Name: דמיין את הדינמיקה של משטח הפני-תא באמצעות מיקרוסקופ גיליון אור של סריג (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: למדו לדמיין דינמיקה של קולטני T בתאי CD4+ חיים באמצעות מיקרוסקופ גיליון אור סריג. פרוטוקול זה מספק הוראות מפורטות לתיעוד תלת-ממדי בזמן אמת ברזולוציה גבוהה עם פוטו-בלאנצ'ינג מינימלי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוני להכיר בעצות ובהדרכה של ד ר וייז בינדוקאס באוניברסיטת שיקגו. אנו מודים למתקן הליבה של מיקרוסקופ אור משולב באוניברסיטת שיקגו לתמיכה ולשמירה על מיקרוסקופ האור הסריג. עבודה זו נתמכת על ידי NIH חדש המייצרת פרס 1DP2AI144245 ו NSF קריירה פרס 1653782 (כדי J.H.). התוכנית למלגות בוגרת NSF מקיימת בתמיכת ג'יי. פי.

5C. C7 TCR-transgenic RAG2 עכברים בB10. הרקע שימש במחקר זה על פי פרוטוקול שאושר על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים של אוניברסיטת שיקגו.
1. קציר והפעל תאי T
הערה: חלק זה של הפרוטוקול מבוסס על פרוטוקולים קודמים. ראה אזכורים לפרטים נוספים20,21.
<ol><li>המתת חסד a 10-12 שבוע בן 5 ג. העכבר C7 טרנסגניים של שני מין (~ 20-25 g) על פי פרוטוקול IACUC מאושר (כלומר, חדר CO2 ואחריו פריקה צוואר הרחם).</li>
	<li>ספריי גווייה העכבר ביסודיות עם 70% אתנול לספוג את הפרווה ולהביא לארון בטיחות BSL-2.</li>
	<li>להפוך את העכבר על הצד הימני שלו ולעשות חתך קטן בחלל הגוף עם מספריים כירורגית. להסיר את הטחול באמצעות מלקחיים כירורגי. חותכים את רקמת החיבור כנדרש עם מספריים כירורגיים.</li>
	<li>מניחים את הטחול ב 70 μm-הנקבוביות תא מסננת ומחית עם הגב של מזרק 1 mL. לשטוף דרך מסננת ביסודיות עם RPMI מלאה (RPMI עם 10% סרום של שור עוברי [FBS], 2 מ"מ L-גלוטמין, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 50 μM 2-mercaptoethanol).</li>
	<li>צנטריפוגה את התא הבולם היחיד של הטחול ב 300 x g עבור 5 דקות. לבטל את הסופרנטאנט. הערה: הגלולה בנקודה זו תהיה אדומה.</li>
	<li>השהה מחדש את הטחול במאגר של 5 מ ל לפירוק. דגירה עבור 5 דקות, ואז להרוות עם 5 מ ל של RPMI השלם.</li>
	<li>צנטריפוגה את התא הבולם היחיד של הטחול ב 300 x g עבור 5 דקות. לבטל את הסופרנטאנט. הערה: הגלולה בנקודה זו צריכה להיות לבנה, לא אדומה.</li>
	<li>השהה מחדש את הגלולה ב-5 מ ל להשלמת RPMI.</li>
	<li>העבר לבקבוקון T-25 והוסף 10 μM עש ציטוכרום-C (מק, רצף אנארדיליאיקטק). הניחו את התאים בחממה לתרבות התא ב-37 ° c, 5% CO2 לילה.</li>
	<li>ביום למחרת, להוסיף רקומביננטי עכבר IL-2 לריכוז הסופי של 100 U/mL.</li>
	<li>צפו בימים הבאים, הוספת מדיה טרייה כאשר המדיה הנוכחית הופכת לצהובה. תאי T ימותו אם שמאל במדיה צהוב ללא השגחה עבור מעל 48 h. תאים מוכנים להשתמש 6-10 ימים לאחר הקציר.</li>
</ol>2. הכן תאים
<ol><li>מודטה 5 מילימטר שמיכות עגול עם 0.1% פולי-L-ליזין עבור 10 דקות.. ולתת להתייבש באופן טבעי</li>
	<li>השתמש מגיב הדרגתי צפיפות (לראות את הטבלה של חומרים) כדי להפריד תאים מתים להשיג 1 x 106 תאים T ו-1 x 106 apcs (CH27 תאים21, 22 התמרה באמצעות ציטוסולג mcherry) בנפרד. הערה: תאים נספרים באמצעות הומוציטוטומטר.<ol>
<li>הוסף 3 מ ל של צפיפות מעבר הצבע מגיב ל 15 מ"ל צינור חרוט ולהוסיף תאים dropwise לקצה הצינור בזהירות. אל תערבב. צנטריפוגה ב 930 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c; השתמש בהאצת/האטה: איטית/איטית. הסר את שכבת התאים האמצעית הדקה בין המדיה המלאה ומעבר הצבע המגיב בקפידה, תוך הצבת כל סוג תא בצינורות חרוטיים נפרדים. הערה: יש צורך להכין יותר תאים מהדרוש להדמיה, כפי שאנו מוצאים כי 50% אובד בממוצע במהלך התהליך. יותר תאים המשמשים את התהליך, קל יותר לקצור אותם מעבר הדרגתי צפיפות. אנו משתמשים 4-8 mL של שני סוגי התא כדי להבטיח תאים עודפים. במקרה הצורך, ניתן לספור תאים לפני שלב זה כדי להבטיח את נפח האחסון הדרוש. כל התאים הנוספים הם בחזרה לתוך מבחנות בהתאמה שלהם.</li>
		<li>לשטוף את שתי הצינורות של תאים T ו CH27 תאים שלוש פעמים עם 5 mL להשלים RPMI (300 x g עבור 5 דקות). התעלם מהסופרנטנט בכל פעם בזמן השטיפה. השהה מחדש כל צינור ב-1 mL להשלים RPMI ולספור תאים על ידי הומוציטומטר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>השעיה מחדש 1 x 106 apcs ב 500 μl להשלים RPMI ולהוסיף 10 ΜM mcc. דגירה עבור 3 h ב 37 ° צ', 5% CO2. לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 500 μL RPMI להשלים (300 x g עבור 5 דקות). . להיפטר מהסופרנטנמלים</li>
	<li>השהה מחדש 1 x 106 תאים T ב 500 μl השלם RPMI. להוסיף 2 μg של anti-TCRβ Alexa488 התווית Fab (שיבוט H57) כדי 500 μL של תאים. דגירה של 30 דקות ב 37 ° c, 5% CO2. לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 500 μL של RPMI השלם (300 x g עבור 5 דקות). מחק את הסופרנטאנט לאחר כל כביסה. הערה: הנוגדן האנטי-ממדי שנחתך באמצעות ערכת הכנה מסוג Fab (ראה את שולחן החומרים) כדי למנוע התחברות של קולטני התא T על-ידי הנוגדן הדינטי (שלב זה הוא אופציונלי).</li>
	<li>השהה מחדש את שני סוגי התאים ב-500 μL של מדיית דימות (פנול-free-15 בינוני של לייבוביץ עם 10% FBS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 2 מ"מ L-גלוטמין).</li>
</ol>3. הנהלת המערך היומי של LLSM
הערה: (חשוב) פרוטוקול יישור זה מבוסס על כלי ה-LLSM המשמש (ראה את טבלת החומרים). כל LLSM עשוי להיות שונה ודורשים אסטרטגיות יישור שונות, במיוחד אלה שנבנו בבית. בצע את היישור השגרתי המתאים והמשך לסעיף 4.
<ol><li>הוסף 10 מ ל של מים פלוס 30 μL fluorescein (1 מ"ג/mL מלאי) אל האמבטיה LLSM (~ 10 mL נפח), לחץ על תמונה (Home) כדי להעביר את המטרה למיקום התמונה, ולהסתכל על תבנית יחידה לייזר בסל. יישר את קרן הלייזר בעזרת המדריכים והאזור שנקבע מראש של ריבית (ROI) כדי להפוך את הקרן לתבנית דקה בכל הכיוונים.<ol>
<li>הקרן צריך גם להופיע ממוקד מצלמת מאתר. השתמש שתי מראה להטות משקף, מיקרומטר העליון, פוקוס, וצווארון אובייקטיבי המטרה כדי לכוונן. ראה איור 2א, B עבור קרן מיושרת כהלכה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לשטוף את האמבטיה ואת המטרות עם לפחות 200 mL של מים כדי להסיר לחלוטין fluorescein.</li>
	<li>התמונה חרוזים בתקן פלורסנט במדיה הדמיה (מוכן על ידי שמירה חרוזים 5 מ"מ coverslip עם פולי-L-ליזין, לראות את הטבלה של חומרים; זה יכול להיות מראש מוכן מחדש) עבור פונקציה התפשטות נקודה פיזית (psf) במדיה הדמיה. הערה: יכול להיות רק חרוז אחד בתצוגה לעיבוד מאוחר יותר, כך לנסות למצוא חרוז כי הוא על ידי עצמו בצופה או יכול בקלות להיחתך כדי לקבל חרוז אחד.<ol>
<li>הפעל מיזוג צבעים על-ידי הגדרה ל-3 בתיבה ' X galvo range '. הקש על Live כדי להציג את השדה הנוכחי. לנוע לאורך כיוון Z כדי למצוא את שובר הכיסוי ואת החרוזים. מצא את המרכז של חרוז על ידי נע לאורך Z, לחץ על הפסק כדי להשהות את הלייזר. בדוק תלת -ממד, הקש מרכז ולאחר מכן לחץ על בצע. פעולה זו תאסוף את הנתונים.</li>
		<li>באופן ידני להתאים את המראה הטיה, הצווארון האובייקטיבי, מיקרומטר מיקוד הערכים האפורים הגבוהים ביותר, ולאחר מכן להתאים לפי הצורך כדי להשיג דפוסים הנכון עבור סריקה אובייקטיבית, z galvo, z + מטרה (תוצרת מדומה), ו לדוגמה לסרוק (סמלפימית) ללכוד מצבי. ראה איור 2C-F עבור הקרנות מרביות בעוצמה מקסימלית (mips). הערה: מצבי לכידות שונים (סריקה אובייקטיבית, z galvo, z + אובייקטיבי, וסריקה לדוגמה) לשנות את האופן שבו גיליון האור נע דרך המדגם. יש להשתמש בכל מצבי הסריקה לצורך יישור.</li>
		<li>הסריקה לדוגמה מראה כיצד הנתונים ייאספו במהלך הניסוי. לאסוף את PSF לדוגמה על ידי לחיצה על לבצע במצב סריקה לדוגמה עבור deskewing ופירוק (ראה סעיף 5). לשנות לייזרים למצב צבע שלושה (488, 560, 647) ולחץ לבצע שוב. הערה: מאז תמונות LLSM בזווית (57.2 °), תמונות שנתפסו במצב "לסרוק את המדגם" נאספים בזווית זו, ולכן הם "מוטה". De-skewing הוא תהליך של תיקון עבור זווית זו ו "יישור מחדש" את התמונה למחסנית z אמיתי. יש לאסוף נתונים אלה במדיית הדמיה ובכל הערוצים שיהיו בתמונה במהלך הניסוי. אם הדבר לא נאסף כראוי, הנתונים לא יהיו מכווננים כהלכה. כמו כן, ודא שהמדיה הייתה מתחממת ל-37 ° צ' (או לטמפרטורה הניסיונית הרצויה).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. הגדרת תאים עם LLSM
<ol><li>הוסף 100,000 APCs (50 μL) משלב 2.5 עד 5 מ"מ בקוטר שמיכות מעגלית משלב 2.1 ולאפשר להם להתפשר על 10 דקות.</li>
	<li>משמן את מחזיק המדגם ולאחר מכן להוסיף את התא coverslip בצד עד זה. הוסף טיפה של מדיית הדמיה לחלק האחורי של שמיכות כדי למנוע בועות לפני הצבת באמבטיה. לעזאזל עם מחזיק המדגם על piezo, ולחץ על התמונה (Home).</li>
	<li>מצא APC לתמונה כדי להבטיח את התוכנה LLSM והדמיה (ראה טבלת חומרים) מתפקד כראוי. הערה: אנו התמונה בגודל השלב 0.4 יקרומטר עם 60 z-שלבים ו 10 ms חשיפה לשני צבעים עם מיזוג להגדיר 3, אשר תוצאות 1.54 s לכל מסגרת של תמונה תלת-ממדית עם ~ 200 nm ו-400 הרזולוציה ננומטר z. ייתכן שיהיה צורך לכוונן הגדרות אלה על בסיס גודל התא, הרזולוציה הרצויה של z, וכוח האות משיטת תיוג הפלורסנט המשמשת. השימוש בכוח לייזר יהיה גם משתנה בהתבסס על הטכניקה תיוג פלורסנט בשימוש.<ol>
<li>הקש על Live כדי להציג את התמונה הנוכחית. הזז לאורך Z כדי למצוא את שובר הכיסוי והתאים.</li>
		<li>מצא את מרכז APC על ידי הזזת כיוון Z, ולאחר מכן לחץ על הפסק כדי להשהות את הלייזר. בדוק תלת -ממד והקלט את ההגדרות הרצויות (ראה שלב 4.3.1), הקש Center ולאחר מכן לחץ על בצע. פעולה זו תאסוף את הנתונים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הנמך את השלב כדי לטעון מיקום ולהוסיף 50 μl של תאים T במדיית הדמיה (100,000 תאים, משלב 2.5) dropwise ישירות מעל coverslip. מומלץ לתת טופס טיפה על קצה הפיפטה ולאחר מכן לגעת בקצה לנוזל האמבט. להעלות את השלב בחזרה על ידי לחיצה על "תמונה (לחזור)".</li>
	<li>. התחילו בהדמיה הקפד להגדיר את גודל המחסנית הרצוי באורך זמן הקפיצה. לדוגמה, התמונה 60 z-ערימות בגודל 0.4 יקרומטר שלב וקלט 500 מסגרות הזמן. (בדרך כלל) להפסיק את ההקלטה לפני 500 מסגרות מגיעים כדי להימנע photobleaching לבנה. השתמש במצב Live כדי לחפש זוגות תאים וכאשר הגדרות מוכנות ורצויות הוזנו, לחץ על הפעל כדי לאסוף נתונים. ראה סרט 1 ואיור 1 לדוגמה.</li>
</ol>5. מעקב אחר דינמיקה של פני השטח
<ol><li>יצא את הנתונים מתוכנת הדימות (עיין בטבלת החומרים). זה ייצור z-מחסנית TIF קבצים עבור כל נקודת זמן בכל צבע.</li>
	<li>. קודם כל, ולפרק את המידע הערה: אנו משתמשים בצינור הנפט LLSpy תחת רישיון על ידי מחקר בקמפוס Janelia של המחקר18, אבל deskewing ופירוק זמינים גם בתוך תוכנות דימות מרובות (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>. לדבליץ את הנתונים הערה: אנו משתמשים בתכונת הדבליץ של פיג'י עם התאמת היסטוגרמה (מסלול פיג'י: תמונה | כוונן | תיקון אקונומיקה | התאמת היסטוגרמה | בסדר).</li>
	<li>יבא לתוך תוכנת המעקב (עיין בטבלת החומרים). עקוב אחר אשכולות לפי מפרטי התוכנה. ראה סרט 2 לדוגמה. הערה: תוצאות המעקב יהיו תלויות בתוכנת המעקב שבשימוש, באלגוריתם שנבחר, בפרמטרים הרצויים של הפלט שנבחרו, וכו '. לדוגמה, בתוכנת המעקב שלנו (ראה את טבלת החומרים), בחרנו לאפשר לתוכנה לעקוב אחר צורות חריגות, במקום להקצות לכל תכונה נקודה אחת, מאחר שאשכולות tcr אינם מאורגנים לתחומים מושלמים. בנוסף, בחרנו לאסוף 35 פרמטרים, כולל מהירות, כיוון, נפח, עוצמה, אזור, מיקום ומעקב אחר מידע משך. עם זאת, שיטות או פרמטרים שונים יהיו מועילים לענות על שאלות שונות.<ol>
<li>אם לא רצוי לבצע מעקב, השתמש בתוסף הקול לקבלת המחשה ויצירת סרטים מנתוני היפרמחסנית.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Poulter, N. S., Pitkeathly, W. T. E., Smith, P. J., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Physical+Basis+of+Total+Internal+Reflection+Fluorescence+%28TIRF%29+Microscopy+and+Its+Cellular+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The Physical Basis of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy and Its Cellular Applications.</a> Methods in Molecular Biology. 1251, Clifton, N.J. 1-23 (2015).</li>
<li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+for+the+cell+biologist%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist.</a> Journal of Cell Science. 123, Pt 21 3621-3628 (2010).</li>
<li>Axelrod, D. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAxelrod%2C+D+%22Methods+in+Cell+Biology%22">Methods in Cell Biology</a>. 89, Chapter 7 169-221 (2008).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Intracellular+Fluorescent+Proteins+at+Nanometer+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission%3A+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Optics Letters. 19 (11), 780(1994).</li>
<li>Shroff, H., White, H., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivated+Localization+Microscopy+%28PALM%29+of+Adhesion+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Photoactivated Localization Microscopy (PALM) of Adhesion Complexes.</a> Current Protocols in Cell Biology. 58 (1), 1-28 (2013).</li>
<li>Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Live-Cell+Dynamics+and+Structure+at+the+Single-Molecule+Level%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level.</a> Molecular Cell. 58 (4), 644-659 (2015).</li>
<li>Ji, N., Shroff, H., Zhong, H., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+speed+and+resolution+of+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Advances in the speed and resolution of light microscopy.</a> Current Opinion in Neurobiology. 18 (6), 605-616 (2008).</li>
<li>Erni, R., Rossell, M. D., Kisielowski, C., Dahmen, U. Atomic Resolution Imaging with a sub-50 pm Electron Probe. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://escholarship.org/uc/item/3cs0m4vr">https://escholarship.org/uc/item/3cs0m4vr</a> (2019).</li>
<li>Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ion+beam+scanning+electron+microscopy+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Focused ion beam scanning electron microscopy in biology.</a> Journal of Microscopy. 254 (3), 109-114 (2014).</li>
<li>Chen, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lattice+light-sheet+microscopy%3A+Imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. , (2014).</li>
<li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptively+transferred+natural+killer+cells+maintain+long-term+antitumor+activity+by+epigenetic+imprinting+and+CD4%2B+T+cell+help%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Adoptively transferred natural killer cells maintain long-term antitumor activity by epigenetic imprinting and CD4+ T cell help.</a> Oncoimmunology. 5 (9), 1219009(2016).</li>
<li>Chaudhri, A., Xiao, Y., Klee, A. N., Wang, X., Zhu, B., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-L1+Binds+to+B7-1+Only+In+Cis+on+the+Same+Cell+Surface%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">PD-L1 Binds to B7-1 Only In Cis on the Same Cell Surface.</a> Cancer Immunology Research. 6 (8), 921-929 (2018).</li>
<li>Forbes, C. A., Scalzo, A. A., Degli-Esposti, M. A., Coudert, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ly49C-dependent+control+of+MCMV+Infection+by+NK+cells+is+cis-regulated+by+MHC+Class+I+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Ly49C-dependent control of MCMV Infection by NK cells is cis-regulated by MHC Class I molecules.</a> PLoS pathogens. 10 (5), 1004161(2014).</li>
<li>Schöneberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4D+cell+biology%3A+big+data+image+analytics+and+lattice+light-sheet+imaging+reveal+dynamics+of+clathrin-mediated+endocytosis+in+stem+cell-derived+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">4D cell biology: big data image analytics and lattice light-sheet imaging reveal dynamics of clathrin-mediated endocytosis in stem cell-derived intestinal organoids.</a> Molecular biology of the cell. 29 (24), 2959-2968 (2018).</li>
<li>Gao, R., et al. Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGao%2C+R+%22Science%22">Science</a>. 363 (6424), New York, N.Y. 8302(2019).</li>
<li>Cai, E., et al. Visualizing dynamic microvillar search and stabilization during ligand detection by T cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCai%2C+E+%22Science%22">Science</a>. 356 (6338), New York, N.Y. 3118(2017).</li>
<li>Ritter, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+Depletion+Initiates+Events+Leading+to+Granule+Secretion+at+the+Immunological+Synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Actin Depletion Initiates Events Leading to Granule Secretion at the Immunological Synapse.</a> Immunity. , (2015).</li>
<li>Lim, J. F., Berger, H., Su, I. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Activation+of+Murine+Lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and Activation of Murine Lymphocytes.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (116), e54596(2016).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Single+Peptide-Major+Histocompatibility+Complex+Ligand+Triggers+Digital+Cytokine+Secretion+in+CD4%2B+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A Single Peptide-Major Histocompatibility Complex Ligand Triggers Digital Cytokine Secretion in CD4+ T Cells.</a> Immunity. 39 (5), 846-857 (2013).</li>
<li>Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+ligand+recognition+by+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct observation of ligand recognition by T cells.</a> Nature. 419 (6909), 845-849 (2002).</li>
<li>Jansson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mathematical+framework+for+analyzing+T+cell+receptor+scanning+of+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">A mathematical framework for analyzing T cell receptor scanning of peptides.</a> Biophysical journal. 99 (9), 2717-2725 (2010).</li>
<li>Mickoleit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+reconstruction+of+the+beating+zebrafish+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart.</a> Nature Methods. 11 (9), 919-922 (2014).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

הפרוטוקול המוצג היה אופטימיזציה לשימוש של CD4+ T תאים מבודדים מ 5c. בשימוש בכלי ה-LLSM משתמשים, ולכן מערכות תאים אחרות ו-Llsm עשויים להיות ממוטבים באופן שונה. עם זאת, פרוטוקול זה מראה את העוצמה של הדמיה 4D, כפי שניתן להשתמש בו כדי לכמת את הדינמיקה של קולטן פני השטח על תא שלם עם עיוות הפחות בתנאים פיסיולוגיים. לכן, קיימים יישומים עתידיים רבים אפשריים של טכניקה זו.
צעד קריטי מאפשר לתאים להתיישב בריכוז מתאים. אם רבים מדי APCs להתיישב על שמיכות ולהיות צפוף מדי, קשה למצוא תא T כי הוא אינ...

הדינמיקה המדויקת של הסחר במולקולות והפצת המשטחים התלת-ממדיים בזמן אמת הייתה תעלומה לפתרון. מיקרוסקופ תמיד היה איזון של מהירות, רגישות, ורזולוציה; אם אחד או שניים מהם מוגדלים, השליש ממוזער. לכן, בשל גודל קטן ומהירות עצומה עם אילו קולטני פני השטח לנוע, מעקב אחר הדינמיקה שלהם נשאר אתגר טכנולוגי גדול לתחום של ביולוגיה התא. לדוגמה, מחקרים רבים נערכו באמצעות סך השתקפות פנימית מיקרוסקופ (tirf)1,2,3, אשר יש ברזולוציה הטמפורלית הגבוהה, אבל יכול רק תמונה פרוסה דקה מאוד של קרום T-cell (~ 100 nm), ולכן מחמיץ אירועים קורה רחוק יותר בתא. אלה תמונות TIRF גם מראה קטע דו מימדי של התא. לעומת זאת, טכניקות ברזולוציה סופר, כגון מיקרוסקופ סטוכסטי שחזור אופטי (סטורם)4, מיקרוסקופ לוקליזציה פוטומופעל (PALM)5, ו מיקרוסקופית פליטה מגורה (ההיסטד)6, יכול להתגבר על מגבלת מגביל של אבה של האור. טכניקות אלה יש רזולוציה מרחבית גבוהה (~ 20 החלטה nm)4,5,6,7, אבל לעתים קרובות הם לוקחים הרבה דקות כדי לרכוש מלא דו-ממדי (2d) או תלת מימדי (3d) התמונה, ולכן הרזולוציה הטמפורלית אובד. בנוסף, טכניקות כגון הסערה והדקל המסתמכים על אותות מהבהבים עשויים להיות אי-דיוקים בספירת8,9. מיקרוסקופ אלקטרוני יש הרזולוציה הגבוהה ביותר (עד 50 pm החלטה)10; זה יכול אפילו להתבצע תלת מימדי עם קרן יון ממוקדת סריקה אלקטרון מיקרוסקופ (פרפור-SEM), וכתוצאה מכך 3 ננומטר XY ו 500 nm Z החלטה11. עם זאת, כל צורה של אלקטרון מיקרוסקופ דורש הכנה לדוגמה קשה יכול להתבצע רק עם תאים קבועים או רקמות, ביטול האפשרות של הדמיה לחיות דגימות לאורך זמן.
טכניקות כדי להשיג את הרזולוציה גבוהה זמן זמן הדרוש כדי לזהות את הדינמיקה של פני השטח מולקולות תאיים בתאים חיים בטבע הפיזיולוגי האמיתי שלהם 3d הוא רק לאחרונה פיתח. אחת הטכניקות הללו היא מיקרוסקופ גיליון האור של סריג (LLSM)12, אשר מנצל גיליון אור מובנה כדי להקטין באופן דרסטי הלבנה. פותח בשנת 2014 על ידי חתן פרס נובל אריק ביאזיג, הרזולוציה הגבוהה בציר, הלבנה נמוכה ורעש הרקע, ואת היכולת לדמות בו מאות מטוסים לשדה התצוגה להפוך מיקרוסקופים מעולה לשדה שטח, tirf וקונפוקלית יקרוסקופים12,13,14,15,16,17,18,19. זה 4-מימדי (x, y, z ו-time) הדמיה טכניקה, בעוד עקיפה מוגבלת (~ 200 ננומטר החלטה XYZ), יש ברזולוציה הטמפורלית מדהים (השגנו שיעור מסגרת של כ 100 fps, וכתוצאה מכך תמונת תא 3D שוחזר עם 0.85 שניות לכל מסגרת) עבור רכישה מרחבית תלת-ממדית.
Llsm ניתן להשתמש בדרך כלל כדי לעקוב אחר הדינמיקה בזמן אמת של כל המולקולות בתוך תא כלשהו ברמת מולקולה אחת וברמה תא יחיד, במיוחד אלה בתאי נעים מאוד כגון תאים חיסוניים. לדוגמה, אנו מראים כאן כיצד להשתמש ב-LLSM כדי להמחיש דינאמיקה של קולטן T-cell (TCR). תאי T הם התאים האפקטור של המערכת החיסונית אדפטיבית. TCRs אחראים לזיהוי פפטיד-MHC (pMHC) ליגנדס הציג על פני השטח של תאים המציגים אנטיגן (APC), אשר קובע את הבחירה, פיתוח, בידול, גורל, ותפקוד של תא T. הכרה זו מתרחשת בממשק שבין תאי T ו-APCs, וכתוצאה מכך, באשכולות הקולטן מקומי כדי ליצור את מה שנקרא סינפולוגית. אמנם ידוע כי TCRs ב סינפולוגית החיסונית הם הכרחי לפונקציה T-cell אפקטור, עדיין לא ידוע הם המנגנונים הבסיסיים של סחר TCR בזמן אמת הסינפסה. LLSM אפשרה לנו לדמיין בזמן אמת את הדינמיקה של TCRs לפני ואחרי הסחר בסינפסה עם האינטראקציה הנובעת pMHC-TCR (איור 1). LLSM ניתן להשתמש לפיכך כדי לפתור את השאלות הנוכחיות של הדינמיקה המעצבים של TCRs ולספק תובנות כדי להבין כיצד תא מבדיל בין אנטיגנים עצמאיים וזרים.

<table><tbody><tr><td>1 מ"ל מזרק</td><td>BD</td><td>309659</td><td>לקציר תאי T</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148-25ML</td><td>לתרבית תאי T</td></tr><tr><td>5 מ"מ כיסויים עגולים</td> World <td>Precision Instruments</td><td>502040</td><td>להדמיה</td></tr><tr><td>70um מסננת תאים סטרילית</td><td>קורנינג</td><td>7201431</td><td>לקציר תאי T</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 אנטי עכבר TCR & beta; נוגדן שרשרת</td><td>BioLegend</td><td>109215</td><td>להדמיית</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>X& תרבית תאים</td><td>Y FBS-500</td><td>לתרבית תאי T</td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>מגיב שיפוע מכחיש לקציר תאי T</td></tr><tr><td>מלח נתרן פלואורסצאין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>F6377</td><td>ליישור מיקרוסקופ</td></tr><tr><td>FluoSpheres מיקרוספירות קרבוקסילט שונה</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F8810</td><td>ליישור מיקרוסקופ</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td> תוכנת מעקב <td>N/A</td><td>; אפשרויות אחרות לתוכנת מעקב כוללות Amira או Trackmate (פיג'י).</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ גיליון אור סריג</td><td>3i</td><td>N / A</td><td>מיקרוסקופ השתמש במדיום</td></tr><tr><td>L-15 של לייבוביץ, ללא פנול אדום</td><td>תרמו פישר</td><td>21083027</td><td>מדעית להדמיה</td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>25030-081</td><td>לתרבית תאי T</td></tr><tr><td>LLSpy</td><td>Janelia מחקר קמפוס N</td><td>/A</td><td>LLSpy שימש ברישיון מהמכון הרפואי הווארד יוז, קמפוס המחקר ג'נליה. צור קשר עם innovation@janelia.hhmi.org לקבלת גישה. שיטות דה-קונבולוציה ו-deksewing אחרות זמינות בתוכנות עיבוד תמונה כגון Fiji, Slidebook, Amira ואחרות. <a href="https://llspy.readthedocs.io/en/latest/" target="_blank">https://llspy.readthedocs.io/en/latest/</a></td></tr><tr><td>Moth Cytochrome C (MCC), רצף ANERADLIAYLKQATK</td><td>Elimbio</td><td>סינתזה מותאמת אישית</td><td>לקציר תאי T</td></tr><tr><td>Penacillin/Streptamycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140122_3683884612</td><td>לתרבית תאי T</td></tr><tr>מוצרי מחקר<td>פולי-L-ליזין</td><td>פניקס</td><td>P8920-100ML</td><td>להדמיית</td></tr><tr><td>RBC מאגר ליזה</td><td>eBioscience</td><td>00-4300-54</td><td>לקציר תאי T</td></tr><tr><td>עכבר רקומביננטי IL-2</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>I0523</td><td>לתרבית תאי T</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>MT10040CV קורנינג</td><td></td> בינוני <td>לתרבית תאי T</td></tr><tr><td>Slidebook</td><td>3i</td><td>N / A</td><td>LLSM תוכנת הדמיה</td></tr><tr><td>כלי</td> <td>דיסקציה כירורגיתNova-Tech International</td><td>DSET10</td><td>לקציר תאי</td></tr><tr><td>T T-25 צלוחיות</td><td>Eppendorf</td><td>2231710126</td><td>לתרבית תאי</td></tr><tr><td>T Thermo Scientific Pierce Fab ערכות הכנה מיקרו</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>44685</td><td>להכנת Fab</td></tr></tbody></table>

דמיין את הדינמיקה של משטח הפני-תא באמצעות מיקרוסקופ גיליון אור של סריג

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

האיתות והתפקוד של תא מוכתבים על-ידי מבנים דינאמיים ואינטראקציות של קולטני פני השטח שלה. כדי באמת להבין את היחסים מבנה פונקציה של קולטנים אלה באתרו, אנחנו צריכים להמחיש ולעקוב אחריהם על פני השטח התא לחיות עם רזולוציה מספקת הזמן הזמני. כאן אנו מראים כיצד להשתמש לאחרונה פיתח רשת מיקרוסקופית גיליון אור (LLSM) לתמונה קולטני T-cell (TCRs) ארבע-מימדי (4D, מרחב וזמן) בקרום התא החי. תאי T הם אחד התאים העיקרי של האפקטור של המערכת החיסונית אדפטיבית, וכאן השתמשנו בתאי T כדוגמה כדי להראות כי האיתות והפונקציה של תאים אלה מונעים על ידי הדינמיקה ואינטראקציות של TCRs. LLSM מאפשר הדמיה 4D עם רזולוציה חסרת תקדים הזמני. טכניקה זו מיקרוסקופית ולכן ניתן להחיל בדרך כלל על מגוון רחב של מולקולות משטח או תאיים של תאים שונים בביולוגיה.

כאן, אנו מתארים את הבידוד, ההכנה, והדמיה של העכבר הראשי 5C. התאים C7 T באמצעות סריג במיקרוסקופ האור. במהלך סעיף 3, זה הכרחי ליישר את המיקרוסקופ כראוי, ולאסוף PSF היומי שבו כדי לפרק את הנתונים לאחר האוסף. באיור 2, אנו מציגים את התמונות יישור הנכון שיראו בעת יישור המיקרוסקופ. איור 2A ו- איור 2ב הצגת נתיב הקרן הנכון ויישור הקרן, בהתאמה, כאשר הם מופיעים בתמונה בפלואורואסעין. הסריקה האובייקטיבית צריכה לה...

המטרה של פרוטוקול זה היא להראות כיצד להשתמש במיקרוסקופיה של יריעות האור כדי להמחיש באופן זמני את הדינמיקה של קולטן פני השטח בתאים חיים. כאן קולטני תא T על CD4+ תאי t הראשי מוצגים.

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

מיקרוסקופיית יריעות אור סריג היא טכנולוגיית הדמיה רבת עוצמה, אבל מעבדות מעטות בעולם מסוגלות להשתמש בו. פרוטוקול זה מספק סקירה מפורטת של אופן השימוש במיקרוסקופ גיליון האור המסחרי הזמין. זוהי מערכת חזקה מאוד המסוגלת הדמיה ארבע מימדית של תאים בודדים או עוברים המאפשר מעקב בזמן אמת של מולקולות.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יכולה לדמיין תלת מימדי תאים חיים בודדים או איברים ברזולוציה מרחבית גבוהה והלבנת תמונות מינימלית. דפוס הסריג של יריעת האור מאפשר לנו דגימות תמונה במהירות גבוהה ולקבל קטעי וידאו בזמן אמת של תאים חיים תלת מימדיים ואיברים עם פרטים מולקולריים שטכניקות אחרות לא יכולות להשיג. פרוטוקול וידאו ראשון זה מראה כיצד לנו סריג מיקרוסקופיה גיליון אור לתמונה תא יחיד ארבע מימדי.זוהי טכניקה מסובכת מאוד עקב יישור הכנת מדגם. ואנחנו מאמינים שהדגמה חזותית תשפר את הנגישות בכך שתאפשר ליותר מדענים לדמיין מולקולות, תאים ואיברים רבים ושונים בביולוגיה. כדי להתחיל בהליך זה, דגירה חמישה מילימטר עגול מכסה עם 0.1% פולי-L-ליסין בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.שאף את הנוזל ותן לכיסויים להתייבש באופן טבעי. לאחר מכן, להוסיף שלושה מיליליטר של שיפוע צפיפות לצינור חרוט 15 מיליליטר. בזהירות להוסיף תאים טיפה חכם לקצה הצינור.צנטריפוגה ב 930 פעמים g ו בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר מכן, הסר בזהירות את השכבה האמצעית הדקה של התאים בין המדיה המלאה לבין רה"מ הדרגתי הצפיפות הקפד לשים כל סוג תא לתוך צינור חרוט נפרד. צנטריפוגה ב 300 פעמים g במשך חמש דקות כדי לשטוף את התאים.השלך את העל-טבעי והוסף חמישה מיליליטר של RPMI לצינורות של תאי T ותאי CH27. חזור על השטיפה עם RPMI טרי עד שלוש שטיפות סה"כ בוצעו. לאחר מכן, תן שימוש חוזר בתאים בכל צינור עם מיליליטר אחד של RPMI מלא וספירת התאים עם המוציטמטר.תוסיפו מחדש מיליון תאים המציגים אנטיגן ב-500 מיקרוליטרים של RPMI מלא ותוסיפו 10 מיקרומולרים MCC. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך שלוש שעות. לאחר מכן, תן שימוש חוזר במיליון תאי T ב-500 מיקרוליטרים של RPMI מלא.הוסיפו שני מיקרוגרם של בטא אלקסה 488 נגד TCR המסומן כ-FAB ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני למשך 30 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה שני התאים ב 300 פעמים g במשך חמש דקות ולהשליך את supernatant. מוסיפים 500 מיקרוליטרים של RPMI מלא וחוזרים על הצנטריפוגה כדי לשטוף את התאים.חזור על השטיפה עם RPMI טרי עד שלוש שטיפות סה"כ בוצעו השלכת supernatant לאחר כל שטיפה. לאחר מכן, תן שימוש חוזר בשני סוגי התאים ב-500 מיקרוליטרים של מדיית הדמיה. ראשית, מוסיפים 10 מיליליטר מים ו-30 מיקרוליטרים של פלואורסין לאמבטיה LLSM.הקש Image Home כדי להזיז את האובייקט למיקום תמונה ולהסתכל על תבנית קרן לייזר בודדת של Bessel. יישר את קרן הלייזר באמצעות קו היישור ואזור העניין המוגדר מראש כדי להפוך את הקרן לתבנית דקה המאוזנת לכל הכיוונים. הקרן אמורה להופיע גם ממוקדת במצלמת הממצא.השתמש בשני מכוונני הטיית המראה, במיקרומטר המוקד העליון ובצבע המטרה כדי להתאים את הקרן. לאחר מכן, לשטוף את האמבטיה ואת המטרות עם לפחות 200 מיליליטר של מים כדי להסיר לחלוטין כל פלואורסאצין. כדי לדמיין חרוזים פלואורסצנטיים סטנדרטיים, הפעל מיזוג צבעים על-ידי הגדרה לשלוש בתיבה טווח Xgalvo והקש Live כדי להציג את השדה הנוכחי.התאם ידנית את מראה ההטיה, צבע המטרה ומיקרומטר המוקד לערכי האפור הגבוהים ביותר. לאחר מכן, להתאים לפי הצורך כדי לקבל דפוסים נאותים עבור סריקה אובייקטיבית, Z galvo, Z פלוס המטרה, מצבי לכידת סריקה לדוגמה. לאחר מכן, לחץ על בצע במצב סריקה לדוגמה כדי לאסוף את פונקציית התפשטות נקודת הדגימה עבור ביטול הטיה ו de-convolution.שנה את הלייזרים למצב שלושה צבעים ולחץ שוב על בצע. כדי להתחיל, להוסיף 100, 000 תאים אנטי מציגים כדי מוכן חמישה מילימטר קוטר מעגלי coverslip ולאפשר להם להסתפק 10 דקות. משמנים את מחזיק הדגימה ומוסיפים את המכסה לצד התא למעלה.לאחר מכן, הוסף טיפה של מדיה הדמיה בחלק האחורי של כיסוי. בורג מחזיק הדגימה על Piezo ולחץ על תמונה הבית. מצא תא מציג אנטיגן לתמונה וודא כי LLSM ותופת הדמיה מתפקדים כראוי.הקש Live כדי להציג את התמונה הנוכחית. לנוע לאורך Z כדי למצוא את המכסה ותאים. מצא את המרכז של תא מציג אנטיגן על ידי נע בכיוון Z, ולאחר מכן לחץ על עצור כדי להשהות את הלייזר.בדקו תלת-מימד והקלטו את הקנונים הרצויים. לחץ על מרכז ולאחר מכן לחץ על בצע כדי לאסוף את הנתונים. מנמיכים את הבמה למיקום העומס ומוסיפים 50 מיקרוליטרים של תאי T ומדיית הדמיה ירידה חכמה ישירות מעל הכיסוי.עדיף לתת טופס טיפה בקצה קצה פיפטה ולאחר מכן לגעת בקצה לנוזל האמבטיה. העלה את השלב בחזרה על-ידי לחיצה על החזרת תמונה. התחל בהדמיה.הקפד להגדיר את מחסנית Z הרצויה ואת אורך timelapse. לדוגמה, תמונה 60 Z ערימות בגודל צעד 0.4 מיקרומטר ומסגרת זמן קלט 500. הפסק להקליט לפני 500 מסגרות הם הגיעו כדי למנוע הלבנת תמונות.השתמש במצב חי כדי לחפש זוגות תאים וכאשר הוזנו הגדרות מוכנות ורצויות, הקש Execute כדי לאסוף נתונים. במחקר זה, עכבר ראשי 5CC7 T-תאים מבודדים ומוכנים ולאחר מכן הם בתמונה באמצעות מיקרוסקופ סריג אור גיליון. מוצגים כאן נתיב הקרן הנכון ויישור קרן כאשר בתמונה עם פלואורסצין.הסריקה האובייקטיבית אמורה להציג צורת X גדולה בהקרנות XZ ו- YZ שהיא סימטרית ככל האפשר. הם צריכים גם להיות מותאמים להיות קטנים של X ככל האפשר. סריקת Z galvo אמורה להציג אליפסה ב- XZ וב- XY עם נקודה אחת משני הצדדים.לבסוף, הן סריקת המטרה Z פלוס ואת הסריקה לדוגמה צריך להראות נקודות להסתכל עגול ככל האפשר. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן היה לראות את הדינמיקה הארבע מימדית של קולטני תאי T על משטח של תאי T. היתרון העיקרי של מיקרוסקופ זה טמון ביכולת לעקוב אחר יחידות פני השטח המדמיינות של קולטני תאי T ולקבל נתונים מכומתים מגודלם, תנועתם, עוצמת האות והפרשתם.הדבר החשוב ביותר שיש לזכור הוא איכות היישור שלך. יש ליישר את גיליון תאורת הסריג מדי יום ולא לעשות זאת כראוי יגרום להדמיה מעוותת. באופן דומה, איכות PSF שנאסף משפיע ישירות על איכות de-convolution אשר בסופו של דבר תוצאות איכות התמונה הסופית שלך.אחת הסיבות שיטה זו היא כל כך חזקה היא כי כל תא ותווית ניתן להחליף כדי לדמיין סוגים רבים של תאים ומולקולות. לכן, שיטה זו יכולה לשמש כדי לענות על כל שאלה הקשורה למעקב ארבע מימדי של מולקולות. אנו חושבים כי טכניקה זו תסלול את הדרך לחוקרים לחקור שאלות חדשות בתחום הסחר המולקולרי.זה עדיין לא בשימוש נרחב בשל המערכת המסובכת אז אנחנו מקווים וידאו זה Jove ישפר את הנגישות לטכניקה. הלייזרים המשמשים במערכת הם מחלקה ארבע ולכן יש לנקוט זהירות מוחלטת כדי להבטיח בטיחות לייזר. נא בצע את אימוני בטיחות הלייזר הדרושים לפני השימוש בשיטה זו.

visualizing-surface-t-cell-receptor-dynamics-four-dimensionally-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

פרוטוקול זה מתאר שיטה פלורסנט התמונה בתאי T הציג לפרוסות הלימפה. הטכניקה אישורים בזמן אמת וניתוחים של נדידת תאים T עם מסורתי widefield פלואורסצנטי או מיקרוסקופים confocal.

Ex vivo הדמיה של תאים T ב Slices צומת Murine לימפה עם widefield ו מיקרוסקופים confocal

המידור של חלבונים גם בתוך קרום פלזמה או אל מקומות תאיים הוא אחד מנגנון רגולטורי כי יכול מאוד להשפיע על התוצאות איתות, ולכן, כדי להבין איתות חשוב ללמוד את התנהגות במרחב ובזמן של חלבונים המעורבים. המתואר כאן מערכת מבוססת מיקרוסקופיה TIRF ללמוד התמרה האות בתאי T, אבל הוא החלים רחב.

טכניקה מיקרוסקופית TIRF הדמיה בזמן אמת סימולטני של TCR וחלבונים הקשורים אליו לשידור אותות

בסרטון זה, אנו מתארים את טכניקת המיקרוסקופ של יריעות אור הסריג כדי לדמיין אינטראקציות בין תאי T חיים ותאים מציגי אנטיגן. השיטה כוללת מיקוד יריעת אור סריג דקה במיוחד על זוג תאים המקיימים אינטראקציה כדי לקבל סדרה של תמונות דו-ממדיות, המשולבות לקבלת תמונות ארבע-ממדיות ברזולוציה גבוהה החושפות את הדינמיקה המרחבית-זמנית של האינטראקציה בין התא לתא.

מיקרוסקופ גיליון אור סריג כדי להמחיש אינטראקציות קולטן-ליגנד בתאים חיים

אנו מתארים שיטת הדמיה לחיות תאים המספקת תובנה דינמיקת חלבון במהלך תהליך תא T ההפעלה. אנו מדגימים את השימוש בשילוב של הפצת assay תא T, מיקרוסקופיה confocal וניתוח הדמיה להניב תוצאות כמותיות לעקוב איתות היווצרות מורכבת לאורך כל הפעלת תא T.

הדמית חיה בזמן אמת של T-תא איתות גיבוש קומפלקס

ההדמיה intravital ברזולוציה גבוהה עם ניגודיות משופרת עד 120 מיקרומטר עומק בבלוטות הלימפה של עכברים בוגרים מושגת על ידי מרחבית ויסות דפוס העירור של מיקרוסקופ שני פוטונים רב המוקדים. ב100 עומק מיקרומטר מדדנו החלטות 487 ננומטר (לרוחב) ו551 ננומטר (צירי), ובכך לעקוף את מגבלות פיזור ועקיפות.

מיקרוסקופית Intravital הפסים תאורה נפתר מאוד של מרכזי ז&#39;רמינל

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת כדי לדמיין ולעקוב אחר קולטנים בודדים על פני תאים חיים ובכך לנתח את הניידות הרוחבית של הקולטן, גודל קומפלקסי הקולטנים וכן לדמיין אינטראקציות קולטן-קולטן חולפות. ניתן להרחיב פרוטוקול זה לחלבוני ממברנה אחרים.

רזולוציה גבוהה ניתוח Spatiotemporal של קולטן Dynamics ידי המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי

תקשורת בין-תאית היא קריטית לשליטה בפעילות פיזיולוגית שונות בתוך ומחוץ לתא. מאמר זה מתאר פרוטוקול למדידת טבע מרחב ובזמן של הפרשות תא בודדות. כדי להשיג זאת, גישה רב תחומית המשלבת משמשת nanoplasmonic ללא תווית חישה עם הדמיה תא חי.

טכניקה ללא תווית להדמית החלל-הזמן של פרשות תא בודדת

חסינות אדפטיבית נשלטת על ידי 'סינפסות אימונולוגיות' דינמיות הנוצרות בין תאי T לתאים המציגים אנטיגן. פרוטוקול זה מתאר שיטות לחקירת תאי אנדותל הן כ-APCs פיזיולוגיים לא נחקרים והן כסוג חדש של 'מודל APC תאי מישורי'.

דגם תא האנדותל מישורי הדמיה החיסוני סינפסה Dynamics

כדי לחקור מהירויות זרימה וכיווניות של אקטין חוטי בסינפסה האימונולוגית של תאי T, הדמיה ברזולוציה גבוהה של תאים חיים משולבת עם פלואורסצנציה של השתקפות פנימית כוללת ומכומתת עם ספקטרוסקופיה של מתאם תמונה מרחבית-זמנית.

קליפת המוח אקטין זרימה בתאי T לכמת ידי מתאם תמונת ספקטרוסקופיה מרחב ובזמן של תאורה מיקרוסקופית נתונים מובנים

פרוטוקול זה מתאר שיטה מבוססת הדמיה כדי להפעיל באמצעות photoactivatable פפטיד MHC, המאפשר שליטה מדויקת ייתכן של הפעלת תא T לימפוציטים מסוג T.

יכולות בקרה של תא T הפעלה באמצעות אגוניסט Photoactivatable

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להמחיש תאים חיסוניים בתוך מטריצה תלת מימדי (3D) קולגן באמצעות מיקרוסקופ אור גיליונות. פרוטוקול זה מרחיב כיצד לעקוב אחר נדידת תאים ב- 3D. פרוטוקול זה יכול להיות מועסק עבור סוגים אחרים של תאים השעיה מטריקס תלת-ממד.

מיקרוסקופ אור גיליונות עבור ויזואליזציה תלת מימדי של תאים חיסוניים אנושי

למדו לדמיין דינמיקה של קולטני T בתאי CD4+ חיים באמצעות מיקרוסקופ גיליון אור סריג. פרוטוקול זה מספק הוראות מפורטות לתיעוד תלת-ממדי בזמן אמת ברזולוציה גבוהה עם פוטו-בלאנצ'ינג מינימלי.

דמיין את הדינמיקה של משטח הפני-תא באמצעות מיקרוסקופ גיליון אור של סריג

גלה סרטונים נוספים