מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית החיה כדי לחקור את הלוקליזציה של חלבון Subcellular ושינויי מורפולוגיה של תאים בחיידקים

פרוטוקול זה מאפשר התבוננות ישירה בשינויים פנוטיפיים שונים ברמה של תא יחיד ומאפשר ניטור מתמשך של לוקליזציה של חלבונים ותזמון ביטוי גנים. היתרון העיקרי של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית הוא שזו שיטה פשוטה לניטור תהליכים ביולוגיים שונים, כגון חלוקת תאים ושינויים במורפולוגיה של תאים בתאים חיים. הקפד להקדיש תשומת לב מיוחדת לפרוטוקול ההכנה לדוגמה ולחקור את תוכנת המיקרוסקופ כדי שתוכל לאתר את ההגדרות והאפשרויות המפורטות בפרוטוקול זה.

ייצוג חזותי של פרוטוקול זה הוא קריטי מכיוון שהוא מאפשר למשתמשים לצפות וללמוד את השלבים המשמעותיים של הטכניקה בזמן שהם מגדירים ניסויים משלהם. התחל על ידי תיוג aliquot 5-50 מיקרוליטר של תרבות התא של עניין עם צבע ויטראז קרום מתאים והוספת חמישה microliters של תאי חיידקים ויטראז’ים על להחליק כיסוי על החלק התחתון של צלחת תרבות תחתונה זכוכית 35 מיליליטר. מניחים לוח אגרוז בקוטר 11 מ”מ מעל המדגם ומקש בעדינות כדי לוודא שהלוח שטוח כנגד החלקת המכסה.

לאחר מכן מוסיפים כחמישה מיקרוליטרים של מים סביב החלקת הכיסוי כדי למנוע את ייבוש כרית אגרוז ולאפשר צלחת התרבות כדי לצייד את הטמפרטורה בתוך תא הדגירה של מיקרוסקופ deconvolution ברזולוציה גבוהה במשך 15 עד 20 דקות. כדי לדמיין את הדגימה, השתמשו בכופת המיקוד של ההתאמה גסה כדי לוודא שהמטרה יורדת במלואה לפני אתחול המיקרוסקופ בתוכנת המיקרוסקופ. מניחים ירידה של 1.517 שמן מדד שבירה לתוך המטרה טבילת שמן 100x, ולהעביר את המנה התחתונה זכוכית המכילה את המדגם לתוך ארון המתכת דיור.

מחליקים בעדינות את המנה לתוך מהדק הבמה, ולהשתמש ידית התאמה גסה כדי להעלות את המטרה עד השמן יוצר קשר עם תחתית הזכוכית של המנה. השתמשו בעין ובמושת ההתאמה העדינה כדי להתמקד בדגימה, ולעבור למצב מצלמה. בתוכנת הדימות בחלון ‘פתור תלת-ממדי’, בחר בסמל ‘ניסוי עיצוב/הפעלה’.

תיבת דו-שיח חדשה תופיע בשם ניסוי עיצוב/הפעלה. פתח את הכרטיסיות עיצוב ומקטעים בתיבת הדו-שיח כדי להגדיר את מספר ערימות Z ואת עובי הדגימה. כדי למדוד את עובי התאים בדגימה, התאם בהדרגה את מישור ה- Z באמצעות החצים למעלה ולמטה בתיבת הדו-שיח פתרון תלת-מימד, והפוך את המקום שבו התאים יוצאים מחוץ לפוקוס כמגבלות העליונות והתחתונות עבור רכישת תמונה.

לאחר התאמת תיבת הדו-שיח ‘אחוזי שידור’ בעוצמת האור ומשך החשיפה לערוצים הבודדים שנבחרו בתיבת הדו-שיח ‘פתור תלת-שיח תלת-מימד’, לחצו על ‘רשימת נקודות’ לפתיחת רשימת הנקודות. בכרטיסיות עיצוב ושגות זמן, בחר בתיבת הסימון זמן לשגות והזן את הפרמטרים לשגות זמן. בחרו באפשרות הרשימה ‘נקודת ביקור’ והזינו את הנקודות להדמיה בתיבת המלל, המפרידות בין הנקודות באמצעות פסיקים או מקפים לרצפים שלמים.

לאחר מכן ערכו שמות קבצים ומיקומי קבצים בכרטיסיה ‘הפעלה’ ובחרו ‘הפעל’ בתיבת הדו-שיח ‘התחל ניסוי’ כדי להתחיל בניסוי. בסוף הניתוח, פתח את קבצי התמונה RAW המעניינים בתוכנית פירוק מתאימה ובחר בכרטיסיה תהליך וב- Deconvolve. בצעו כל חיסור ידני של רעשי רקע והתאמת ניגודיות בהירות בכל אחד מהערוצים באורך הגל או באורך הגל לפי הצורך לפני שמירת התמונה כקובץ TIFF.

לכימות אורך תא, פתח את קבצי התמונה המפותלים בתוכנה שסופקה על-ידי היצרן או בתוכנת דימות חופשית, כגון ImageJ, ופתח את הכרטיסיה כלי. לאחר מכן בחרו ‘מדידת מרחקים’ ולחצו שמאלה על נקודות ההתחלה והסיום בקובץ התמונה הרצוי למדידת אורך התא. לכמות אותות פלואורסצנטיים, בחר מפקח נתונים.

צייר תיבה כאשר האפשרות עמודה/שורה מוגדרת לממד העניין הספציפי ובחר את האזור עם האות לכמת. התוספת של קסילוז כדי לגרום GGS 8 זן תוצאות פנוטיפ שישה תאים. בעוד שפקדים וקטוריים ריקים נראים דומים לתאי בקרה הגדלים בהיעדר מעורר.

ייצור יתר של staph aureus GPSB משבש את חלוקת התאים ב- B.subtilis כפי שנמדד על ידי מיקרוסקופיה לשגות זמן וכמות אורך התא. בנוסף, דפוסי לוקליזציה של FtsZ או אחד החלבונים הקשורים חלבון זה ניתן להשתמש כתב ללמוד ו / או לזהות תרכובות מיקרוביאלית הרומן דרך זמן לשגות הדמיה וכימות אורך התא. הקפד להשתמש בשמן עם אינדקס השחזור המתאים גם כאשר מדד השחזור עשוי להשתנות בהתאם לטמפרטורה המשמשת להדמיה.

Deconvolution יכול להתבצע אם המשתמש רוצה להסיר רעש מחוץ לפוקוס, וניתוח נתונים מעורבים כימות אותות פלואורסצנטי ומדידות אורך ורוחב התא יכול להתבצע גם.