Name: מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית החיה כדי לחקור את הלוקליזציה של חלבון Subcellular ושינויי מורפולוגיה של תאים בחיידקים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: למד מיקרוסקופיית פלואורסצנציה ברזולוציה גבוהה לחקור לוקליזציה של חלבונים ושינויים מורפולוגיים בתאי Bacillus subtilis ו-Staphylococcus aureus. פרוטוקול זה מאפשר מעקב ישיר אחר תהליכים ביולוגיים ברמת תא בודד.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לחברי המעבדה שלנו על הערותיהם במאמר זה. עבודה זו ממומנת על ידי מענק סטארט-up מאוניברסיטת דרום פלורידה (PE).

1. תנאי גדילה כלליים
<ol><li>האיחסן 2 מ ל של בינוני הצמיחה המתאים יושלם עם אנטיביוטיקה (במידת הצורך) עם מושבה אחת של הזנים (s) להיות בתמונה. לילה ב -22 ° c באינקובטור רועד. הערה: תנאי הגדילה החיידקיים הספציפיים המשמשים במאמר זה מסופקים תחת סעיף התוצאות המייצג.</li>
	<li>לדלל תרבויות לילה 1:20 במדיה טרייה בבקבוקון 125 mL, תוספת עם אנטיביוטיקה (כאשר נדרש).</li>
	<li>הגדל תרבות (ים) ב-37 ° c באינקובטור רועד עד לשלב האמצע לוגריתמי (OD600 = 0.5). הערה: ניתן להוסיף השראה או מעכבי ישירות לתרבות הגוברת בשלב הגדילה המתאים.</li>
	<li>מסיק תאים בתנאי התרבות הרצויים להכנה לדוגמא מיקרוסקופית כמתואר בסעיף הבא.</li>
</ol>2. הכנה לדוגמא
<ol><li>הכינו 1% agarose על-ידי שילוב 0.25 g של כיתה בביולוגיה מולקולרית, EEO נמוכה, agarose עם 25 מ ל של גידול בינוני בתוספת אנטיביוטיקה המתאימה (במידת הצורך) עבור מיקרוסקופ או מים סטרילי. לחמם את התערובת בעזרת מיקרוגל עבור כ 30 s ויוצקים אותו לתוך סטרילי 100 mm x 15 מ"מ צלחת פטרי ולתת לו לגבש.</li>
	<li>קח 5 – 50 μL הנורית של תרבות התא בהתאם לצורך ולהכתים את התאים. כתם תאים עם צבעים מתאימים בשלב זה (למשל, להוסיף צבען פלורסנט FM4-64 (כתם ממברנה) לניסוי (איור 1)).<ol>
<li>פיפטה 5 μL של מדגם התרבות או דגם מוכתם כדי להיות מיוצג על החלק התחתון של 35 מ"מ זכוכית מתחת לקערת התרבות (עם קוטר 14 מ"מ למיקרוגל ולא מצופה No. 1.5 שמיכות; לראות את הטבלה של חומרים). התראה: אין להשתמש בכיסויים של פולי-L-ליזין מצופים במיוחד עבור מיקרוסקופ מחדש כאשר הם יכולים לגרום לדפוס גדילה שונה (ראינו זאת עם פולי-D-ליזין כמו גם; נתונים לא מוצגים) ו/או להשפיע על הדינמיקה חלבון6.</li>
		<li>כדי למזער את השימוש בצבעים, כתם 3 – 4 μL תא השעיה (שנקטפו ב-OD600 = 0.5; כ 2.7 x 107 ו 3.4 x 107 עבור B. subtilis ו -S. האורלנו בהתאמה לתרבות 1 מ ל) ישירות על המנה התחתונה זכוכית.</li>
		<li>המקום לוח מראש לחתוך הפרה (11 מ"מ בקוטר או של כל גודל רצוי לחפוף את האזור של coverslip; לגזור באמצעות הקצה הפתוח של צינור סטרילי או סכין גילוח) על גבי המדגם בעדינות להקיש כדי לוודא את הלוח הצמח הוא שוכב שטוח נגד coverslip.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בעקבות הדמיה (ראה בסעיף הבא), אם מספר התאים בשדה התצוגה לא רצוי, להתאים את צפיפות התא של המדגם באמצעות דילול או ריכוז על ידי צנטריפוגה ולשנות את היחס של תאים במדגם באמצעות הצמיחה בינונית/מאגר לפי הצורך. הערה: כדי למזער את הקרינה האוטומטית הנובעת ממדיום התרבות, ניתן לשטוף את התאים במאגר (לדוגמה בתמיסת מלח באגירה סטנדרטית של 1 x פוספט) ולהשעות מחדש את כמות המאגר המתאימה לפני ההדמיה. ייתכן כי בשלב זה תאים קטנים או שלפוחיות לא יכול להישמר לאחר צנטריפוגה ולכן יאבדו.</li>
	<li>להוסיף מים באמצעות פיפטה (~ 5 μL) לחלל בתוך התבשיל תרבות (סביב שמיכות) כדי למנוע את משטח agarose מייבוש, וכלה לסייע לשמור על לחות במהלך רכישת תמונה, במיוחד עבור ניסויים בזמן אמת.</li>
	<li>אפשר מנות תרבות כדי להתמצא בטמפרטורה בתוך חדר הדגירה, תא אטום מובנה המסופק על ידי היצרן, של המיקרוסקופ עבור 15 – 20 דקות. הערה: הפעל את אלמנט החימום והגדר את חדר הדגירה לטמפרטורה הרצויה מספר שעות לפני ההדמיה. הדבר יבטיח כי החומרה מייצבת לטמפרטורה החדשה. להדמיה ממושכת, מניחים גביע או בקבוקון עם מים בתוך תא המיקרוסקופ, הרחק מאזור העבודה, כדי לשמור על הלחות.</li>
</ol>3. הדמיה
<ol><li>, ביום הניסוי. הפעל את מערכת המיקרוסקופ הפעל את תוכנת הדימות (ראה טבלת חומרים) על-ידי לחיצה על הסמל המתאים בשולחן העבודה. אתחל את המיקרוסקופ על-ידי לחיצה על האפשרות ' אתחל מיקרוסקופ ' (כפתור המתואר במיקרוסקופ) על תיבת ההפעלה של התוכנה. ודא כי המטרה היא הורדה מלאה באמצעות התאמת מיקרוסקופ גס לפני אתחול. הערה: לאחר אתחול שלוש תיבות דו-שיח נוספות אמורות להופיע בנוסף לתפריט ההתחלה: resolve3D, איסוף נתונים וצג המסננים.</li>
	<li>מניחים טיפה של 1.517 (מדד השבירה) שמן על המטרה טבילה 100x שמן שסופקו על ידי היצרן (הצמצם נומרי = 1.4, מרחק עבודה = 0.12 מ"מ; ראה טבלת חומרים). הערה: חשוב לבחור את שמן הטבילה המתאים לטמפרטורה שבה מתנהל ההדמיה.</li>
	<li>לטעון את המנה התחתונה הזכוכית המכילה דגימה לתוך המגורים מתכת (ארון הקבורה) ולהחליק בעדינות לתוך מהדק הבמה.</li>
	<li>השתמש בכפתור הכוונון הגס כדי להעלות את המטרה עד שהשמן יוצר מגע עם תחתית הזכוכית של המנה. השתמש בחתיכת העין כפתור התאמה עדין כדי להביא את המדגם לפוקוס. לאחר התאים נמצאים בפוקוס להפוך את הכפתור מתוך פיסת העין למצב המצלמה על ידי הזזת מתג בורר ממוקם בחזית הגוף המיקרוסקופ משמאל.</li>
	<li>התחל בניסוי באמצעות תוכנת הדימות. בחלון resolve3D , בחר בסמל הניסיון/הפעל את התמונה המתוארת בבקבוקון. תיבת דו-שיח חדשה אמורה להופיע כניסוי עיצוב/הפעלה.<ol>
<li>הגדר את מספר המחסניות Z ואת עובי הדגימה באמצעות העיצוב ולאחר מכן החלק את הכרטיסיה בתיבת הדו של ניסוי העיצוב/הפעל . הערה: עבור הניסויים בסעיף התוצאות המייצג, 17 Z-ערימות בשעה 200 ננומטר מרווח לתמונות סטילס וארבע הערימות ב 200 מרווח nm עבור מיקרוסקופ הזמן שימשו.</li>
		<li>כדי למדוד את עובי התאים במדגם, התאם ידנית את מישור Z בהפרש קבוע באמצעות החצים למעלה ולמטה בתיבת הדו resolve3D . סמן היכן שהתאים מיוצאים לפוקוס כמגבלה העליונה והנמוכה ביותר עבור רכישת תמונה. יבא מידע זה לפני הפעלת הניסוי.</li>
		<li>כדי לסייע במזעור הרעילות והפחתת התמונות במהלך הדמיה, הפחת את מספר ה-Z-ערימות ובחר את המישור האמצע של התאים עבור רכישת תמונה.</li>
	</ol></li>
	<li>בחר בערכת הסינון המתאימה לניסוי באמצעות העיצוב ולאחר מכן הכרטיסיה ערוצים בתיבת הדו התנסות בעיצוב/הפעלה (tritc: EX 542/27; EM 597/45; לשעבר FITC/GFP: EX 475/28; EM 525/48; mCherry: EX 575/25; EM 632/60; Cy5: EX 632/22; EM 676/34).<ol>
<li>כמו כן, בחר הפניה לאוסף של מידע POL/DIC. כוונן את שידור האחוזים (עוצמת אור) ואת משך החשיפה עבור ערוצים בודדים שנבחרו לפני הדמיה על-ידי בחירת האפשרויות המתאימות בתיבת הדו resolve3D . הערה: בשדה בדיקה של תצוגה שאינו נחשב למבחן הניסוי הגדרות אלה כדי לזהות אם הפרמטרים שנבחרו משיגים נתוני קרינה בעלי משמעות מבלי להחסיר אות חלש או לחזק אותו. לאחר מכן יבא פרמטרים אלה עבור הערכה הניסיונית.</li>
	</ol></li>
	<li>פתח את רשימת הנקודות על-ידי בחירה בלחצן רשימת הנקודות בתיבת הדו resolve3D . תיבת דו-שיח חדשה אמורה להופיע ברשימת נקודותזכאי. סמן מספר שדות תצוגה שישמשו בניסוי על-ידי איתור שדות התצוגה המתאימים באמצעות הפקדים של שלב המיקרוסקופ ובחירה באפשרות נקודת סימון בתיבת הדו רשימת נקודות. הערה: יש לבחור נקודת החלפה בכל פעם שהמיקרוסקופ ממוקד מחדש בנקודה ברשימת הנקודות. ניתן לעשות זאת על-ידי התמקדות במיקרוסקופ בנקודה המתאימה ברשימה ולאחר מכן בחירה בלחצן נקודת החלפה . חשוב לא לגעת בכפתור הכוונון האנלוגי/דק כאשר מתמקדים מחדש; השתמש רק בתוכנה כדי לכוונן את המוקד.</li>
	<li>קבע את הפרמטרים להפעלה על-ידי בחירת העיצוב ולאחר מכן הכרטיסיה מחלוף בתיבת הדו של ניסוי העיצוב/הפעלה. בחר את תיבת הסימון מחלוף. הזן את הפרמטרים המתאימים המתאים במונחים של תמונות שיעברו/הזמן הכולל.</li>
	<li>הגדר נקודות לדימות מרשימת הנקודות על-ידי בחירה תחילה בכרטיסיה עיצוב ולאחר מכן נקודות בתיבת הדו של ניסוי העיצוב/הפעלה. בחרו באפשרות הרשימה של נקודות הביקור והזינו נקודות לדימות בתיבת המלל בפסיקים או במקפים אם זהו רצף שלם.</li>
	<li>לפני תחילת הניסוי, ערוך שמות קבצים ומיקומי קבצים באמצעות הכרטיסיה הפעלה בתיבת הדו עיצוב/הפעלה. ניתן לשנות את מיקום הקובץ על-ידי בחירת לחצן ההגדרות , בחירת תיקיית הנתונים ולאחר מכן בחירת התיקיה המתאימה או יצירת מסמך חדש. שנה את שמות הקבצים על-ידי הזנת שם הקובץ החדש בתיבת הטקסט של שם קובץ התמונה.</li>
	<li>התחל את הניסוי על-ידי בחירה בלחצן הפעל בתיבת הדו ניסוי התחלה . הערה: למשך הזמן, בדוק באופן תמידי את המיקוד בכל שדה של תצוגה במהלך הניסוי באמצעות הגדרת DIC (כדי למנוע הלבנת מיותרים) ולמקד מחדש ולעדכן את המידע ברשימת נקודות כאשר התאים נוטים לצאת ממוקד במשך התקופה.</li>
</ol>4. עיבוד תמונה
<ol><li>פתח את קבצי התמונה raw (R3D) הרצויים עבור יצירת איורים. הערה: ניתן לאתר קבצים שנשמרו לאחרונה באמצעות לחצן תיקיית הנתונים בתיבת ההפעלה של תוכנת ההדמיה.</li>
	<li>הפעל את התוכנית לפירוק, כדי להסיר החוצה של מיקוד אור זריחה7,8, על מנת לייצר קובץ תמונה D3D לפירוק. בחר את הכרטיסיה ' תהליך ' בתיבת הדו ' הפעלה ' ולאחר מכן בחר באפשרות ' פירוק'. תופיע תיבת דו-שיח חדשה שכותרתה " פירוק".<ol>
<li>הגדר את הפרמטרים לפירוק על-ידי גרירת מספר התמונה המתאים (ממוקם בפינה השמאלית העליונה של כל קובץ תמונה) לקלט בתיבת הדו ' פירוק נתונים '. בתיבת הדו פירוק הגדרות, בחר את לחצן אפשרויות נוספות ובטל את תיבת הסימון לאחר העיבוד של שולי גבולות החיתוך (אחרת התמונות לא יכולות להיות מונחים מעל הקובץ DIC המתאים).</li>
		<li>לחצו על הלחצן ' עשה זאת ' בתיבת הדו ' פירוק ' לקובץ תמונה גולמית. הערה: ניתן לכוונן את הפרמטרים הניתנים לפירוק כפי שמצוין במדריך ההדרכה של יצרן התוכנה עבור התוצאות הרצויות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>במקרה הצורך, בצעו הפחתת רעש ברקע ידני והתאמת בהירות/ניגודיות בכל אורך הגל (צבע). עשה זאת על-ידי בחירה בלחצן התאמת הניגודיות בקובץ התמונה החוצה.</li>
	<li>שמור את התמונה כקובץ TIFF על-ידי בחירה תחילה באפשרות הקובץ בראש תיבת הדו D3D . לאחר מכן בחרו ' שמור כ-TIFF ', לזהות ולבחור את המחסניות Z המתאימות (הנמצאות במוקד), לבחור או לבטל בחירה של ערכות סינון רצויות.</li>
	<li>בצע כימות נתונים באמצעות כל תוכנה שסופקה על-ידי היצרן או תוכניות זמינות חופשיות כגון ImageJ5.<ol>
<li>עבור גודל התא לחץ על כרטיסיית הכלי בקובץ התמונה D3D המתאים, ולאחר מכן בחר את האפשרות מרחקים מדידה . מדידת מרחקים על-ידי בחירת נקודות התחלה וסיום בקובץ התמונה הרצוי באמצעות העכבר דרך לחיצות שמאל. הערה: מומלץ להגדיל את התמונה במהלך כימות התאים בגודל תא.</li>
		<li>עבור כימות הקרינה הפלואורסצנטית להשתמש באפשרות מפקח הנתונים תחת הכרטיסייה כלי בקובץ התמונה D3D המתאים. הערה: מומלץ להגדיל את התמונה ולקבל רק מסננים רלוונטיים שנבחרו בעת השלמת כימות הקרינה הפלואורסצנטית.</li>
		<li>כדי לכמת את אות הזריחה, צייר תיבה עם אפשרות עמודה/שורה המוגדר לממד מסוים. בחר אזור עם האות שיש לכמת והקלט את הערך. מדדו את אות הרקע באמצעות התיבה בגודל זהה כדי לבחור אזור מחוץ לתאים. הפחת את ערך הרקע מהערך שנרשם מהאות הפלואורסצנטית שהתקבל בתוך התא.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Coltharp, C., Xiao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+microscopy+for+microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Superresolution microscopy for microbiology.</a> Cellular Microbiology. 14 (12), 1808-1818 (2012).</li>
<li>Holden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+mechanistic+principles+of+bacterial+cell+division+with+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Probing the mechanistic principles of bacterial cell division with super-resolution microscopy.</a> Current Opinion in Microbiology. 43, 84-91 (2018).</li>
<li>Hsu, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full+color+palette+of+fluorescent+d-amino+acids+for+in+situ+labeling+of+bacterial+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Full color palette of fluorescent d-amino acids for in situ labeling of bacterial cell walls.</a> Chemical Science. 8 (9), 6313-6321 (2017).</li>
<li>Nonejuie, P., Burkart, M., Pogliano, K., Pogliano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+cytological+profiling+rapidly+identifies+the+cellular+pathways+targeted+by+antibacterial+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+USA%22%5BJournal%5D)">Bacterial cytological profiling rapidly identifies the cellular pathways targeted by antibacterial molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (40), 16169-16174 (2013).</li>
<li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ2%3A+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Central+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BioMed Central Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).</li>
<li>Colville, K., Tompkins, N., Rutenberg, A. D., Jericho, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+poly%28L-lysine%29+substrates+on+attached+Escherichia+coli+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Effects of poly(L-lysine) substrates on attached Escherichia coli bacteria.</a> Langmuir. 26 (4), 2639-2644 (2010).</li>
<li>McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+by+deconvolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy.</a> Methods. 19 (3), 373-385 (1999).</li>
<li>Wallace, W., Schaefer, L. H., Swedlow, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+workingperson%27s+guide+to+deconvolution+in+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A workingperson's guide to deconvolution in light microscopy.</a> Biotechniques. 31 (5), 1076-1082 (2001).</li>
<li>Eswara, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+Staphylococcus+aureus+cell+division+protein+directly+regulates+FtsZ+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">An essential Staphylococcus aureus cell division protein directly regulates FtsZ dynamics.</a> Elife. 7, (2018).</li>
<li>Haeusser, D. P., Margolin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splitsville%3A+structural+and+functional+insights+into+the+dynamic+bacterial+Z+ring%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Splitsville: structural and functional insights into the dynamic bacterial Z ring.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 305-319 (2016).</li>
<li>Du, S., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((At+the+Heart+of+Bacterial+Cytokinesis%3A+The+Z+Ring%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">At the Heart of Bacterial Cytokinesis: The Z Ring.</a> Trends in microbiology. , (2019).</li>
<li>Haranahalli, K., Tong, S., Ojima, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+discovery+and+development+of+antibacterial+agents+targeting+the+cell-division+protein+FtsZ%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+and+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the discovery and development of antibacterial agents targeting the cell-division protein FtsZ.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 24 (24), 6354-6369 (2016).</li>
<li>Brzozowski, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+Role+of+a+SLOG+Superfamily+Protein+YpsA+in+Gram-Positive+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Deciphering the Role of a SLOG Superfamily Protein YpsA in Gram-Positive Bacteria.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 623(2019).</li>
<li>Elsen, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+action+of+the+cell-division+inhibitor+PC190723%3A+modulation+of+FtsZ+assembly+cooperativity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Mechanism of action of the cell-division inhibitor PC190723: modulation of FtsZ assembly cooperativity.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (30), 12342-12345 (2012).</li>
<li>Haydon, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inhibitor+of+FtsZ+with+potent+and+selective+anti-staphylococcal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An inhibitor of FtsZ with potent and selective anti-staphylococcal activity.</a> Science. 321 (5896), 1673-1675 (2008).</li>
<li>Pilhofer, M., Ladinsky, M. S., McDowall, A. W., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+TEM%3A+new+insights+from+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Bacterial TEM: new insights from cryo-microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 96, 21-45 (2010).</li>
<li>Ni, Q., Mehta, S., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+of+cell+signaling+using+genetically+encoded+fluorescent+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Federation+of+European+Biochemical+Societies+Journal%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging of cell signaling using genetically encoded fluorescent reporters.</a> Federation of European Biochemical Societies Journal. 285 (2), 203-219 (2018).</li>
<li>Weiss, C. A., Hoberg, J. A., Liu, K., Tu, B. P., Winkler, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Microscopy+Reveals+That+Levels+of+Cyclic+di-GMP+Vary+among+Bacillus+subtilis+Subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Microscopy Reveals That Levels of Cyclic di-GMP Vary among Bacillus subtilis Subpopulations.</a> Journal of Bacteriology. 201 (16), (2019).</li>
<li>Schneider, J. P., Basler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shedding+light+on+biology+of+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Shedding light on biology of bacterial cells.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 371 (1707), (2016).</li>
<li>Yao, Z., Carballido-Lopez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+for+bacterial+cell+biology%3A+from+localization+to+dynamics%2C+from+ensembles+to+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+microbiology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging for bacterial cell biology: from localization to dynamics, from ensembles to single molecules.</a> Annual review of microbiology. 68, 459-476 (2014).</li>
<li>Ettinger, A., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence live cell imaging.</a> Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).</li>
<li>Fredborg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+image+analysis+for+quantification+of+filamentous+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Central+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Automated image analysis for quantification of filamentous bacteria.</a> BioMed Central Microbiology. 15, 255(2015).</li>
<li>Ursell, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((precise+quantification+of+bacterial+cellular+dimensions+across+a+genomic-scale+knockout+library%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Central+Biology%22%5BJournal%5D)">precise quantification of bacterial cellular dimensions across a genomic-scale knockout library.</a> BioMed Central Biology. 15 (1), 17(2017).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

המיקרוסקופיה הייתה בעלת התווך במחקרים הנוגעים לאורגניזמים מיקרוביאלית. בהתחשב בגודל התאים שלהם בקנה מידה מיקרון, מחקרים ברמת תא יחיד הסתמאו באופן מסורתי על מיקרוסקופ אלקטרונים (EM). למרות EM הפך להיות טכניקה רבת עוצמה בשנים האחרונות, יש לו מגבלות פנימיות משלו בנוסף למשתמש מוגבל גישה16. שיפורים בטכניקות מיקרוסקופ ניאון ופיתוח של בדיקה פלואורסצנטית שונים, כגון FDAA3, סיפקו ביולוגים תאים מיקרוביאלית עם מגוון רחב של כלים כדי ללמוד תהליכים סלולריים שונים בתאים חיים. חוקרים גם בו...

התחום של ביולוגיה של התא בקטריאלי הופרה באופן משמעותי על ידי הפיתוחים האחרונים של טכניקות מיקרוסקופ1,2. בין השאר, מיקרוסקופים המסוגלים לבצע ניסויים במיקרוסקופיה פלואורסצנטית נותרים הם כלי רב ערך. החוקרים יכולים לפקח על אירועים פיזיולוגיים שונים בזמן אמת באמצעות חלבונים פלורסנט כגון, חלבון פלורסנט ירוק (GFP) מבוסס הכתב fusions העיתונאי, פלורסנט D-אמינו חומצות (FDAA)3, או להשתמש כתמים אחרים עבור תיוג קיר התא, קרום DNA. לכן אין שום הפתעה כי מיקרוסקופ הזריחה נשאר פופולרי בקרב ביולוגים תאים מיקרוביאלית. בנוסף פשוט מציג את הפנוטיפים הסוף, מתן מידע לגבי איך פנוטיפים נצפו להתעורר באמצעות מיקרוסקופ tim, יכול להוסיף ערך משמעותי לממצאים ולהציע רמזים לגבי מה התהליכים הסלולריים מיועדים על ידי מועמדים לסמים פוטנציאליים4.
הפרוטוקולים לביצוע הדמיה ברזולוציה גבוהה באמצעות מיקרוסקופ במלואו, הפוך, הפוכה השדה הרחב (לראות את הטבלה של חומרים) מסופקים במאמר זה. פרוטוקולים אלה יכולים להיות מותאמים כדי להתאים את הצרכים של מיקרוסקופים פלואורסצנטית אחרים אשר מסוגלים לנהל מיקרוסקופ שחלוף. למרות שהתוכנה שנדונה כאן מתאימה לתוכנה הספציפית שסופקה על-ידי היצרן כפי שמצוין בטבלת החומרים, תוכנה המסופקת בדרך כלל על-ידי יצרני מיקרוסקופ אחרים או imagej5הזמינים באופן חופשי, יש כלים שווי-ערך לניתוח נתוני מיקרוסקופ. לתנאים שבהם המשך הזמן אינו תורם, ניתן לערוך ניסויים במהלך הקורס כמתואר במאמר זה. הפרוטוקולים המתוארים כאן מספקים מדריך מפורט כדי ללמוד את השינויים הפנוטיניים בשני זנים חיידקיים שונים: B. subtilis ו -S.. שנינו ראה שולחן 1 עבור זנים המשמשים.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP160-100</td><td>ביולוגיה מולקולרית כיתה - EEO נמוך</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td>מיקרוסקופיה</td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>Invitrogen</td><td>T3166</td><td>מיקרוסקופיה</td></tr><tr><td>צלחת תחתונה מזכוכית</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>מיקרוסקופיה</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>פישר ביו-ריאגנטים</td><td>BP1755-10</td><td>ללא</td></tr> <tr>דיאוקסאן<td>מיקרוסקופ</td><td>GE</td><td>DeltaVision Elite</td><td>מותאם אישית אולימפוס IX-71 מעמד מיקרוסקופ הפוך; מגדל תאורה מותאם אישית ומודול תאורת אור משודר. מטרות: PLAPON 60X (N.A. 1.42, WD 0.15 מ"מ); שמן OLY 100X (NA 1.4, WD 0.12 מ"מ); DIC פריזמה נומרסקי עבור יעד פי 100; מצלמת CoolSnap HQ2; מכלול SSI 7 צבעים; תא בקרה סביבתי - אטום.</td></tr><tr><td>PC190723</td><td>מעכב MilliporeSigma</td><td>3445805MG</td><td>FtsZ</td></tr><tr><td>תוכנת</td><td></td><td></td><td>הדמיה המסופקת על ידי היצרן</td></tr></tbody></table>

מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית החיה כדי לחקור את הלוקליזציה של חלבון subcellular ושינויי מורפולוגיה של תאים בחיידקים

Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria

חקירות של גורמים המשפיעים על חלוקת תאים וצורת תא בחיידקים מבוצעים בדרך כלל בשילוב עם מיקרוסקופ פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה כמו תצפיות שנעשו ברמת האוכלוסייה לא באמת לשקף את מה שמתרחש ברמת תא בודד. המיקרוסקופיה מאפשרת לחוקרים לפקח על השינויים במחלקת התאים או במבנה התא המספקים תובנות יקרות לגבי לוקליזציה תת-תאית של חלבונים ותזמון של ביטוי גנטי, כפי שקורה, כדי לסייע במענה לשאלות ביולוגיות חשובות. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול שלנו כדי לפקח על שינויים פנוטיאריים בתוך מקרתגו subtilis ו סטיילוקוקוס האורלנו באמצעות מיקרוסקופ לפירוק ברזולוציה גבוהה. מטרת דו ח זה היא לספק פרוטוקול פשוט וברור שניתן לאמץ על ידי חוקרים אחרים המעוניינים לבצע ניסויים מיקרוסקופ פלואורסצנטית ללמוד תהליכים ביולוגיים שונים בחיידקים, כמו גם אורגניזמים אחרים.

הפנוטיפים של GpsB בעבר הצגנו כי Sa-GpsB הוא חלבון חיוני כמו דלדול של GpsB באמצעות ה-RNA אנטי תחושה התוצאות לפירוק התא9. כאן אנו מתארים כיצד הופעתה של הפנוטיפים לחלוקת תאים שונים ושינויים בלוקליזציה של חלבונים ניתן ללכוד באמצעות פרוטוקול מיקרוסקופ השעון המתואר במאמר זה. למטרה זו, S. האוראוס זנים RB143 [SH1000 מחסה pEPSA5 (וקטור ריק) ו GGS8 [SH1000 מחסה PGG59 (Pxyl-gpsbantisensebla החתול)] דיווח בעבר<sup ...

מאמר זה מספק מדריך צעד אחר צעד כדי לחקור את הדינמיקה לוקליזציה של חלבון subcellular ולנטר שינויים מורפולוגיים באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה ב subtilis מקרתגו ו סטיילוולוקוקוס.

מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית החיה כדי לחקור את הלוקליזציה של חלבון Subcellular ושינויי מורפולוגיה של תאים בחיידקים

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence ...

פרוטוקול זה מאפשר התבוננות ישירה בשינויים פנוטיפיים שונים ברמה של תא יחיד ומאפשר ניטור מתמשך של לוקליזציה של חלבונים ותזמון ביטוי גנים. היתרון העיקרי של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית הוא שזו שיטה פשוטה לניטור תהליכים ביולוגיים שונים, כגון חלוקת תאים ושינויים במורפולוגיה של תאים בתאים חיים. הקפד להקדיש תשומת לב מיוחדת לפרוטוקול ההכנה לדוגמה ולחקור את תוכנת המיקרוסקופ כדי שתוכל לאתר את ההגדרות והאפשרויות המפורטות בפרוטוקול זה.ייצוג חזותי של פרוטוקול זה הוא קריטי מכיוון שהוא מאפשר למשתמשים לצפות וללמוד את השלבים המשמעותיים של הטכניקה בזמן שהם מגדירים ניסויים משלהם. התחל על ידי תיוג aliquot 5-50 מיקרוליטר של תרבות התא של עניין עם צבע ויטראז קרום מתאים והוספת חמישה microliters של תאי חיידקים ויטראז'ים על להחליק כיסוי על החלק התחתון של צלחת תרבות תחתונה זכוכית 35 מיליליטר. מניחים לוח אגרוז בקוטר 11 מ"מ מעל המדגם ומקש בעדינות כדי לוודא שהלוח שטוח כנגד החלקת המכסה.לאחר מכן מוסיפים כחמישה מיקרוליטרים של מים סביב החלקת הכיסוי כדי למנוע את ייבוש כרית אגרוז ולאפשר צלחת התרבות כדי לצייד את הטמפרטורה בתוך תא הדגירה של מיקרוסקופ deconvolution ברזולוציה גבוהה במשך 15 עד 20 דקות. כדי לדמיין את הדגימה, השתמשו בכופת המיקוד של ההתאמה גסה כדי לוודא שהמטרה יורדת במלואה לפני אתחול המיקרוסקופ בתוכנת המיקרוסקופ. מניחים ירידה של 1.517 שמן מדד שבירה לתוך המטרה טבילת שמן 100x, ולהעביר את המנה התחתונה זכוכית המכילה את המדגם לתוך ארון המתכת דיור.מחליקים בעדינות את המנה לתוך מהדק הבמה, ולהשתמש ידית התאמה גסה כדי להעלות את המטרה עד השמן יוצר קשר עם תחתית הזכוכית של המנה. השתמשו בעין ובמושת ההתאמה העדינה כדי להתמקד בדגימה, ולעבור למצב מצלמה. בתוכנת הדימות בחלון 'פתור תלת-ממדי', בחר בסמל 'ניסוי עיצוב/הפעלה'.תיבת דו-שיח חדשה תופיע בשם ניסוי עיצוב/הפעלה. פתח את הכרטיסיות עיצוב ומקטעים בתיבת הדו-שיח כדי להגדיר את מספר ערימות Z ואת עובי הדגימה. כדי למדוד את עובי התאים בדגימה, התאם בהדרגה את מישור ה- Z באמצעות החצים למעלה ולמטה בתיבת הדו-שיח פתרון תלת-מימד, והפוך את המקום שבו התאים יוצאים מחוץ לפוקוס כמגבלות העליונות והתחתונות עבור רכישת תמונה.לאחר התאמת תיבת הדו-שיח 'אחוזי שידור' בעוצמת האור ומשך החשיפה לערוצים הבודדים שנבחרו בתיבת הדו-שיח 'פתור תלת-שיח תלת-מימד', לחצו על 'רשימת נקודות' לפתיחת רשימת הנקודות. בכרטיסיות עיצוב ושגות זמן, בחר בתיבת הסימון זמן לשגות והזן את הפרמטרים לשגות זמן. בחרו באפשרות הרשימה 'נקודת ביקור' והזינו את הנקודות להדמיה בתיבת המלל, המפרידות בין הנקודות באמצעות פסיקים או מקפים לרצפים שלמים.לאחר מכן ערכו שמות קבצים ומיקומי קבצים בכרטיסיה 'הפעלה' ובחרו 'הפעל' בתיבת הדו-שיח 'התחל ניסוי' כדי להתחיל בניסוי. בסוף הניתוח, פתח את קבצי התמונה RAW המעניינים בתוכנית פירוק מתאימה ובחר בכרטיסיה תהליך וב- Deconvolve. בצעו כל חיסור ידני של רעשי רקע והתאמת ניגודיות בהירות בכל אחד מהערוצים באורך הגל או באורך הגל לפי הצורך לפני שמירת התמונה כקובץ TIFF.לכימות אורך תא, פתח את קבצי התמונה המפותלים בתוכנה שסופקה על-ידי היצרן או בתוכנת דימות חופשית, כגון ImageJ, ופתח את הכרטיסיה כלי. לאחר מכן בחרו 'מדידת מרחקים' ולחצו שמאלה על נקודות ההתחלה והסיום בקובץ התמונה הרצוי למדידת אורך התא. לכמות אותות פלואורסצנטיים, בחר מפקח נתונים.צייר תיבה כאשר האפשרות עמודה/שורה מוגדרת לממד העניין הספציפי ובחר את האזור עם האות לכמת. התוספת של קסילוז כדי לגרום GGS 8 זן תוצאות פנוטיפ שישה תאים. בעוד שפקדים וקטוריים ריקים נראים דומים לתאי בקרה הגדלים בהיעדר מעורר.ייצור יתר של staph aureus GPSB משבש את חלוקת התאים ב- B.subtilis כפי שנמדד על ידי מיקרוסקופיה לשגות זמן וכמות אורך התא. בנוסף, דפוסי לוקליזציה של FtsZ או אחד החלבונים הקשורים חלבון זה ניתן להשתמש כתב ללמוד ו / או לזהות תרכובות מיקרוביאלית הרומן דרך זמן לשגות הדמיה וכימות אורך התא. הקפד להשתמש בשמן עם אינדקס השחזור המתאים גם כאשר מדד השחזור עשוי להשתנות בהתאם לטמפרטורה המשמשת להדמיה.Deconvolution יכול להתבצע אם המשתמש רוצה להסיר רעש מחוץ לפוקוס, וניתוח נתונים מעורבים כימות אותות פלואורסצנטי ומדידות אורך ורוחב התא יכול להתבצע גם.

live-cell-fluorescence-microscopy-to-investigate-subcellular-protein

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

כאן אנו מדגימים את הפרוטוקולים לביצוע מולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לחיות תאים חיידקיים לאפשר קומפלקסים מולקולריים תפקודית כדי להתגלות, מעקב לכמת.

הדמיה מולקולרית מכלולים יחיד In vivo באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתקדם

פרוטוקול זה מספק הליך צעד אחר צעד כדי לפקח על התנהגות תא בודד של חיידקים שונים בתוך זמן באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטיות זמן לשגות. יתר על כן, אנו מספקים הנחיות כיצד לנתח את תמונות מיקרוסקופ.

תא הדמיה חיה של Bacillus subtilis ו Streptococcus pneumoniae באמצעות מיקרוסקופית אוטומטי זמן לשגות

כמותי תא חי פלואורסצנטי, מיקרוסקופ ניתוח של שמרים ביקוע

Biofilms חיידקים הם בדרך כלל מהווים ידי subpopulations שונים של תאים מיוחדים. מתא בודד ניתוח subpopulations אלה מחייב שימוש כתבים ניאון. כאן אנו מתארים את פרוטוקול לחזות ולפקח subpopulationswithin...

מתא בודד ניתוח בצילוס subtilis Biofilms באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ו cytometry זרימה

מקור: ברזוזובסקי, ר. ס. ואחרים. מיקרוסקופיית פלואורסצנציה של תאים חיים לחקר מיקום חלבונים תת-תאיים ושינויים במורפולוגיה של תאים בחיידקים. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים מיקרוסקופיה פלואורסצנציונית של תאים חיים כדי להמחיש שינויים מורפולוגיים בזמן אמת בחיידקים. הוא מפרט את השלבים הכרוכים בהדמיה, רכישת טיימ-לאפס ודקונבולוציה לקבלת תמונות ברזולוציה גבוהה בזמן אמת.

שינויים מורפולוגיים בהדמיית חיידקים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה של תאים חיים

הסרטון מתאר את טכניקת ההדמיה FLIM-FRET כדי לקבוע את האינטראקציה חלבון-חלבון בחיידקים חיים המבטאים חלבונים ציטופלזמיים המסומנים בחלבונים פלואורסצנטיים, eGFP תורם ומקבל mCherry. הטכניקה המשולבת מאפשרת גם לכמת את החלבונים המקיימים אינטראקציה.

הדמיית FLIM-FRET לאפיון אינטראקציות חלבון-חלבון בחיידקים חיים

מתוארת שיטה מבוססת חלבון פלואורסצנטי של תאים חיים להארת ואקואולים תאיים (תכלילים) המכילים כלמידיה. אסטרטגיה זו מאפשרת קביעה מהירה ואוטומטית של זיהום כלמידיה בדגימות וניתן להשתמש בה כדי לחקור כמותית את דינמיקת הצמיחה של הכללה.

שימוש בחלבוני ניאון כדי לחזות ולכמת<em&gt; כלמידיה</em&gt; חלולית דינמיקת צמיחה בתאים חיים

מחקרים של ביומולקולות in vivo חיוניים להבנת תפקוד מולקולרי בהקשר ביולוגי. כאן אנו מתארים שיטה חדשה המאפשרת הפנמה של ביומולקולות פלואורסצנטיות, כגון DNA או חלבונים, למיקרואורגניזמים חיים. ניתוח נתונים in vivo שנרשמו על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מוצג ונדון גם כן.

הפנמה והתבוננות של פלורסנט מולקולות ביולוגיים במיקרואורגניזמים שחיים דרך Electroporation

הבנת תפקידה של תהליכים חיוניים של חיידקים הוא מאתגר. קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ עם צבעי במטרה יכול לספק תובנות מפתח לתוך התא מיקרוביאלי התקדמות וצמיחה של מחזור התא. כאן, Agrobacterium tumefaciens משמש חיידק דגם כדי לסמן שיטות הדמיה תא חי פלואורסנציה לאפיון תהליכים חיוניים.

חיים התא מיקרוסקופ פלורסצנטיות לבחון תהליכים חיוניים במהלך צמיחת תאים מיקרוביאלי

תאים חיידקיים במרחב מאוד מאורגנים. כדי לבצע את הארגון הזה לאורך זמן בתאים Myxococcus xanthus גדל לאט, פותחה מלכודת קרינה פלואורסצנטית הדמיה לחיות תאים עם רזולוציה גבוהה ייתכן במשך מספר דורות. באמצעות שיטה זו, ייתכן הדינמיקה של חלבונים חשובים על כרומוזום סגרגציה ועל חלוקת התא יכול להיקבע.

קרינה פלואורסצנטית Live-תא הדמיה של שלמה וגטטיבי תא מחזור של חיידק חברתית גידול איטי Myxococcus xanthus

פרוטוקול הדמיה זה של תאים חיידקיים חיים מאפשר הדמיה של אינטראקציות בין מינים חיידקיים מרובים ברמת תא יחיד לאורך זמן. הדמיה של זמן-לשגות מאפשרת להתבוננות של כל מין חיידקי במונוקולטורה או coculture לחקור אינטראקציות בין מינים בקהילות חיידקים מרובי מינים, כולל תנוענות תאים בודדים וכדאיות.

הדמיה קינטית של אינטראקציות חיידקים בין-מינים חד-תאיים

למד מיקרוסקופיית פלואורסצנציה ברזולוציה גבוהה לחקור לוקליזציה של חלבונים ושינויים מורפולוגיים בתאי Bacillus subtilis ו-Staphylococcus aureus. פרוטוקול זה מאפשר מעקב ישיר אחר תהליכים ביולוגיים ברמת תא בודד.

מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית החיה כדי לחקור את הלוקליזציה של חלבון Subcellular ושינויי מורפולוגיה של תאים בחיידקים

גלה סרטונים נוספים