Name: זיהוי של טביעות רגליים של RNA: מכלולי חלבון באמצעות RNA Immunoprecipitation בטנדם ואחריו רצף (RIPiT-Seq) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: למד את שיטת RIPiT-Seq לזיהוי אזורי RNA הקשורים לחלבוני RNA בקומפלקסים ייחודיים. שיטה זו מאפשרת חקירת אינטראקציות RNA:חלבון בתאי יונק ללא תלות ב-UV-crosslinking.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי מענק NIH GM120209 (GS). המחברים מודים לליבה של משאבים משותפים גנומיקה של אוסוקCC עבור שירותיהם (מענק תמיכת CCC NCI P30 CA16058).

<ol><li>Karousis, E. D., Nasif, S., Mühlemann, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonsense-mediated+mRNA+decay%3A+novel+mechanistic+insights+and+biological+impact%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+RNA%22%5BJournal%5D)">Nonsense-mediated mRNA decay: novel mechanistic insights and biological impact.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 7 (5), 661-682 (2016).</li>
<li>Ivanov, P. V., Gehring, N. H., Kunz, J. B., Hentze, M. W., Kulozik, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+UPF1%2C+eRFs%2C+PABP+and+the+exon+junction+complex+suggest+an+integrated+model+for+mammalian+NMD+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Interactions between UPF1, eRFs, PABP and the exon junction complex suggest an integrated model for mammalian NMD pathways.</a> The EMBO Journal. 27 (5), 736-747 (2008).</li>
<li>Papasaikas, P., Valcárcel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Spliceosome%3A+The+Ultimate+RNA+Chaperone+and+Sculptor%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The Spliceosome: The Ultimate RNA Chaperone and Sculptor.</a> Trends in Biochemical Sciences. 41 (1), 33-45 (2016).</li>
<li>Jensen, K. B., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLIP%3A+Crosslinking+and+ImmunoPrecipitation+of+In+Vivo+RNA+Targets+of+RNA-Binding+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">CLIP: Crosslinking and ImmunoPrecipitation of In Vivo RNA Targets of RNA-Binding Proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 488, Clifton, N.J. 85-98 (2008).</li>
<li>Garzia, A., Morozov, P., Sajek, M., Meyer, C., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAR-CLIP+for+Discovering+Target+Sites+of+RNA-Binding+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22mRNA+Decay%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">PAR-CLIP for Discovering Target Sites of RNA-Binding Proteins.</a> mRNA Decay: Methods and Protocols. 1720, 55-75 (2018).</li>
<li>Konig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iCLIP+-+Transcriptome-wide+Mapping+of+Protein-RNA+Interactions+with+Individual+Nucleotide+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2638(2011).</li>
<li>Sibley, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+Nucleotide+Resolution+UV+Cross-Linking+and+Immunoprecipitation+%28iCLIP%29+to+Determine+Protein-RNA+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Detection%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Individual Nucleotide Resolution UV Cross-Linking and Immunoprecipitation (iCLIP) to Determine Protein-RNA Interactions.</a> RNA Detection: Methods and Protocols. 1649, 427-454 (2018).</li>
<li>Wheeler, E. C., Van Nostrand, E. L., Yeo, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+challenges+in+the+detection+of+transcriptome%E2%80%90wide+protein-RNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+RNA%22%5BJournal%5D)">Advances and challenges in the detection of transcriptome‐wide protein-RNA interactions.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 9 (1), (2018).</li>
<li>Singh, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cellular+EJC+Interactome+Reveals+Higher-Order+mRNP+Structure+and+an+EJC-SR+Protein+Nexus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Cellular EJC Interactome Reveals Higher-Order mRNP Structure and an EJC-SR Protein Nexus.</a> Cell. 151, 750-764 (2012).</li>
<li>Singh, G., Ricci, E. P., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIPiT-Seq%3A+A+high-throughput+approach+for+footprinting+RNA%3Aprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">RIPiT-Seq: A high-throughput approach for footprinting RNA:protein complexes.</a> Methods. 65, 320-332 (2014).</li>
<li>Mabin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Exon+Junction+Complex+Undergoes+a+Compositional+Switch+that+Alters+mRNP+Structure+and+Nonsense-Mediated+mRNA+Decay+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The Exon Junction Complex Undergoes a Compositional Switch that Alters mRNP Structure and Nonsense-Mediated mRNA Decay Activity.</a> Cell Reports. 25 (9), 2431-2446 (2018).</li>
<li>Gehring, N. H., Lamprinaki, S., Kulozik, A. E., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disassembly+of+Exon+Junction+Complexes+by+PYM%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disassembly of Exon Junction Complexes by PYM.</a> Cell. 137 (3), 536-548 (2009).</li>
<li>Dostie, J., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+Is+Required+to+Remove+Y14+from+mRNAs+in+the+Cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Translation Is Required to Remove Y14 from mRNAs in the Cytoplasm.</a> Current Biology. 12 (13), 1060-1067 (2002).</li>
<li>Zünd, D., Gruber, A. R., Zavolan, M., Mühlemann, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation-dependent+displacement+of+UPF1+from+coding+sequences+causes+its+enrichment+in+3%27+UTRs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Translation-dependent displacement of UPF1 from coding sequences causes its enrichment in 3' UTRs.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 20 (8), 936-943 (2013).</li>
<li>Gangras, P., Dayeh, D. M., Mabin, J. W., Nakanishi, K., Singh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+Identification+of+Recombinant+Argonaute-Bound+Small+RNAs+Using+Next-Generation+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Argonaute+Proteins%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cloning and Identification of Recombinant Argonaute-Bound Small RNAs Using Next-Generation Sequencing.</a> Argonaute Proteins: Methods and Protocols. 1680, 1-28 (2018).</li>
<li>Heyer, E. E., Ozadam, H., Ricci, E. P., Cenik, C., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+kit-free+method+for+making+strand-specific+deep+sequencing+libraries+from+RNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">An optimized kit-free method for making strand-specific deep sequencing libraries from RNA fragments.</a> Nucleic Acids Research. 43 (1), 2(2015).</li>
<li>Cameron, V., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3%27-Phosphatase+activity+in+T4+polynucleotide+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">3'-Phosphatase activity in T4 polynucleotide kinase.</a> Biochemistry. 16 (23), 5120-5126 (1977).</li>
<li>Ricci, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staufen1+senses+overall+transcript+secondary+structure+to+regulate+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Staufen1 senses overall transcript secondary structure to regulate translation.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 21 (1), 26-35 (2014).</li>
<li>Lackner, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+strategy+for+CRISPR-Cas9-mediated+gene+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging.</a> Nature Communications. 6, 10237(2015).</li>
<li>Metkar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher-Order+Organization+Principles+of+Pre-translational+mRNPs%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Higher-Order Organization Principles of Pre-translational mRNPs.</a> Molecular Cell. 72 (4), 715-726 (2018).</li>
<li>Giudice, G., Sánchez-Cabo, F., Torroja, C., Lara-Pezzi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATtRACT-a+database+of+RNA-binding+proteins+and+associated+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Database%3A+The+Journal+of+Biological+Databases+and+Curation%22%5BJournal%5D)">ATtRACT-a database of RNA-binding proteins and associated motifs.</a> Database: The Journal of Biological Databases and Curation. 2016, (2016).</li>
<li>Paz, I., Kosti, I., Ares, M., Cline, M., Mandel-Gutfreund, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RBPmap%3A+a+web+server+for+mapping+binding+sites+of+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">RBPmap: a web server for mapping binding sites of RNA-binding proteins.</a> Nucleic Acids Research. 42, Web Server issue 361-367 (2014).</li>
<li>Sundararaman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resources+for+the+Comprehensive+Discovery+of+Functional+RNA+Elements%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Resources for the Comprehensive Discovery of Functional RNA Elements.</a> Molecular Cell. 61 (6), 903-913 (2016).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

אנו דנים כאן כמה שיקולים מרכזיים כדי לבצע בהצלחה RIPiT. בראש ובראשונה, כתובות Ip בודדות חייבות להיות ממוטבות להשגת היעילות הגבוהה ביותר בכל שלב. כמות חרוזים הדגל העלה עבור מספר הקלט של תאים שתוארו כאן הוכיחה להיות חזקים עבור מגוון רחב של חלבונים שבדקנו. כמו רק חלק קטן של חלבונים שותפים הוא co-immunoprecipitated עם חלבון הדגל, כמות הנוגדן הדרוש עבור IP השני יעיל הוא בדרך כלל נמוך (פחות מ 10 μg). RIPiT בקנה מידה קטן (מ 1 10 ס מ) ואחריו אימות כתמי המערבי של חלבונים בכל שבר במהלך שני שלבים immunoprecipitation להוכיח מאוד שימ...

בתוך תאים, RNA קיים מורכב עם חלבונים כדי ליצור RNA: מכלולי חלבון (RNPs). RNPs מקובצים סביב ה-RNA כריכת חלבונים (Rnps, אלה אשר לאגד ישירות RNA) אבל גם מהווים ללא Rnps (אלה לאגד Rnps אך לא RNA), ולעתים קרובות דינמי בטבע. RBPs והקופדים שלהם פועלים באופן קולקטיבי בתוך Rbps כדי לבצע פעולות רגולטוריות. לדוגמה, ב-mRNA בתיווך שטויות (NMD) מסלול, החלבונים UPF (UPF1, UPF2, ו UPF3b) מזהים את ריבוכמה הסתיים בטרם עת. כל אחד מחלבונים UPF יכול לאגד RNA, אבל זה רק כאשר הם להרכיב יחד כי מורכבת NMD פעיל מתחיל להיווצר. בתוך מתחם זה, UPF1 מופעל עוד על ידי זירחון על ידי SMG1 שאינו rbp, והפעלת UPF1 כגון בסופו של דבר מובילה לגיוס של מקדם ריקבון mrna הגורם1,2. בדוגמה זו, RBPs דורש שחקנים שאינם מבוססי RBPS עבור גיוס והפעלה של מתחם RBPS המפעיל את NMD. מאפיין נוסף של RNPs הוא הטרוגניות שלהם. שקול את הספצאוחלק, אשר קיים ברורים E, A, B או C מתחמים. מתחמים שונים מתחמי יש לחפוף חלבונים ברורים3. כדי ללמוד פונקציות RNP, חשוב להבהיר אילו Rnp מאוגדים על ידי RNP ואת החלבונים המשויכים שלה. שיטות רבות קיימות כדי להשיג זאת, עם כל גישה יש יתרונות וחסרונות ברורים שלה4,5,6,7.
השיטות הנפוצות ביותר כדי לזהות אתרי כריכה RBP-הקישור ואחריו immunoprecipitation (קליפ) ואת הווריאציות השונות שלה-להסתמך על אולטרה סגול (UV) אור כדי crosslinking RBP ל-RNA8. עם זאת, זו אינה גישה אפקטיבית עבור non-RBPs בתוך Rbps, אשר אינם פונים אל RNA ישירות. כאן, אנו מתארים גישה חלופית הישימה ל-RBPs וללא RBPs כאחד, כדי לבודד ולזהות את אתרי איגוד ה-RNA שלהם. גישה זו נקראת RNA immunoprecipitation בטנדם (ripit) מורכב משני שלבים immunoprecipitation, אשר לעזור להשיג ספציפיות יותר לעומת טיהור אחד (איור 1)9,10. כפי שניתן לבצע את הצעדים הבודדים immunoprecipitation (IP) באופן מוגזם לעומת הקליפ, RIPiT אינו תלוי בזמינות של נוגדנים שיכולים לעמוד בפני נוכחות של חומרי ניקוי חזקים במהלך immunoprecipitation. היתרון הייחודי ביותר של RIPiT הוא היכולת למקד שני חלבונים שונים בשני שלבי טיהור; הדבר מספק דרך רבת-עוצמה להעשיר את מתחם ה-RNP שונה ומורכב מתסביכים דומים אחרים11.
וריאציות קטנות להליך RIPiT יכול לשפר עוד יותר את העשרה RNP. למשל, כמה אינטראקציות RNA-חלבון או חלבון-חלבון בתוך RNPs הם ארעי וזה עלול להיות קשה לטהר ביעילות את העקבות של תסביכים כאלה. כדי לייצב אינטראקציות כאלה, RNPs יכול להיות מקושר בתוך תאים עם פורמלדהיד לפני הליזה תא ו RIPiT. לדוגמה, ראינו כי אינטראקציה חלשה בין מורכבות הצומת אקסון (ejc) הליבה גורם, EIF4AIII וגורם פירוק ejc, pym12 ניתן לייצב עם טיפול פורמלדהיד כגון זה יותר העקבות RNA מועשרים (נתונים לא מוצג). לפני איסוף התא RIPiT, תאים יכולים גם להיות מטופלים עם תרופות כדי לייצב או להעשיר RNPs במצב מסוים. לדוגמה, כאשר לומדים חלבונים שהוסרו מ-mRNA במהלך התרגום (למשל, EJC13, UPF114), טיפול במעכבי תרגום כגון puromycin, cycloheximide או harringtonine יכול להוביל לאכלוס מוגבר של חלבונים ב-RNAs.
כמות ה-RNA ששוחזר מ-RIPiT נמוך בדרך כלל (0.5-10 שומות, כלומר, 10-250 ng RNA בהתחשב באורך RNA ממוצע של 75 nt). הסיבה העיקרית לכך היא כי רק חלק קטן של חלבון נתון קיים מורכב עם חלבונים אחרים בתוך RNPs (כל "חינם" החלבון IP'ed בשלב הראשון הוא איבד במהלך ה-IP השני). כדי לייצר ספריות rna-Seq מן ה-rna הזה, אנחנו גם מתווה כאן עיבוד של פרוטוקול שפורסם בעבר מתאים כגון RNA נמוך כגון15,16 (איור 2), אשר מניב את התפוקה הגבוהה ברצף מוכן דגימות של 3 ימים.

<table><tbody><tr><td>Anti-FLAG Affinity Gel Gel</td><td>Sigma</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>ATP, [&gamma;-32P]- 3,000 Ci/mmol 10 mCi/mL EasyTide, 250 &micro; Ci</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU502A250UC</td><td></td></tr><tr><td>BD מזרקים חד פעמיים עם קצות Luer-Lok (200)</td><td>Fisher</td><td>14-823-435</td><td></td></tr><tr><td>Betaine 5M</td><td>Sigma</td><td>B0300</td><td></td></tr><tr><td>biotin-dATP</td><td>TriLink</td><td>N-5002</td><td></td></tr><tr><td>biotin-dCTP</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL540001EA</td><td></td></tr><tr><td>סוניפייר ברנסון, דגם SSE-1</td><td>ברנסון</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CircLigase I</td><td>VWR</td><td>76081-606</td><td>ssDNA ligase I</td></tr><tr><td>DMEM, גלוקוז גבוה</td><td>ThermoFisher</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>מאגר עומס DNA NEB</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads חלבון A</td><td>LifeTech</td><td>10002D</td><td></td></tr><tr><td>Flp-In-T-REx 293 קו תאים</td><td>ThermoFisher</td><td>R78007</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler סולם</td> <td>DNA בטווח נמוךThermoScientific</td><td>FERSM1203</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>ThermoFisher</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TBE ג'ל 10 בארות</td><td>Bio-Rad</td><td>4565013</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TBE-Urea Gel</td><td>Bio-Rad</td><td>4566033</td><td></td></tr><tr><td>miRCAT-33 מתאם 5&prime;-TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGddC-3&prime;</td><td>כל</td><td></td><td>פרוטוקול זה תואם רק לפלטפורמת הריצוף של Illumina</td></tr><tr><td>Mirus transIT-X2 מגיב טרנספקציה</td><td>Mirus</td><td>MIR 6004</td><td></td></tr><tr><td>Mth RNA ligase</td><td>NEB</td><td>E2610S</td><td></td></tr><tr><td>PE1.0 5&prime;-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3&prime;</td><td>כל</td><td></td><td>פרוטוקול זה תואם רק לפלטפורמת הריצוף של Illumina</td></tr><tr><td>PE2.0 5&prime;-CAAGCAGAAGACGGCATACGATCGGTCTC GGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATC*T-3&prime;</td><td>כל</td><td></td><td>פרוטוקול זה תואם רק לפלטפורמת הריצוף של Illumina</td></tr><tr><td>Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1, pH 6.7, 100 mLl)</td> <td>Fisher</td><td>BP1752I-100</td><td></td></tr><tr><td>צבע טעינת ג'ל סגול (6x)</td><td>NEB NEB</td><td>#7025</td><td></td></tr><tr><td>Q5 DNA Polymerase</td><td>NEB</td><td>M0491S/L</td><td></td></tr><tr><td>RNase I, E. coli, 1,000</td><td>U Eppicenter</td><td>N6901K</td><td></td></tr><tr><td>עמודת SPIN-X</td><td>קורנינג</td><td>CLS8160-24EA חרוזי</td><td></td></tr><tr><td>סטרפטווידין</td><td>ThermoFisher</td><td>60210</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III (SSIII)</td> <td>ThermoScientific</td><td>18080044</td><td>אנזים טרנסקריפטאז הפוך</td></tr><tr><td>SybrGold</td><td>ThermoFisher</td><td>S11494</td><td>כתם ג'ל חומצת גרעין זהב</td></tr><tr><td>T4 פולינוקלאוטיד קינאז-2500U</td><td>NEB</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>T4RNL2 Tr. K227Q</td><td>NEB</td><td>M0351S</td><td></td></tr><tr><td>טטרציקלין</td><td>סיגמא</td><td>87128</td><td></td></tr><tr><td>יציב בחום 5&חריף; App DNA/RNA Ligase</td><td>NEB</td><td>M0319S</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq_SE1 5&prime;-pGGCACTANNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCTGGCACCACCGAGAATTCCA-3&prime;</td><td>כל</td><td></td><td>פרוטוקול זה תואם רק לפלטפורמת הריצוף של Illumina</td></tr><tr><td>TruSeq_SE10 5&prime;-pGGTGTTCNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT CTTCCGATCTCTGGCACCACCGAGAATTCCA-3&prime;</td><td>כל</td><td></td><td>פרוטוקול זה תואם רק לפלטפורמת הריצוף של Illumina</td></tr><tr><td>TruSeq_SE11 5&prime;-pGGTAAGTNNNNNAGATCGGAA GAGCGTCGTCGTGTAGGGAAAGAGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCGAGAATTCCA-3&prime;</td><td>כל</td><td></td><td>פרוטוקול זה תואם רק לפלטפורמת הריצוף של Illumina</td></tr><tr><td>TruSeq_SE12 5&prime;-pGGAGATGNNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCTCTCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCACCGAGAATTCCA-3&prime;</td><td>כל</td><td></td><td>פרוטוקול זה תואם רק לפלטפורמת הריצוף של Illumina</td></tr><tr><td>TruSeq_SE2 5&prime;-pGGGTAGCNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT CTTCCGATCTCTCTGGCACCACCGAGAATTCCA-3&prime;</td><td>כל</td><td></td><td>פרוטוקול זה תואם רק לפלטפורמת הריצוף של Illumina</td></tr><tr><td>TruSeq_SE35&prime;-pGGTCGATNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCTCTCTGCTGAACCGCT CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&prime;</td><td>כל</td><td></td><td>פרוטוקול זה תואם רק לפלטפורמת הריצוף של Illumina</td></tr><tr><td>TruSeq_SE4 5&prime;-pGGCCTCGNNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGT-SPACER 18-CTCGGCTCTCTGCTGAACCGCTC TTCCCTCTCTGGCACCACCGAGAATTCCA-3&prime;</td><td>כל</td><td></td><td>פרוטוקול זה תואם רק לפלטפורמת הריצוף של Illumina</td></tr><tr><td>TruSeq_SE5 5&prime;-pGGTGACANNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&prime;</td><td>כל</td><td></td><td>פרוטוקול זה תואם רק לפלטפורמת הריצוף של Illumina</td></tr><tr><td>TruSeq_SE6 5&prime;-pGGTAGACNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&prime;</td><td>כל</td><td></td><td>פרוטוקול זה תואם רק לפלטפורמת הריצוף של Illumina</td></tr><tr><td>TruSeq_SE7 5&prime;-pGGGCCCTNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTCGTGTAGGGAAAGAGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCT TCCGATCTCCTTGGCACCGAGAATTCCA-3&prime;</td><td>כל</td><td></td><td>פרוטוקול זה תואם רק לפלטפורמת הריצוף של Illumina</td></tr><tr><td>TruSeq_SE8 5&prime;-pGGATCGGNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTT CCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&prime;</td><td>כל</td><td></td><td>פרוטוקול זה תואם רק לפלטפורמת הריצוף של Illumina</td></tr><tr><td>TruSeq_SE9 5&prime;-pGGACTGANNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC CGATCTCCTTGGCACCACCGAGAATTCCA-3&prime;</td><td>כל</td><td></td><td>פרוטוקול זה תואם רק לפלטפורמת הריצוף של Illumina</td></tr><tr><td>Typhoon 5 Bimolecular Imager</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>29187191</td><td></td></tr></tbody></table>

זיהוי של טביעות רגליים של rna: מכלולי חלבון באמצעות rna immunoprecipitation בטנדם ואחריו רצף (ripit-seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

רנ א immunoprecipitation בטנדם (RIPiT) היא שיטה להעשרת עקבות RNA של שני החלבונים בתוך RNA: חלבון (RNP) קומפלקס. RIPiT מעסיקה שני צעדי טיהור. ראשית, immunoprecipitation של RNP מתויג משנה לאחר מכן העיכול מתון RNase ובעקבות הימנעות האהדה הבאה. הimmunoprecipitation השנייה של יחידת משנה RNP נוספת מאפשרת להעשיר מתחם מוגדר. בעקבות הימנעות של RNAs וחלבונים, עקבות ה-RNA מומרים לספריות רצפי DNA של תפוקה גבוהה. בניגוד לאולטרה סגול פופולרי (UV) החוצה קישור ואחריו immunoprecipitation (CLIP) גישה להעשיר RBP אתרי כריכה, RIPiT הוא UV-crosslinking עצמאי. מכאן RIPiT יכול להיות מיושם על חלבונים רבים הנמצאים ב-RNA interactome ומעבר כי הם חיוניים רגולציה RNA אבל לא ישירות ליצור קשר עם RNA או UV-crosslink גרוע RNA. שני צעדי הטיהור בריבור מספקים יתרון נוסף של זיהוי אתרי קשירה שבהם חלבון הריבית מתפקד בשותפות עם קופקטור אחר. אסטרטגיית הטיהור הכפולה משמשת גם להגברת האות באמצעות הגבלת הרקע. כאן, אנו מספקים הליך מבחינת צעד כדי לבצע RIPiT ולייצר התפוקה גבוהה ברצף ספריות מתוך עקבות RNA מבודדים. כמו כן, אנו מתווה את היתרונות והיישומים של RIPiT ודנים בחלק מהמגבלות שלה.

RIPiT מוצלח יביא את הimmunoprecipitation של שני החלבונים של הריבית ואת החלבונים אינטראקציה אחרים הידועים, ואת העדר חלבונים שאינם באינטראקציה. כפי שנראה באיור 3A, הן MAGOH ו EIF4AIII זוהו בשנת הללויה, אבל HNRNPA1 לא היה (ליין 6). במקביל, העקבות של RNA כי יש מטוהרים משותפת עם מכלולי RNP זוהה באמצעות האדיגרפיה האוטומטית (איור 3ב) או bioanalyzer (איור 3ג). הטיפול Puromycin צפוי להגדיל א...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להעשיר את אתרי ה-RNA האנדוגניים או "עקבות" של RNA: מכלולי חלבון (RNP) מתאי יונקים. גישה זו כוללת שני immunoprecipitations של RNP תת יחידות, ולכן המכונה RNA immunoprecipitation בטנדם (RIPiT).

זיהוי של טביעות רגליים של RNA: מכלולי חלבון באמצעות RNA Immunoprecipitation בטנדם ואחריו רצף (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

RNA immunoprecipitation במשולב ואחריו רצף, או RIPiT-Seq, היא שיטה לזיהוי אילו אזורים של RNA מאוגדים על ידי זוג מסוים של חלבונים מחייבים RNA. היתרון הייחודי ביותר של RIPiT הוא היכולת שלה למקד שני חלבונים שונים בשני טיהורים. זה מספק דרך רבת עוצמה להעשיר עבור קומפלקס חלבון RNA ברור קומפוזיציה של קומפלקסים אחרים.כמו כן, RIPiT-Seq הוא עצמאי UV-crosslinking, והוא יכול להיות מיושם על חלבונים רבים לפעול על RNA מבלי לחייב אותו ישירות. בעוד שיטה זו אינה חלה ישירות לכיוון טיפול או אבחון, חלבונים מחייבים RNA ועיבוד RNA קושרו עם מספר מחלות כמו נוירופתיות וסרטן. RIPiT-Seq מספק כלי לחקר פונקציות של חלבונים מחייבים RNA הקשורים למחלות.RIPiT-Seq דורש מערכת שבה חלבון מתויג אפיטופ יכול להתבטא. הוא נבדק רק בתאי HEK293, והוא נוח ביותר לתרבות התאים. עם זאת, כעת עם היכולת שלנו לתייג חלבונים באמצעות CRISPR, RIPiT-Seq יכול להיות ישים למערכות מודרניות מגוונות.ההצלחה של RIPiT תלויה בשני immunoprecipitations יעיל, ולכן זה יהיה קריטי כדי לייעל את תנאי immunoprecipitation עבור הנוגדן בשימוש. כמו כן, עבודה עם RNA דורשת אמצעי זהירות נאותים, ולכן ריאגנטים ללא RNase יש להשתמש במהלך ואחרי מיצוי RNA. הפגנת ההליך תהיה לורן וודוורד, סטודנטית לתואר שני במעבדה שלי.התחל על ידי שטיפת תאים monolayer בעדינות עם 15 מיליליטר של PBS מקורר לכל צלחת 15 ס"מ. ואז לגרד את התאים לתוך 30 מיליליטר של PBS ולאסוף אותם בצינור חרוט 50 מיליליטר. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ב 400 גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס, ולהשליך את העל טבעי.הוסף ארבעה מיליליטר של חיץ תות תותים היפוטוני קר כקרח ולהשתמש פיפטה P1000 כדי להשעות מחדש את התאים. מעבירים את הביסאט לצינור של חמישה מיליליטר ומדרגים על קרח למשך 10 דקות. מניחים את הlysate באמבט קרח ו sonicate על פי הוראות כתב היד.לאחר מכן מוסיפים 108 מיקרוליטרים של חמישה נתרן כלורי טוחן כדי להתאים את ריכוז המלח ל 150 מילימולר. לאחר מכן, צנטריפוגה lysate ב 12, 000 גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולאסוף 20 microliters של supernatant לניתוח כתם מערבי. טרום שטיפה FLAG agarose חרוזים על פי הוראות כתב היד ולהחיל על טבעי שנותרו 750 microliters של חרוזים בצינור חמישה מיליליטר.דגירה חרוזי דגל agarose עם תמצית התא במשך שעה עד שלוש שעות בארבע מעלות צלזיוס עם ערבוב עדין. לאחר הדגירה, גלולה את חרוזים על ידי צנטריפוגה ב 400 גרם במשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס, ולאסוף 20 microliters של supernatant לניתוח כתם מערבי. השליכו את העל-טבעי הנותרים ושטפו את חרוזים על-ידי שימוש חוזר בהם בארבעה מיליליטר של חיץ שטיפת ISO.גלולה את חרוזים שוב ולהסיר את על טבעי. לדלל RNase אני ב 750 microliters של מאגר לשטוף iso על פי הוראות כתב יד, ולהוסיף אותו גם דגל agarose חרוזים. הדגירה את התערובת בארבע מעלות צלזיוס עם ערבוב עדין, ולאחר מכן גלולה את חרוזים על ידי צנטריפוגה.לאסוף 20 microliters של על טבעי לניתוח כתם מערבי, ולהשליך את השאר. לאחר מכן, לשטוף את חרוזים עם מאגר לשטוף iso כפי שתואר קודם לכן. לאחר מכן, בצעו אלוטיון אהדה על ידי הוספת 375 מיקרוליטרים של חיץ אלוטציה לחרוזים, וטלטלו את התערובת בעדינות בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה עד שעתיים.לאחר הדגירה, גלולה את חרוזים ולאסוף aliquot 15 microliter של elution לניתוח כתם מערבי. בזמן שאלוטיון הזיקה בעיצומו, בצעו התייחדות נוגדנים של חרוזים מגנטיים. התחל על ידי שטיפת 50 microliters של חרוזים מגנטיים במיליליטר אחד של חיץ שטיפת iso.תוסיפו את הצפרוזים ל-100 מיקרוליטרים של חיץ ההטיה ותוסיפו את הכמות המתאימה של נוגדנים. לאחר מכן, הדגירה את חרוזים לפחות 10 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את חרוזים מגנטיים פעמיים עם חיץ ההטיה ולחדש את חרוזים ב 375 microliters של מאגר דילול RIPiT.לאחסן את חרוזים על קרח עד immunoprecipitation. יש למרוח את אלוטת הזיקה של FLAG על חרוזים מגנטיים מקובצים בנוגדנים ולהדגירה עם ערבוב עדין למשך שעה עד שעתיים בארבע מעלות צלזיוס. ללכוד את חרוזים מגנטיים עם מגנט ולאסוף 15 microliters של על טבעי לניתוח כתם מערבי.לאחר מכן, לשטוף את חרוזים שבע פעמים עם חיץ לשטוף iso. המשך עם elution denaturing על ידי שימוש חוזר חרוזים מגנטיים ב 100 microliters של חיץ מדגם ברור דגירה ההשעיה על הקרח במשך 10 דקות. במהלך הדגירה, מעת לעת להעיף את חרוזים כדי להשתמש בהם שוב.ללכוד את חרוזים מגנטיים על מגנט ולאסוף 15 microliters של אלוט לניתוח כתם מערבי. העבר את האלוטיון הנותר לצינור חדש של 1.5 מיליליטר. כדי לחלץ את ה-RNA, הוסיפו 320 מיקרוליטרים של מים נטולי RNase ו-400 מיקרוליטרים של אלכוהול איסואמיל פנול-כלורופורם לאלוציון RIPiT.Vortex את התערובת ולאחר מכן צנטריפוגה זה ב 12, 000 גרם במשך חמש דקות. לאסוף 350 microliters של השלב הממימי לתוך צינור נפרד. מוסיפים נתרן אצטט, מגנזיום כלורי, גליקוגן ואתנול לדגימה שנאספה ומדגרים את התערובת בן לילה ב-20 מעלות צלזיוס שליליות.למחרת, גלולה RNA על ידי צנטריפוגה ב 12, 000 גרם במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס ולשטוף אותו 70% אתנול. לאחר שטיפת אתנול, לטפל RNA עם T4 פולינוקלאוטריד קינאז, או PNK, ללא כל ATP, ולבצע טיהור פנול-כלורופורם על פי הוראות כתב היד. יש לתפוש מחדש את ה-RNA הנקי ב-4.5 מיקרוליטרים של מים נטולי RNase.כדי לכמת את תפוקת ה-RNA, יש לכמת את ה-RNA עם PNK ו-32P עם תוויות ATPs בהתאם לכיווני כתב היד. השתמש בסולם DNA לטווח נמוך ואוליגו סינתטי 20 עד 40 נוקלאוטיד לתקני גודל וכמות. פתור את ה- RNA המסומן בג'ל 26%urea-polyacrylamide.מייבשים את הג'ל לפי הוראות כתב היד וחושפים את הג'ל לזרחן עד לזיהוי אות הולם. טכניקה זו שימשה כדי לחקור את האינטראקציות של מתחם צומת אקסון או EJC. ניתוח כתם מערבי של חלבונים מטוהרים מכל שלב עיקרי בהליך RIPiT מראה כי EJC מטוהר מכיל הן EIF4A3 ו MAGOH.הפקד השלילי, HNRNPA1, אינו מזוהה באלוטיון. עוצמת אות טביעת הרגל של RNA תואמת לכמות האינטראקציה של חלבון RNA. טביעת רגל חזקה יותר נצפתה כאשר RIPiT בוצע על תאים שטופלו puromycin, אשר מגביר את התפוסה EJC על RNA.כדי להבטיח שה-RIPiT היה יעיל, חשוב לבדוק את היעילות של ה-IP על ידי כתם מערבי. חשוב גם להעריך את כמות ואיכות ה-RNA לפני שתמשיך ברצף עמוק. בשנת 2018, מעבדת סינג השתמשה בהצלחה בטכניקה זו כדי לטהר שתי וריאציות שונות קומפוזיציה של קומפלקס צומת אקסון ולזהות דפוסי איגוד RNA.אם החוקרים בוחרים לזהות עקבות RNA עם אוטוביוגרפיה, יש לעקוב אחר כל נהלי הבטיחות והפרוטוקולים המתאימים לקרינה.

identification-footprints-rnaprotein-complexes-via-rna

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

בשל האופי החולף של mRNA מראש, זה יכול להיות קשה לבודד...

שיטה מהירה תפוקה גבוהה עבור Ribonucleoproteins מיפוי (RNPs) על mRNA מראש אדם

תעתיקי רנ"א כפופים תקנה posttranscriptional נרחב כי הוא מתווך על ידי מספר רב של טרנס משחק RNA מחייב חלבונים (RBPs). כאן אנו מציגים שיטה להכליל לזהות במדויק בקנה מידה רחב transcriptome האתרים RNA מחייב של RBPs.

PAR-Clip - שיטה לזהות Transcriptome רחב אתרי קישור של חלבונים RNA הכבילה

הסידור המרחבי של חלבונים RNA מחייב על תעתיק הוא הקובע המפתח של תקנה שלאחר תעתיק. לכן, פיתחנו הפרט נוקלאוטיד UV ברזולוציה crosslinking ו immunoprecipitation (iCLIP) המאפשר מיפוי מדויק גנום רחב של אתרי הקישור של חלבון-RNA מחייב.

iCLIP - Transcriptome רחב מיפוי של חלבון-RNA אינטראקציות עם רזולוציה נוקלאוטיד יחיד

צעד אחר צעד לפרוטוקול בידוד וזיהוי RNA מתחמים הקשורים באמצעות RIP שבב.

שיטה לבידוד וזיהוי mRNAs, רנ&quot;א ורכיבי חלבון של מכלולי Ribonucleoprotein מתמציות סלולריות באמצעות שבב RIP

כתב יד זה מתאר גישה לבידוד RNPs קוגנטיים נבחרים הנוצרים בתאים אוקריוטיים באמצעות העשרה מכוונת אוליגונוקלאוטידים ספציפית. אנו מדגימים את הישימות של גישה זו על ידי בידוד RNP מקביל הקשור לאזור הרטרו-ויראלי 5' הלא מתורגם המורכב מ-DHX9/RNA הליקאז A.

בידוד של קומפלקסים RNA חלבון מאותו מקור מתאי שימוש Elution oligonucleotide מכוונת

תקנה translational ממלא תפקיד חשוב בבקרה על שפע חלבונים. כאן, אנו מתארים שיטה תפוקה גבוהה לניתוח כמותי של תרגום שמרים ניצני האפייה.

הגנום כולו כימות של תרגום ניצני שמרים על-ידי יצירת פרופיל ריבוזום

Toeprinting נועד למדוד את היכולת של במבחנה עיבד RNA ל טופס תרגום חניכה מתחמי עם הריבוזומים תחת מגוון תנאים. פרוטוקול זה מתאר שיטה עבור toeprinting בתרבית של RNA והוא יכול לשמש כדי ללמוד תרגום תלויי-קאפ והן מונחות IRES.

ניתוח Toeprinting של תרגום חניכה היווצרות מורכבות על יונקים mRNAs

טנדם RNA בידוד שגרה (טיול) עבור שחזור של mRNA בנוי endogenously-חלבון מתחמי מתואר. באופן ספציפי, מתחמי RNA-חלבון תפור ויוו, polyadenylated RNAs מבודדים של תמציות עם חרוזים oligo(dT), mRNAs מסוים נלכדים עם ששונה oligonucleotides antisense RNA. חלבונים מאוגדים mRNAs מזוהים על-ידי ניתוח immunoblot.

הליך בידוד RNA טנדם מבוססי Oligonucleotide לשחזר את מתחמי ה-mRNA האיקריוטים-חלבון

אינטראקציות של תרגום משותף ממלאות תפקיד מכריע בשינויים בשרשרת המתהווה, במיקוד, בקיפול ובמסלולי הרכבה. כאן, אנו מתארים פרופיל ריבוזום סלקטיבי, שיטה לניתוח ישיר של in vivo, של אינטראקציות אלה במודל eukaryote Saccharomyces cerevisiae.

זיהוי גלובלי של רשתות אינטראקציה בין תרגומים משותפים על ידי פרופיל ריבוזום סלקטיבי

אנו מציגים immunoprecipitation ששונה כרומטין יליד רצף (צ'יפ-seq) מתודולוגיה לדור של רצף datasets מתאים נוקלאוזום צפיפות שבב-seq מסגרת אנליטית שילוב נגישות נוקלאז micrococcal (MNase) עם מדידות שינוי היסטון.

דור של כרומטין יליד Immunoprecipitation רצף ספריות לניתוח צפיפות נוקלאוזום

למד את שיטת RIPiT-Seq לזיהוי אזורי RNA הקשורים לחלבוני RNA בקומפלקסים ייחודיים. שיטה זו מאפשרת חקירת אינטראקציות RNA:חלבון בתאי יונק ללא תלות ב-UV-crosslinking.

זיהוי של טביעות רגליים של RNA: מכלולי חלבון באמצעות RNA Immunoprecipitation בטנדם ואחריו רצף (RIPiT-Seq)

גלה סרטונים נוספים