כל חרוזים בו זמנית. לתקן ולהכתים את הנוירונים בתרבות כדור הנוירון לאחר היווצרות טרום סינפסה עם חרוזים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לכוד ניגודיות הפרעות דיפרנציאליות ותמונות immunofluorescence תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך עם מצלמת CCD מקורר באמצעות עדשת טבילת שמן 60X.

למדוד את עוצמת שפעת האימונו ב pre-סינפסות באקסון. השתמש התעצמויות immunofluorescence של האזור של עניין על חרוזים. מינוס עוצמת אזור חרוזים כבוי מחולק בעוצמה האקסונאלית, לאורך 20 מיקרון מהחרוזים.

מינוס עוצמת רקע. עוצמת יחס זו מספקת את מדד הצטברות החלבון. כדי לכמת את רמת ההצטברות של חלבון מסוים ב presynapse המושרה עם חרוזי LRRTM2, תמיד לבחור את האזור כי הוא שני שדות תצוגה או יותר מלבד גוף התא.

למדידה מדויקת, בחרו חמישה שדות אקסונאליים שונים לכיסוי. מוצג כאן הוא היישום של חרוזים LRRTM2 לתוך תרבות כדור נוירון ב DIV 11 הצטברות המושרה של Munc18-1 ב presynapses של אקסונים של כדורי נוירון. חרוזים על אקסונים של כדורי נוירון גלויים בתמונות מיקרוסקופיה שלב.

והצטברות של חלבונים presynaptic נצפו על ידי תמונות immunofluorescence. אפילו אקסונים אשר מוסרים גופי תא, הצטברות של Munc18-1 נצפתה מתחת לחרוזים, בדומה אקסונים של כדורי נוירון עם גופי תא. כאשר האזור ההיקפי של גיליון האקסונאלי נותח על ידי עדשה אובייקטיבית הגדלה גבוהה, vGlut1 ו Munc18-1 הצטברו בבירור presynapses של אקסונים מתחת חרוזים עם וללא גופי תא.

ניסויים בקורס זמן הראו כי הצטברות vGlut1 ב presynapses גדל באופן משמעותי ב 30 דקות. מצד שני, הצטברות מונק18-1 החלה לגדול באופן משמעותי בשעה שעתיים והגיעה לרמה של ארבע שעות. נתונים אלה מצביעים על כך חלבון קדחת סינפטית vGlut1 מצטבר presynapses מוקדם יותר מאשר חלבון האזור הפעיל Munc18-1.

הצטברות Munc18-1 ב presynapses של נוירונים Fmr1-KO גדל פי 1.5 יותר מאשר אלה בסוג הבר, המציין מעורבות של FMRP ב Munc18-1 הצטברות. מעכב סינתזת חלבונים, אניסומיצין, דיכא את הצטברות Munc18-1 באופן משמעותי באקסונים עם ובלי גופי תאים. הדבר מצביע על כך שההצטברות תלויה בסינתזת חלבונים.

צינורות קליפת המוח טריפסינית באמצעות פיפטה פסטור זכוכית מלוטש אש היא צעד חשוב. ניסויים מכינים את הפיפסות המלוטשים באש בקוטר של שניים עד שלושה קטרים שונים, ובחרו פיפטה בקוטר מתאים. באמצעות הליך זה, שחרור סינפטי מ presynapses המושרה על ידי קדימות LRRTM2 נמדד על ידי הדמיה חיה.

שיטה נוספת זו תענה אם סינתזת חלבונים באקסונים מעורבת ברגולציה של שחרור סינפטי. בשיטה זו, החוקרים בוחנים כיצד חלבונים פרזינאפטיים מצטברים ב presynapses בצורה מאורגנת, כמו גם את המיקום של המקור של חלבונים presynaptic.