מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית החיה כדי לחקור את הלוקליזציה של חלבון Subcellular ושינויי מורפולוגיה של תאים בחיידקים
November 23rd, 2019
מאמר זה מספק מדריך צעד אחר צעד כדי לחקור את הדינמיקה לוקליזציה של חלבון subcellular ולנטר שינויים מורפולוגיים באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה ב subtilis מקרתגו ו סטיילוולוקוקוס.
פרוטוקול זה מאפשר התבוננות ישירה בשינויים פנוטיפיים שונים ברמה של תא יחיד ומאפשר ניטור מתמשך של לוקליזציה של חלבונים ותזמון ביטוי גנים. היתרון העיקרי של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית הוא שזו שיטה פשוטה לניטור תהליכים ביולוגיים שונים, כגון חלוקת תאים ושינויים במורפולוגיה של תאים בתאים חיים. הקפד להקדיש תשומת לב מיוחדת לפרוטוקול ההכנה לדוגמה ולחקור את תוכנת המיקרוסקופ כדי שתוכל לאתר את ההגדרות והאפשרויות המפורטות בפרוטוקול זה.
ייצוג חזותי של פרוטוקול זה הוא קריטי מכיוון שהוא מאפשר למשתמשים לצפות וללמוד את השלבים המשמעותיים של הטכניקה בזמן שהם מגדירים ניסויים משלהם. התחל על ידי תיוג aliquot 5-50 מיקרוליטר של תרבות התא של עניין עם צבע ויטראז קרום מתאים והוספת חמישה microliters של תאי חיידקים ויטראז'ים על להחליק כיסוי על החלק התחתון של צלחת תרבות תחתונה זכוכית 35 מיליליטר. מניחים לוח אגרוז בקוטר 11 מ"מ מעל המדגם ומקש בעדינות כדי לוודא שהלוח שטוח כנגד החלקת המכסה.
לאחר מכן מוסיפים כחמישה מיקרוליטרים של מים סביב החלקת הכיסוי כדי למנוע את ייבוש כרית אגרוז ולאפשר צלחת התרבות כדי לצייד את הטמפרטורה בתוך תא הדגירה של מיקרוסקופ deconvolution ברזולוציה גבוהה במשך 15 עד 20 דקות. כדי לדמיין את הדגימה, השתמשו בכופת המיקוד של ההתאמה גסה כדי לוודא שהמטרה יורדת במלואה לפני אתחול המיקרוסקופ בתוכנת המיקרוסקופ. מניחים ירידה של 1.517 שמן מדד שבירה לתוך המטרה טבילת שמן 100x, ולהעביר את המנה התחתונה זכוכית המכילה את המדגם לתוך ארון המתכת דיור.
מחליקים בעדינות את המנה לתוך מהדק הבמה, ולהשתמש ידית התאמה גסה כדי להעלות את המטרה עד השמן יוצר קשר עם תחתית הזכוכית של המנה. השתמשו בעין ובמושת ההתאמה העדינה כדי להתמקד בדגימה, ולעבור למצב מצלמה. בתוכנת הדימות בחלון 'פתור תלת-ממדי', בחר בסמל 'ניסוי עיצוב/הפעלה'.
תיבת דו-שיח חדשה תופיע בשם ניסוי עיצוב/הפעלה. פתח את הכרטיסיות עיצוב ומקטעים בתיבת הדו-שיח כדי להגדיר את מספר ערימות Z ואת עובי הדגימה. כדי למדוד את עובי התאים בדגימה, התאם בהדרגה את מישור ה- Z באמצעות החצים למעלה ולמטה בתיבת הדו-שיח פתרון תלת-מימד, והפוך את המקום שבו התאים יוצאים מחוץ לפוקוס כמגבלות העליונות והתחתונות עבור רכישת תמונה.
לאחר התאמת תיבת הדו-שיח 'אחוזי שידור' בעוצמת האור ומשך החשיפה לערוצים הבודדים שנבחרו בתיבת הדו-שיח 'פתור תלת-שיח תלת-מימד', לחצו על 'רשימת נקודות' לפתיחת רשימת הנקודות. בכרטיסיות עיצוב ושגות זמן, בחר בתיבת הסימון זמן לשגות והזן את הפרמטרים לשגות זמן. בחרו באפשרות הרשימה 'נקודת ביקור' והזינו את הנקודות להדמיה בתיבת המלל, המפרידות בין הנקודות באמצעות פסיקים או מקפים לרצפים שלמים.
לאחר מכן ערכו שמות קבצים ומיקומי קבצים בכרטיסיה 'הפעלה' ובחרו 'הפעל' בתיבת הדו-שיח 'התחל ניסוי' כדי להתחיל בניסוי. בסוף הניתוח, פתח את קבצי התמונה RAW המעניינים בתוכנית פירוק מתאימה ובחר בכרטיסיה תהליך וב- Deconvolve. בצעו כל חיסור ידני של רעשי רקע והתאמת ניגודיות בהירות בכל אחד מהערוצים באורך הגל או באורך הגל לפי הצורך לפני שמירת התמונה כקובץ TIFF.
לכימות אורך תא, פתח את קבצי התמונה המפותלים בתוכנה שסופקה על-ידי היצרן או בתוכנת דימות חופשית, כגון ImageJ, ופתח את הכרטיסיה כלי. לאחר מכן בחרו 'מדידת מרחקים' ולחצו שמאלה על נקודות ההתחלה והסיום בקובץ התמונה הרצוי למדידת אורך התא. לכמות אותות פלואורסצנטיים, בחר מפקח נתונים.
צייר תיבה כאשר האפשרות עמודה/שורה מוגדרת לממד העניין הספציפי ובחר את האזור עם האות לכמת. התוספת של קסילוז כדי לגרום GGS 8 זן תוצאות פנוטיפ שישה תאים. בעוד שפקדים וקטוריים ריקים נראים דומים לתאי בקרה הגדלים בהיעדר מעורר.
ייצור יתר של staph aureus GPSB משבש את חלוקת התאים ב- B.subtilis כפי שנמדד על ידי מיקרוסקופיה לשגות זמן וכמות אורך התא. בנוסף, דפוסי לוקליזציה של FtsZ או אחד החלבונים הקשורים חלבון זה ניתן להשתמש כתב ללמוד ו / או לזהות תרכובות מיקרוביאלית הרומן דרך זמן לשגות הדמיה וכימות אורך התא. הקפד להשתמש בשמן עם אינדקס השחזור המתאים גם כאשר מדד השחזור עשוי להשתנות בהתאם לטמפרטורה המשמשת להדמיה.
Deconvolution יכול להתבצע אם המשתמש רוצה להסיר רעש מחוץ לפוקוס, וניתוח נתונים מעורבים כימות אותות פלואורסצנטי ומדידות אורך ורוחב התא יכול להתבצע גם.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
מאמר זה מספק מדריך שלב אחר שלב לחקירת דינמיקת לוקליזציה תת-תאית של חלבונים ולניטור שינויים מורפולוגיים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורוסצנטית ברזולוציה גבוהה ב-Bacillus subtilis ו-Staphylococcus aureus.
מרכיבי המחקר העיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה תאית
- מיקרוביולוגיה
רקע
- מיקרוסקופיה פלואורוסצנטית מאפשרת תצפית בתאים חיים.
- היא שימושית לניטור תהליכים ביולוגיים כמו חלוקת תאים.
- הבנת לוקליזציה של חלבונים היא קריטית לחקר תפקודים תאיים.
- ניתוח של תא יחיד מספק תובנות לגבי שינויים פנוטיפיים.
מטרת המחקר
- לאפשר תצפית ישירה של לוקליזציה של חלבונים.
- לנטר שינויים מורפולוגיים בתאים חיידקיים.
- לספק פרוטוקול לחוקרים המשתמשים במיקרוסקופיה פלואורוסצנטית.
שיטות ששימשו
- סימון תרבויות תאים עם צבעי צביעת קרום.
- שימוש במיקרוסקופיה פלואורוסצנטית ברזולוציה גבוהה.
- הכנת דגימות על זכוכית מכסה לצורך תצפית.
- שימוש בלוחות אגרוז כדי לייצב את הדגימות במהלך ההדמיה.
תוצאות עיקריות
- ויזואליזציה מוצלחת של לוקליזציה של חלבונים בתאים חיים.
- תצפית בשינויים מורפולוגיים ברמת תא יחיד.
- הוכחת האפקטיביות של הפרוטוקול.
- מתן ייצוג חזותי לסיוע בהגדרת הניסוי.
מסקנות
- הפרוטוקול משפר את ההבנה של דינמיקת החלבונים.
- מיקרוסקופיה פלואורוסצנטית היא כלי חשוב להדמיה של תאים חיים.
- תשומת לב לפרטים בהכנת הדגימות קריטית להצלחה.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Live-cell fluorescence microscopy enables direct observation of subcellular protein dynamics and morphological changes in bacteria at single-cell resolution, providing critical insights for target validation in antimicrobial discovery. By capturing real-time phenotypic responses, this approach supports mechanistic de-risking and predictive confidence in early-stage screening campaigns. The protocol’s applicability to Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus establishes a disease-relevant system for evaluating compound effects on cell division and morphology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing protein localization patterns linked to cell division machinery.
- Operational Value: Facilitates functional target validation through direct correlation of protein dynamics with phenotypic outcomes.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that disrupt morphogenetic pathways in live bacterial systems.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated bacterial cells on stabilized substrates for consistent, high-resolution imaging.
- Quantitative Outputs: Enables measurement of cell length and fluorescent signal intensity as dependable readouts for compound screening.
- Scalability: Supports time-lapse acquisition across multiple fields of view for reproducible kinetic analysis.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models key virulence and survival mechanisms in Gram-positive pathogens relevant to antimicrobial development.
- Mechanistic De-risking: Links target engagement to observable changes in cell morphology and division timing.
- Translational Continuity: Provides a bridge from molecular target validation to phenotypic confirmation in a live-cell context.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis-driven imaging after target engagement but before lead optimization, supporting go/no-go decisions based on phenotypic confirmation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing subcellular localization of division proteins like FtsZ in response to genetic or chemical perturbation.
- Screening: Delivers assay-ready systems with standardized sample preparation and stabilization via agarose pads for consistent imaging.
- Analytics: Generates quantitative dependent variables including cell length, width, and fluorescence intensity for objective comparison across conditions.
- Translational Research: Connects molecular observations to phenotypic outcomes in disease-relevant bacterial models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging capability applicable across multiple targets and strains in antimicrobial programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by directly visualizing protein dynamics and morphological consequences in live cells.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized sample preparation, temperature equilibration, and controlled imaging parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing phenotypic confirmation of target modulation, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on validated effects on cell division and morphology.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy, sample preparation, and deconvolution analysis for accurate data interpretation.
- Depends on high-resolution deconvolution microscope with oil immersion objectives and environmental control for live-cell imaging.
- Necessitates cross-team standardization of staining protocols, imaging settings, and quantification methods for reproducible results.
- Involves adaptation considerations for different bacterial strains, growth conditions, and protein tags to maintain signal fidelity.
- Includes practical limitations such as phototoxicity risks during long-term imaging and refractive index matching for optimal oil immersion performance.
