Name: בגילוי המוליל אוסף והחיסונים של מטרהיזיפיאוס לתוך ריפיקו מיקרופלוס קרציות לקראת לימודי חסרי חוליות פתולוגיה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: חקור איסוף המוליף וחיסון פטריות בקרציות Rhipicephalus microplus. שיטה זו מאפשרת לחוקרים ללמוד על מנגנוני התגובה החיסונית של פרוקי רגליים לפתוגנים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה היה ממומן בחלקו על ידי המלון העליון (שכמיות) מברזיל, קוד כספים מספר 001. גלימות סיפקה מלגת דוקטורט עבור A.F. מרציאנו. אנו מודים למועצה הלאומית לפיתוח מדעי וטכנולוגי (CNPq) של ברזיל למתן מלגת דוקטורט לג פיורארוטי. מחקר זה היה נתמך גם על ידי מענקים של קרלוס חגיאס קרן Filho לחקר מדינת ריו דה ז'ניירו (FAPERJ) ו CNPq. V.R.E.P. Bittencourt הוא חוקר CNPq.

קרציות ששימשו במחקר הנוכחי התקבלו ממושבה מלאכותית, הנסבית באוניברסיטה הכפרית הפדרלית של ריו דה ז'ניירו, שיטות שאושרו על ידי הוועדה על אתיקה לשימוש בעלי חוליות (CEUA-IV/UFRRJ037/2014).
1. שנתות הנקבות
<ol><li>לאחר מפגש שנתות, לשטוף את הנקבות הנפוח באמצעות מי ברז לטבול אותם 0.5% (v/v) נתרן היפוכלוריט עבור 3 דקות ב-500 mL זכוכית בגביע הנמען, עבור היגיינה לקוטיקולה (איור 1), ואז לייבש את כל הנקבות באמצעות מגבות נייר סטרילי (איור 2).</li>
	<li>חלוקת נקבות קבוצות משוקלל הומוגנית (עם 20 הנקבות כל אחד): קבוצה אחת ללא כל טיפול, קבוצת שליטה אחת מחוסנת עם 5 μL של 0.1% polyoxyethylene ביתן מונאובית מימית פתרון (v/v), ואחד נגוע הקבוצה מחוסן עם 5 μL ב 1.0 x 10 שבעה בלסטונבגים mL-1. הערה: רק קרציות שאינן מטופלות שימשו לריכוז אמצעי האחסון והדימום. שלושה משכפל של כל קבוצה בוצעו.</li>
</ol>2. גורמי פתוגנים בין הסטום לבין הקפיאולום
הערה: במחקר הנוכחי, שentomopathogenic פטריות שימשו כדוגמה.
<ol><li>השעיה פטריות בלייסטינבגים ב 1 מ ל של 0.1% polyoxyethylene יתן מונאובית הפתרון מימית (v/v) ולהתאים לריכוז הסופי של 1.0 x 107 בלסטונבגים mL-1. הוסף הארכה של 5 μL Metarhizium (איור 3) ההשעיה על פני השטח של סרט פרפין פלסטיק. הערה: מטרהיזיאום בלסטונבגים הבולם הותאם באמצעות תא נויבאואר ́s. כדי להאיץ את תהליך החיסונים, בועות מרובות ניתן להוסיף משטח הסרט פרפין פלסטיק, כל בועה המתאימה 5 μL.</li>
	<li>השתמש 1 mL מזרק משובח במיוחד אינסולין ו מחט 0.3 מ"מ כדי למשוך את ההשעיה והאיחסן אותו לתוך הקרצייה. זכור להוציא את כל האוויר מתוך המזרק לפני השימוש בו.</li>
	<li>האיחסן 5 μL של התליה פטרייתי לתוך הנקבה שנתות בין scutum ו capitulum. איחסן נשים מקבוצת הביקורת עם 5 μL של 0.1% ביתן מימית הפתרון (v/v) ללא פטריה. הערה: נפח קטן של המוליקמ עשוי להיות נוכח על foramen לאחר החדרת מחט. . היזהר לא להיות בחיסון</li>
</ol>3. החיסונים של פטריות entomopathogenic בין ירך הרגל לבין גוף הקרציה
<ol><li>הנשים הנחסן עם הבולם פטרייתי (5 μL ב 1.0 x 107 blastospores mL-1) בין הרגל טיי ואת הגוף של הנקבה, באמצעות מזרק 1 mL במיוחד אינסולין משולב למחט 0.3 מ"מ. איחסן נשים מקבוצת הביקורת עם 5 μL של 0.1% ביתן מימית הפתרון (v/v). הערה: כאשר החיסון מבוצע בין טיי לבין הגוף הנשי, נפח קטן של המוליקמ ניתן להציג על טיי לאחר החדרת המחט. . היזהר לא להיות בחיסון</li>
</ol>4. אוסף של המוליע
<ol><li>השתמש בחלק הגומי של ערכת אינפוזיה מכונפת, שפופרת קפילר 0.3 מ"מ, וטיפ מסונן לביצוע אוסף המוליקמ.</li>
	<li>יש לשבש את הקוטיקולה הנשית בעזרת מחט 0.3 מ"מ.</li>
	<li>לאחר הפרעה, להחיל לחץ עדין על החלק הקדמי של הגוף הטיק. שימו לב לנוזל כמעט שקוף שיוצא מאתר השיבוש. לאסוף את המוליע על ידי יניקה הנוזל דרך קצה המסנן מצמידים לחלק גומי של ערכת עירוי מכונף, ו צינור 0.3 מ"מ נימי. הערה: אין ללחוץ על הגוף של הקרצייה כמעט בזמן השתק, כי זה עלול לשבש את המעיים ולזהם את המוליש. המתן עד שהלחץ העדין יכול לסלק את הנוזל ללא זיהום.</li>
</ol>5. המוליקמ אוסף מתוך הרגל שנתות
<ol><li>לשתק את הקרצייה, לחתוך חתיכת. רגל קדמית עם זוג מספריים הערה: ניתן לגזור את הרגליים אחת או יותר, כמו גם את אותה הרגל ניתן לגזור יותר מפעם אחת.</li>
	<li>הפעילו לחץ עדין על חלק גופו האחורי של הקרצייה. צפו בבועה נוזלית שקופה אשר מופיע באתר לחתוך ולאסוף אותו עם צינור נימי, כפי שמתואר בשלב 4.3. הערה: אין ללחוץ על הגוף של הקרצייה כמעט בזמן השתק, כי זה עלול לשבש את המעיים ולזהם את המוליש. המתן עד שהלחץ העדין יכול לסלק את הנוזל ללא זיהום.</li>
</ol>6. עיבוד המוליש
<ol><li>לאחר אוסף המוליקמ, להפקיד אותו 1.5 mL מיקרוצינוריות בעבר מילא 30 μL הקוקטייל פרוטאז ו 82 מאגר מלוחים μL. לשמור על המיקרוצינוריות על הקרח ברחבי אוסף המוליקמ.</li>
	<li>דגימות צנטריפוגה (500 x g עבור 3 דקות ב -4 ° c). גלולה רכה של הומוציטים ייווצר לאחר המוליקמ צנטריפוגה. הערה: עבור כימות המוליקמ, לכמת את נפח המוליקמ שהושג על ידי ספירת הנפח הכולל בתוך מיקרופופרת ולממש את עוצמת הקול של קוקטייל פרוטאז מאגר מלוחים.</li>
	<li>הסר בזהירות את הסופרנטנט (ללא תא המוליקמ). השהה מחדש בעדינות את התאים ב-, לדוגמה, התרבות L-15 של ליבוביץ הותאמה ל-pH 7.0-7.2. מכמת הומוציטים על ידי הצבת 10 μL של מושעה מחדש בתוך תא של נויבאואר.</li>
</ol>7. הכנת שקופיות דגימת הומוציט
<ol><li>תחתוך את הרגל הקדמית של הקרצייה. עם זוג מספריים</li>
	<li>הפעילו לחץ עדין על חלק גופו האחורי של הקרצייה. שימו לב לבועה נוזלית שקופה שתופיע באתר החתוך.</li>
	<li>להחיל את המוליקמ טיפות ישירות על שקופיות מיקרוסקופ נקי, לאחר מכן, להשתמש בשיטות מופקעים להכתים את התאים.<ol>
<li>כדי להכתים הומוציטים באמצעות Giemsa, אוויר יבש המוליקמ על השקופית עבור 30 דקות, לתקן אותו בטמפרטורת החדר עם מתנול עבור 3 דקות, וכתם בתמיסה Giemsa (1:9 יחס של פתרון המאגר של סורנסן, pH 7.2) עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר. רוחצים את השקופיות עם מים זורמים כדי להסיר את עודף הצבע, האוויר יבש את השקופית ולהעריך את התאים ב-400 x במיקרוסקופ אופטי.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Grisi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reassessment+of+the+potencial+economic+impact+of+cattle+parasites+in+Brazil%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+Brasileira+de+Parasitologia+Veterin%C3%A1ria%22%5BJournal%5D)">Reassessment of the potencial economic impact of cattle parasites in Brazil.</a> Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária. 23 (2), 150-156 (2014).</li>
<li>Schrank, A., Vainstein, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metarhizium+anisopliae+enzymes+and+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicon%22%5BJournal%5D)">Metarhizium anisopliae enzymes and toxins.</a> Toxicon. 56 (7), 1267-1274 (2010).</li>
<li>Camargo, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metarhizium+anisopliae+for+controlling+Rhipicephalus+microplus+ticks+under+field+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Metarhizium anisopliae for controlling Rhipicephalus microplus ticks under field conditions.</a> Veterinary Parasitology. 223, 38-42 (2016).</li>
<li>Perinotto, W. M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+pathogenicity+of+different+Metarhizium+anisopliae+s.l.+isolates+in+oil+formulations+against+Rhipicephalus+microplus%5BTitle%5D)+AND+%22Biocontrol+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">In vitro pathogenicity of different Metarhizium anisopliae s.l. isolates in oil formulations against Rhipicephalus microplus.</a> Biocontrol Science and Technology. 27 (3), 338-347 (2017).</li>
<li>Pedrini, N., Crespo, R., Juarez, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry+of+insect+epicuticle+degradation+by+entomopathogenic+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology.+Part+C%3A+Toxicology+and+Pharmacolpgy%22%5BJournal%5D)">Biochemistry of insect epicuticle degradation by entomopathogenic fungi.</a> Comparative Biochemistry and Physiology. Part C: Toxicology and Pharmacolpgy. 146 (1-2), 124-137 (2007).</li>
<li>Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+on+the+surface%3A+Entomopathogenic+fungi+versus+the+insect+cuticle%5BTitle%5D)+AND+%22Insects%22%5BJournal%5D)">Action on the surface: Entomopathogenic fungi versus the insect cuticle.</a> Insects. 4 (3), 357-374 (2013).</li>
<li>Angelo, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+serpins+involved+in+cellular+immune+response+of+Rhipicephalus+microplus+challenged+with+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Biocontrol+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Detection of serpins involved in cellular immune response of Rhipicephalus microplus challenged with fungi.</a> Biocontrol Science and Technology. 24 (3), 351-360 (2014).</li>
<li>De Paulo, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhipicephalus+microplus+infected+by+Metarhizium%3A+unveiling+hemocyte+quantification%2C+GFP-fungi+virulence%2C+and+ovary+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology+Research%22%5BJournal%5D)">Rhipicephalus microplus infected by Metarhizium: unveiling hemocyte quantification, GFP-fungi virulence, and ovary infection.</a> Parasitology Research. 117, 1847-1856 (2018).</li>
<li>Marmaras, V. J., Lampropoulou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulators+and+signalling+in+insect+haemocyte+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">Regulators and signalling in insect haemocyte immunity.</a> Cell Signal. 21, 186-195 (2009).</li>
<li>Hinzmann, M. F., Lopes-Lima, M., Gonçalves, J., Machado, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiaggregant+and+toxic+properties+of+different+solutions+on+hemocytes+of+three+freshwater+bivalves%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+%26+Environmental+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Antiaggregant and toxic properties of different solutions on hemocytes of three freshwater bivalves.</a> Toxicological & Environmental Chemistry. 95, 790-805 (2013).</li>
<li>Nation, J. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNation%2C+JL+%22Insect+Physiology+and+Biochemistry%22">Insect Physiology and Biochemistry</a>. , University of Florida. Gainesville, FL. (2016).</li>
<li>Gene, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%A9moires+de+l%27Acad%C3%A9mie+royale+des+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Torino%22%5BJournal%5D)">Mémoires de l'Académie royale des sciences.</a> Torino. 9, 751(1848).</li>
<li>Lees, A. D., Beament, J. W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+organ+waxing+in+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22The+Quarterly+Journal+of+the+Mythic+Society%22%5BJournal%5D)">An organ waxing in ticks.</a> The Quarterly Journal of the Mythic Society. 7, 291-332 (1948).</li>
<li>Sonenshine, D. E., Roe, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSonenshine%2C+DE+%22Biology+of+ticks%22">Biology of ticks</a>. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2014).</li>
<li>Tan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+hemocytes+proliferation+in+larval+silkworm+Bombyx+mori%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of hemocytes proliferation in larval silkworm Bombyx mori.</a> Journal of Insect Physiology. 59 (6), 595-603 (2013).</li>
<li>Bowden, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+humoral+immune+systems+of+the+American+lobster+%28Homarus+americanus%29+and+the+European+lobster+%28Homarus+gammarus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+Research%22%5BJournal%5D)">The humoral immune systems of the American lobster (Homarus americanus) and the European lobster (Homarus gammarus).</a> Fish Research. 186, 367-371 (2017).</li>
<li>Sonenshine, D. E., Hynes, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+and+related+aspects+of+the+innate+immune+response+in+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization and related aspects of the innate immune response in ticks.</a> Frontiers in Bioscience. 13, 7046-7063 (2008).</li>
<li>Tsakas, S., Marmaras, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+immunity+and+its+signaling%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Invertebrate+Survival+Journal%22%5BJournal%5D)">Insect immunity and its signaling: an overview.</a> Invertebrate Survival Journal. 7, 228-238 (2010).</li>
<li>Burgdorfer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemolymph+Test.+A+technique+for+detection+of+Rickettsiae+in+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Hemolymph Test. A technique for detection of Rickettsiae in ticks.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 19, 1010-1014 (1970).</li>
<li>Dunham-Ems, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+reveals+a+biphasic+mode+of+dissemination+of+Borrelia+burgdorferi+within+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Live imaging reveals a biphasic mode of dissemination of Borrelia burgdorferi within ticks.</a> Journal of Clinical Investigation. 119, 3652-3665 (2009).</li>
<li>Patton, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saliva%2C+salivary+gland%2C+and+hemolymph+collection+from+Ixodes+scapularis+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Saliva, salivary gland, and hemolymph collection from Ixodes scapularis ticks.</a> Journal of Visualized Experiments. 60, e3894(2012).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

החיסונים של פתוגנים הוא שימושי כאשר המחקר שואפת לחקור את הפעולה vivo של מיקרואורגניזמים במודלים פרוקי-רגליים ניסיוני כי זה מבטיח כי הפתוגן הוא בתוך המארח. ניתן להחיל את הטכניקה גם על מולקולות של החיסונים כגון RNA הפרעה (RNAi). החיסון בין הסטום לקפיאולום נחשב לקל יותר לביצוע, אך לעתים קרובות הוא מהווה נזק לאיבר המין של הג, ופוגע בכדאיות הביציות12,13. העוגב של ג. ג. ממוקם מבחינה אנטומית קרוב לחלקו הקדמי של הקפינום, והוא איבר חשוב לתנוחת ההטלה הקרציה<sup class="xref...

שנתות הבקר, ריפיקאראוס מיקרופלוס, הוא hematophagus ectoparasite עם השפעה שלילית עצומה על בעלי חיים באזורים טרופיים. שנתות זה הוא וקטור של סוכני פתוגניים כגון babesia סטרפטקוקוס, babesia bigemina, ו אנקלמה מרגיא כי, בשילוב עם הנזק העוצר הישיר, יכול להפחית את ייצור החלב והבשר, לגרום לאנמיה ובסופו של דבר מוות. הפסדים שנגרמו על ידי הפקעון זה הוערך ב3,240,000,000 דולר בשנה בברזיל1. שיטות בר-קיימא הינן מבוקשת והשימוש בסוכני entomopathogenic נחשב חלופה מבטיחה להפחתת השימוש בחומרי הדברה כימיים2,3,4.
פטריות Entomopathogenic, כגון Metarhizium spp., הם אויבים טבעיים של פרוקי רגליים כולל קרציות, וכמה מבודד ניתן להשתמש כמו biocontrollers קרים. פתוגנים אלה באופן פעיל להדביק את המארח דרך קוטיקולה וליישב את גופם2,5,6. ככל שהזיהום מתפתח, תגובות סלולריות ומוסריות מתווכת על ידי המערכת החיסונית שנתות. ניתוח של שנתות המוליקמ הוא דיווח ככלי שימושי כדי להעריך את התגובות החיסונית לאחר מאתגרת עם פתוגנים7,8.
התגובה החיסונית של פרוקי רגליים מחולקת תגובות ומוראלית ו הסלולר. התגובה ההואתית כוללת תהליכים hemagglutination ייצור של חלבונים מיקרוביאלית/פפטידים, בעוד התגובה החיסונית הסלולר מבוצעת דרך הומוציטים. תאים אלה נמצאים המוליקמ מכל פרוקי רגליים והם דיווחו לפתח תפקיד הבעה במחקרים הכרוכים בתגובה החיסונית מולדת9, כפי שהוא קשור ישירות הפאגוציטוזה ותהליכים אנקפסולציה. לפיכך, מחקרים על הומוציטים יכולים לעזור לחקור את נתיב המוות ולהבין תהליכים כגון אוטומטי, אפופטוזיס, ו נמק. ביצורים מסוימים כמו bivalves, אוסף הומוציטים הפנים מגבלות כמו הפרעה לתא, נמוך נפח המוליש השיגה, וריכוז נמוך של תאים התאושש10. לעתים קרובות מאוד, בהתאם למתודולוגיה המוחלת, ריכוז מופחת של תאים מתקבל, להשפיע ישירות על התאים הקוונפיקציה וניתוח.
מספר הומוציטים במחזור המוליקמ הוא משתנה בין פרוקי רגליים שונים, זה יכול לשנות באותו מינים בשל שלבים פיסיולוגיים שונים כגון סקס, גיל, ואת השלב ההתפתחותי של פרוקי הרגליים11. הומוציטים ניתן גם למצוא דבק לאיברים מסוימים ולהיות שוחרר לתוך זרימת הדם רק לאחר תהליך הזיהום11. עם זאת, רוב המחקרים דיווחו על השימוש בחרקים, בעוד שקרציות נשארות פחות בחקר הפיזיולוגיה והפתולוגיה שלהם. למרות הפתוגן ואוסף המוליקמ בקרציות הם פחות טכניקות בשימוש, הקמת שיטות סטנדרטיות מסייעת לפיתוח מחקרים מדויקים יותר.
מטרת המחקר הנוכחי היתה להשוות את השיטות הנפוצות ביותר עבור המוליקמ אוסף וחיסונים של פתוגנים לתוך R. microplus קרציות, הערכת היעילות של רכישת המוליקמ רכש וריכוז הומוציטים.

<table><tbody><tr><td>תמיסת היפוכלוריט אלקליין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A1727</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-גלוקוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Synth</td><td>2706</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Gibco</td><td>16000036</td><td></td></tr><tr><td>גומי גמיש</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Giemsa כתם</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>48900-500ML-F</td><td></td></tr><tr><td>נימי זכוכית</td><td>CTechGlass</td><td>CT95-02</td><td></td></tr><tr><td>מזרק אינסולין (מחט)</td><td>BD</td><td>מק"ט:&nbsp; 324910</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Vetec</td><td>60REAVET014512</td><td></td></tr><tr><td>מדיום תרבית L-15 של לייבוביץ&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11415-064</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>34860-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ</td><td>Kasvi</td><td>K5-7105</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-צינורות</td><td>מותג</td><td>Z336769-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Vetec</td><td>60REAVET014593</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-1KG</td><td></td></tr><tr><td>תא נויבאואר&nbsp;</td><td>Kasvi</td><td>K5-0111</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין</td><td>גיבקו</td><td>קוקטייל</td> מעכב פרוטאז 15140163 <td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2714</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Vetec</td><td>60REAVET003662</td><td></td></tr></tbody></table>

בגילוי המוליל אוסף והחיסונים של מטרהיזיפיאוס לתוך ריפיקו מיקרופלוס קרציות לקראת לימודי חסרי חוליות פתולוגיה

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

קרציות הם מחייבים המטפנים ectop, ו המיקרופיקאוס מיקרופלוס יש חשיבות רבה ברפואה וטרינרית כי זה גורם לאנמיה, ירידה במשקל, פחת של עור בעלי חיים גם יכול לשמש וקטור של מספר פתוגנים. בשל העלויות הכרוכות בשליטה בטפילים אלה, נזק לסביבה הנגרמת על ידי שימוש לא הולם בחומר הדברה כימי, והתנגדות מוגברת נגד פרזיטים מסורתיים, שליטה אלטרנטיבית על קרציות, על ידי שימוש ב הפטריות הentomopathogenic, למשל, נחשבה לגישה מעניינת. עם זאת, מחקרים מעטים הוכיחו כיצד המערכת החיסונית של הקרצייה פועל כדי להילחם אלה entomopathogens. לפיכך, פרוטוקול זה מדגים שתי שיטות המשמשות לentomopathogen חיסונים לנקבות מנוגנות ושתי טכניקות המשמשות עבור אוסף המוליש וקצירת הומוציטים. החיסונים של פתוגנים בכניסה לרגל בגוף של שנתות הנשי מאפשר הערכה של הנשים פרמטרים ביולוגיים בניגוד החיסון בין scuulum לבין הקפיאולום, אשר לעתים קרובות לנזק עוגב של ג ' ו. מעבר לאוסף באמצעות הרגליים הניב התאוששות בנפח גבוה יותר. כמה מגבלות של שנתות המוליקמ האוסף ועיבוד כוללים i) שיעור גבוה של הפרעות הומוציטים, ii) המוליקמ זיהום עם שיבושים באמצע המעיים, ו iii) נמוך המוליקמ האחסון התאוששות. כאשר המוליקמ נאסף באמצעות חיתוך הרגל, המוליש לוקח זמן לצבור בפתיחת הרגל, העדפה תהליך קרישת דם. בנוסף, פחות הומוציטים מתקבלים באוסף דרך הרגל בהשוואה לאוסף הקודם, למרות שהשיטה הראשונה נחשבת קלה יותר לביצוע. הבנת התגובה החיסונית של קרציות בתיווך על ידי סוכני entomopathogenic מסייעת לחשוף פתוגנזה שלהם ולפתח מטרות חדשות עבור שליטה קרציות. תהליכי החיסונים המתוארים כאן דורשים משאבים טכנולוגיים נמוכים מאוד וניתן להשתמש בהם לא רק כדי לחשוף קרציות לאורגניזמים פתוגניים. באופן דומה, את האוסף של שנתות המוליקמ הוא עשוי לייצג את הצעד הראשון עבור מחקרים פיזיולוגיים רבים.

מאמר זה מתקרב לחיסון ושיטות גבייה המוליקמ על קרציות. לאחר החיסון בין ירך הרגל לגוף הנשי, ניתן לפרש חלק מהנוזל (המוליקמ) במהלך התהליך; עם זאת, חשוב לציין כי כאשר החיסון מסתיים, לא נמצאו נוזלים או רקמות בקצה המחט או באתר החיסונים, ומבטיחים כי ההשעיה הפטרייתית מחוסנת לחלוטין. כאשר תהליך החיסונים התבצע בצורה נכונה, החדרת המחט לא גרמה למותה של הנקבות הקרציות. מצד שני, קרציות מתו כ 48 h לאחר החיסון של הפטריה הentomopathogenic. החיסון בין הירך לבין הגוף הנשי יכול לגרום נזק לאיברים המתמחים בקרציו...

ניתוח של שנתות המוליקמ מייצג מקור חשוב של מידע על איך כמה פתוגנים לגרום למחלה וכיצד קרציות מגיבים באופן חיסוני לזיהום זה. המחקר הנוכחי מדגים כיצד לחסן מפיץ פטרייתי ולאסוף המוליםקמ מ הנשים המנוסות מיקרופיאוס .

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites and Rhipicephalus microplus has great importance in veterinary medicine because it causes anemia, weight ...

קרציות הן אקטופארסיטים המטופדים, מיקרופלוס רייפיצפלוס, הידוע בכינויו קרציית הבקר יש השפעה כלכלית שלילית עצומה על בעלי חיים באזורים טרופיים. בנוסף, החששות הגוברים לגבי תנאים סביבתיים מושפלים ודאגות לבריאות הציבור הנגרמות על ידי שימוש לא הולם בתרופות כימיות והתנגדות גוברת של אוכלוסיות קרציות לטפילים מסורתיים, מעוררים מחקר על שיטות בקרה חלופיות, כגון שימוש בפטריות entomopathogenic. אלה entomopathogens באופן פעיל להדביק מארחים פרוקי רגליים, דרך קוטיקל שלהם ליישב את גופם.פרוקי הרגליים עשויים להיות תגובות שונות לזיהום פטרייתי. מערכת החיסון של פרוקי הרגליים מחולקת לתגובות הומוריסטיות ותאיות. התגובה ההומוריסטית כרוכה בתהליך ההמגגלוטינציה וייצור מולקולות מיקרוביאליות, בעוד שהמוציטים מתווים את התגובה החיסונית התאית.רוב המחקרים על התגובה החיסונית של פרוקי רגליים מדווחים באמצעות חרקים בעוד התגובות קרציות להישאר פחות נחקר. כמו כן, חיסון פתוגן ואוסף המולימפה קרציות הן טכניקות נפוצות מאוד הדרושות כדי להבין טוב יותר את התגובה החיסונית של פרוקי הרגליים. בהתאם לכך, טכניקות כתובת וידאו זה \משמש לצלם את החיסון, אוסף hemolymph ועיבוד.מאז hemocytes קרציות קצירת פנים כמה מגבלות, כגון שיבוש תאים, קבלת ערך hemolymph נמוך, ריכוז נמוך של תאים התאושש. מדביק ישירות בתצורה וניתוח של תאים. לאחר איסוף קרציות, לשטוף נקבות שקועות.השתמש במי ברז לטבול אותם 0.5% פתרון hypochlorite נתרן במשך שלוש דקות נמען זכוכית 500 מיליליטר. להיגיינת קוטיקל, מחלקים נקבות בקבוצות הומוגניות עם 20 נקבות כל אחת. בוצעו שלושה שכפולים של כל קבוצה.Metarhizium robertsii blastospores שימשו בתהליך החיסון. הוסף נוזל של חמישה microliters metarhizium blastospores השעיה על פני השטח של סרט פרפין פלסטיק. כדי להאיץ את תהליך החיסון, ניתן להוסיף בועות מרובות למשטח סרט הפרפין מפלסטיק, כל בועה המתאימה לחמישה מיקרוליטרים.השתמש מזרק אינסולין דק במיוחד מילימטר אחד מחט 0.3 מילימטרים לשים השעיה לחסן אותו לתוך הקרצייה. זכור להוציא את כל האוויר מהמזרק לפני השימוש בו. לחסן 5 microliters של השעיית פטרייה לתוך נקבת קרצייה בין scutum ו capitulum.נפח קטן של המולימפה עשוי להיות נוכח על המסגור לאחר חתך המחט. היזהר לא לחסן אוויר. לחסן נקבות עם השעיית פטרייה בין ירך הרגל לבין הגוף של הנקבה באמצעות מזרק אינסולין אחד מיליליטר דק במיוחד יחד עם מחט 0.3 מילימטר.כאשר חיסון metarhizium blastospores מבוצע בין ירך הרגל לבין הגוף של נקבת הקרצייה, נפח קטן של המולימפה יכול להיות נוכח על הירך לאחר החדרת המחט. היזהר לא לחסן אוויר. השתמש בחלק הגומי של עירוי מכונף להגדיר צינור נימי 0.3 miliimeters וק Tip מסנן כדי לבצע את אוסף המולימפה.לשבש את קוטיקל הגב הנשי באמצעות מחט 0.3 מילימטרים. לאחר ההפרעה להפעיל לחץ עדין על החלק לפני הלידה של גוף הקרצייה. שימו לב לנוזל כמעט שקוף המתאגרף מאתר ההפרעה.לאסוף את המולימפה על ידי מציצת הנוזל דרך קצה המסנן יחד לחלק גומי של ערכת עירוי מכונף צינור נימי 0.3 מילימטרים. אל תלחץ על הגוף של הקרצייה בקושי במהלך חוסר התנועה שלה כי זה עלול לשבש את midgut ולזהם את ההמולימפות. המתן עד שלחץ עדין יוכל לגרש את הנוזל ללא זיהום.תשתק את הקרצייה. חותכים חתיכה של רגל קדמית. רגל אחת או יותר ניתן לחתוך, כמו גם את אותה רגל ניתן לחתוך יותר מפעם אחת.יש להפעיל לחץ עדין על חלק הגוף האחורי של הקרצייה. שימו לב לבועה נוזלית שקופה מופיעה בצד החתך ואספו אותה עם צינור נימי. אל תלחץ על הגוף של הקרצייה בקושי, במהלך הגיוס שלה כי זה עלול לשבש את midgut ולזהם את ההמולימפות.המתן עד שלחץ עדין יוכל לגרש את הנוזל ללא זיהום. לאחר איסוף המולימפה, להפקיד אותו 1.5 mililiters microtube מלא בעבר עם 30 קוקטייל פרוטאז microlitres ו 82 microlitres מלוחים חיץ. שמור את המיקרו-צינורות על הקרח לאורך כל אוסף ההמולימפות.דגימות צנטריפוגה ואת גלולה רכה של hemocytes ייווצר לאחר צנטריפוגה המולימפה. לכימות המולימפה, לכמת את נפח המולימפה שהושג על ידי ספירת הנפח הכולל בתוך microtube והנמכת נפח קוקטייל פרוטאז חיץ מלוחים. הסר בזהירות את ההמולימפום נטול התאים העל-טבעי, והשהה בעדינות את התאים.לכמת את hemocytes על ידי הצבת 10 microlitres של hemocytes מושעה מחדש בתא Neubauer. עבור תאים השעיה מחדש נעשה שימוש במדיה תרבותית. חותכים את הרגל הקדמית של הקרצייה, מפעילים לחץ עדין על חלק הגוף האחורי של הקרצייה, מתבוננים בבועה נוזלית שקופה מופיעה באתר החתך.החל את טיפות ההמולימפות ישירות על שקופיות מיקרוסקופ נקי. לאחר מכן להשתמש בשיטות המתאימות כדי להכתים את התאים. חיסון בין ירך הרגל לגוף הנשי הקרצייה יכול גם לגרום נזק לאיברים פנימיים של קרציות כגון מידגוט ופקעות מאלפיג'יות.כאשר מידגוט קרצייה מופרע על ידי המחט באוסף hemolymph הגב הנוזל המתקבל הוא אדום, לא שקוף. הדבר מצביע על אוסף המולימפה שגוי. במקרה זה, המולימפה תיזרק כפי שהוא מזוהם.זיהום hemolymph ניתן לראות גם כאשר הקרצייה נגועה באופן טבעי עם המון גבוה של פתוגנים, או בשלבים הסופיים לאחר תהליך המוות שנגרם על ידי פתוגנים מחוסנים. נפח ההמולימפות המתקבל לאחר איסוף הגב גבוה יותר מהנפח המתקבל באוסף דרך הרגל. למרות ההיכרות של זיהום הוא גבוה יותר בשיטת האיסוף הראשונה.גם ריכוז ההמוציטים היה גבוה משמעותית באוסף הגב. כאשר אוסף hemocytes הנכון מבוצע מריחה טובה ניתן להשיג וניתן להבחין hemocytes שונים לאחר הכתם. וידאו זה סיפק מידע על שיטות לבצע חיסון של פתוגן, במיוחד פטריות entomopathogenic, לתוך קרציות ולאסוף המולימפה שלהם.הטכניקות המוצגות כאן דורשות משאבים טכנולוגיים נמוכים מאוד בצעדים הקלאסיים שלנו למחקרים על פיזיולוגיה של קרציות, פתולוגיה של קרציות ותגובה חיסונית של טיק. הקציר הנכון של תאי פרוקי הרגליים, והמולימפה נטולת תאים חיוניים כדי להרשות לעצמם מידע אמין למחקרים הבאים. מסיבה זו, חשוב גם להיות מודעים לטעויות הנפוצות ביותר שנצפו בביצוע טכניקות אלה.בנוסף, ההצעות של מחקר זה יקבעו את האתר המתאים יותר לאיסוף המולימפה באמצעות עיוות או חיתוך הרגליים, בהתחשב בהבדל בנפח המתקבל ובהסתברות לזיהום.

disclosing-hemolymph-collection-inoculation-metarhizium-blastospores

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

ליים מחלות מחקר מחקרים לעיתים קרובות דורשים דור של קרציות נגוע הפתוגן Borrelia burgdorferi, תהליך זה לוקח בדרך כלל מספר שבועות. כאן אנו מדגימים microinjection מבוססי זיהום סמן הליך זה יכול להתבצע תוך שעות ספורות. אנחנו גם להדגים שיטה immunofluorescence עבור בלוקליזציה באתרו של B. burgdorferi בתוך קרציות.

שיטות העברה מהירים לוקליזציה של פתוגנים מחלת ליים בתוך גוט טיק

אוסף של hemolymph לתקתק נגוע, בלוטות הרוק, ורוק חשוב ללמוד איך לתקתק נישאים פתוגנים לגרום למחלה. בפרוטוקול זה אנו מדגימים כיצד לאסוף את בלוטות הרוק hemolymph ו מ...

רוק, בלוטות הרוק, וכן אוסף Hemolymph מ קרציות קרצית Scapularis

מחלת ליים היא המחלה וקטור הנישא ביותר המדווח בדרך כלל בצפון אמריקה. הסוכן סיבתי, Borrelia burgdorferi הוא חיידק החיידק מועבר על ידי קרציות Ixodid. הילוכים וזיהוי של זיהום במודלים של בעלי חיים מותאם על ידי השימוש בהאכלה לתקתק, שאנו מתארים כאן.

האכלה של קרציות בבעלי חיים להילוכים וXenodiagnosis במחקר מחלת ליים

שיטה זו מדגימה כיצד להמחיש הפתוגן הפלישה לתוך תאים חרקים עם דגמים תלת ממדיים (3D). Hemocytes של הזחלים דרוזופילה נדבקו בנגיף פתוגנים נגיפי או חיידקי, או vivo לשעבר או ויוו. Hemocytes נגוע היו לאחר מכן קבועה, צבעונית עבור הדמיה עם מיקרוסקופ קונפוקלי, עוקבות שיחזור תאי תלת-ממד.

החילוץ של Hemocytes של הזחלים דרוזופילה melanogaster זיהום מיקרוביאלי וניתוח

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להעריך במרחב של חנותם הנוכחות של קיימא microbiota במעיים שנתות תוך שימוש בגישה שונה כולה-הר היברידיזציה.

ויזואליזציה של Microbiota במעיים שנתות על-ידי הכלאה כולה-הר בחיי עיר

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הבידוד של מיקרו-רנ"א מבלוטות הרוק של קרציות ושלפוחיות חוץ-תאיות מטוהרות. זהו הליך אוניברסלי המשלב ריאגנטים ואספקה נפוצים. השיטה גם מאפשרת שימוש במספר קטן של קרציות, וכתוצאה מכך מיקרו-רנ"א איכותיים שניתן לרצף בקלות.

בידוד של מיקרו-רנ"א מתרביות בלוטת הרוק של Tick Ex Vivo ושלפוחיות חוץ-תאיות

אלקטרופורציה היא שיטה מהירה שאומצה באופן נרחב להחדרת דנ"א אקסוגני לסוג ריקטסיה. פרוטוקול זה מספק שיטת אלקטרופורציה שימושית לטרנספורמציה של חיידקים תוך תאיים מהסוג Rickettsia.

שיטת אלקטרופורציה להפיכת ריקטסיה spp. עם וקטור מעבורת המבטא חלבון פלואורסצנטי בקווי תאי קרציות

אנו מתארים שיטה לאיסוף המולימפה הניתנת לכימות ביעילות מפרוקי רגליים קטנים לצורך ניתוח לאחר מכן.

שיטה מדויקת וניתנת לכימות לאיסוף המולימפה מפרוקי רגליים קטנים

מאמר זה מציג את המתודולוגיה לחשיפת בני אדם לזחל Ixodes scapularis לצורך מחקר קליני. הטכניקה פשוטה יחסית, נסבלת על ידי מתנדבי המחקר, וניתנת לשינוי בהתאם לצרכי הניסוי. מחקר כזה בבני אדם חייב להתבצע תחת פרוטוקולי מחקר קליני שאושרו על ידי הרשויות הרגולטוריות המתאימות.

מודל לחשיפה ניסיונית של בני אדם לקרציות זחל Ixodes scapularis

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאיסוף רוק, המולימפה, בלוטות הרוק והמעי האמצעי, לאחר דיסקציה של קרצייה בודדת שניזונה, כדי לחקור לוקליזציה ספציפית לרקמה של פתוגנים הנישאים על ידי קרציות כדי לקדם את ההבנה של יכולת הווקטור ואינטראקציות פתוגן-מיקרוביום.

מיצוי רוק, המולימפה, בלוטות רוק ומעי תיכון מקרציות בודדות (Acari: Ixodidae)

שיטה זו מתארת את פיתוח מערכת הזנת דם מקרציות במבחנה , המשלבת תא מודפס בתלת-ממד וממברנת סיליקון מעבדתית. המערכת מאפשרת האכלה מלאכותית של קרציות, ומאפשרת דגימה קלה בשלבים שונים של האכלה ושימוש בכמויות דם נמוכות, ומספקת כלי יקר ערך לחקר קרציות איקסודיד.

דם קרציות המזין דרך ממברנה מלאכותית בתא מודפס בתלת-ממד במחקר קרציות איקסודיד

חקור איסוף המוליף וחיסון פטריות בקרציות Rhipicephalus microplus. שיטה זו מאפשרת לחוקרים ללמוד על מנגנוני התגובה החיסונית של פרוקי רגליים לפתוגנים.

בגילוי המוליל אוסף והחיסונים של מטרהיזיפיאוס לתוך ריפיקו מיקרופלוס קרציות לקראת לימודי חסרי חוליות פתולוגיה

גלה סרטונים נוספים