דמיין את הדינמיקה של משטח הפני-תא באמצעות מיקרוסקופ גיליון אור של סריג

מיקרוסקופיית יריעות אור סריג היא טכנולוגיית הדמיה רבת עוצמה, אבל מעבדות מעטות בעולם מסוגלות להשתמש בו. פרוטוקול זה מספק סקירה מפורטת של אופן השימוש במיקרוסקופ גיליון האור המסחרי הזמין. זוהי מערכת חזקה מאוד המסוגלת הדמיה ארבע מימדית של תאים בודדים או עוברים המאפשר מעקב בזמן אמת של מולקולות.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יכולה לדמיין תלת מימדי תאים חיים בודדים או איברים ברזולוציה מרחבית גבוהה והלבנת תמונות מינימלית. דפוס הסריג של יריעת האור מאפשר לנו דגימות תמונה במהירות גבוהה ולקבל קטעי וידאו בזמן אמת של תאים חיים תלת מימדיים ואיברים עם פרטים מולקולריים שטכניקות אחרות לא יכולות להשיג. פרוטוקול וידאו ראשון זה מראה כיצד לנו סריג מיקרוסקופיה גיליון אור לתמונה תא יחיד ארבע מימדי.

זוהי טכניקה מסובכת מאוד עקב יישור הכנת מדגם. ואנחנו מאמינים שהדגמה חזותית תשפר את הנגישות בכך שתאפשר ליותר מדענים לדמיין מולקולות, תאים ואיברים רבים ושונים בביולוגיה. כדי להתחיל בהליך זה, דגירה חמישה מילימטר עגול מכסה עם 0.1% פולי-L-ליסין בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.

שאף את הנוזל ותן לכיסויים להתייבש באופן טבעי. לאחר מכן, להוסיף שלושה מיליליטר של שיפוע צפיפות לצינור חרוט 15 מיליליטר. בזהירות להוסיף תאים טיפה חכם לקצה הצינור.

צנטריפוגה ב 930 פעמים g ו בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר מכן, הסר בזהירות את השכבה האמצעית הדקה של התאים בין המדיה המלאה לבין רה"מ הדרגתי הצפיפות הקפד לשים כל סוג תא לתוך צינור חרוט נפרד. צנטריפוגה ב 300 פעמים g במשך חמש דקות כדי לשטוף את התאים.

השלך את העל-טבעי והוסף חמישה מיליליטר של RPMI לצינורות של תאי T ותאי CH27. חזור על השטיפה עם RPMI טרי עד שלוש שטיפות סה"כ בוצעו. לאחר מכן, תן שימוש חוזר בתאים בכל צינור עם מיליליטר אחד של RPMI מלא וספירת התאים עם המוציטמטר.

תוסיפו מחדש מיליון תאים המציגים אנטיגן ב-500 מיקרוליטרים של RPMI מלא ותוסיפו 10 מיקרומולרים MCC. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך שלוש שעות. לאחר מכן, תן שימוש חוזר במיליון תאי T ב-500 מיקרוליטרים של RPMI מלא.

הוסיפו שני מיקרוגרם של בטא אלקסה 488 נגד TCR המסומן כ-FAB ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני למשך 30 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה שני התאים ב 300 פעמים g במשך חמש דקות ולהשליך את supernatant. מוסיפים 500 מיקרוליטרים של RPMI מלא וחוזרים על הצנטריפוגה כדי לשטוף את התאים.

חזור על השטיפה עם RPMI טרי עד שלוש שטיפות סה"כ בוצעו השלכת supernatant לאחר כל שטיפה. לאחר מכן, תן שימוש חוזר בשני סוגי התאים ב-500 מיקרוליטרים של מדיית הדמיה. ראשית, מוסיפים 10 מיליליטר מים ו-30 מיקרוליטרים של פלואורסין לאמבטיה LLSM.

הקש Image Home כדי להזיז את האובייקט למיקום תמונה ולהסתכל על תבנית קרן לייזר בודדת של Bessel. יישר את קרן הלייזר באמצעות קו היישור ואזור העניין המוגדר מראש כדי להפוך את הקרן לתבנית דקה המאוזנת לכל הכיוונים. הקרן אמורה להופיע גם ממוקדת במצלמת הממצא.

השתמש בשני מכוונני הטיית המראה, במיקרומטר המוקד העליון ובצבע המטרה כדי להתאים את הקרן. לאחר מכן, לשטוף את האמבטיה ואת המטרות עם לפחות 200 מיליליטר של מים כדי להסיר לחלוטין כל פלואורסאצין. כדי לדמיין חרוזים פלואורסצנטיים סטנדרטיים, הפעל מיזוג צבעים על-ידי הגדרה לשלוש בתיבה טווח Xgalvo והקש Live כדי להציג את השדה הנוכחי.

התאם ידנית את מראה ההטיה, צבע המטרה ומיקרומטר המוקד לערכי האפור הגבוהים ביותר. לאחר מכן, להתאים לפי הצורך כדי לקבל דפוסים נאותים עבור סריקה אובייקטיבית, Z galvo, Z פלוס המטרה, מצבי לכידת סריקה לדוגמה. לאחר מכן, לחץ על בצע במצב סריקה לדוגמה כדי לאסוף את פונקציית התפשטות נקודת הדגימה עבור ביטול הטיה ו de-convolution.

שנה את הלייזרים למצב שלושה צבעים ולחץ שוב על בצע. כדי להתחיל, להוסיף 100, 000 תאים אנטי מציגים כדי מוכן חמישה מילימטר קוטר מעגלי coverslip ולאפשר להם להסתפק 10 דקות. משמנים את מחזיק הדגימה ומוסיפים את המכסה לצד התא למעלה.

לאחר מכן, הוסף טיפה של מדיה הדמיה בחלק האחורי של כיסוי. בורג מחזיק הדגימה על Piezo ולחץ על תמונה הבית. מצא תא מציג אנטיגן לתמונה וודא כי LLSM ותופת הדמיה מתפקדים כראוי.

הקש Live כדי להציג את התמונה הנוכחית. לנוע לאורך Z כדי למצוא את המכסה ותאים. מצא את המרכז של תא מציג אנטיגן על ידי נע בכיוון Z, ולאחר מכן לחץ על עצור כדי להשהות את הלייזר.

בדקו תלת-מימד והקלטו את הקנונים הרצויים. לחץ על מרכז ולאחר מכן לחץ על בצע כדי לאסוף את הנתונים. מנמיכים את הבמה למיקום העומס ומוסיפים 50 מיקרוליטרים של תאי T ומדיית הדמיה ירידה חכמה ישירות מעל הכיסוי.

עדיף לתת טופס טיפה בקצה קצה פיפטה ולאחר מכן לגעת בקצה לנוזל האמבטיה. העלה את השלב בחזרה על-ידי לחיצה על החזרת תמונה. התחל בהדמיה.

הקפד להגדיר את מחסנית Z הרצויה ואת אורך timelapse. לדוגמה, תמונה 60 Z ערימות בגודל צעד 0.4 מיקרומטר ומסגרת זמן קלט 500. הפסק להקליט לפני 500 מסגרות הם הגיעו כדי למנוע הלבנת תמונות.

השתמש במצב חי כדי לחפש זוגות תאים וכאשר הוזנו הגדרות מוכנות ורצויות, הקש Execute כדי לאסוף נתונים. במחקר זה, עכבר ראשי 5CC7 T-תאים מבודדים ומוכנים ולאחר מכן הם בתמונה באמצעות מיקרוסקופ סריג אור גיליון. מוצגים כאן נתיב הקרן הנכון ויישור קרן כאשר בתמונה עם פלואורסצין.

הסריקה האובייקטיבית אמורה להציג צורת X גדולה בהקרנות XZ ו- YZ שהיא סימטרית ככל האפשר. הם צריכים גם להיות מותאמים להיות קטנים של X ככל האפשר. סריקת Z galvo אמורה להציג אליפסה ב- XZ וב- XY עם נקודה אחת משני הצדדים.

לבסוף, הן סריקת המטרה Z פלוס ואת הסריקה לדוגמה צריך להראות נקודות להסתכל עגול ככל האפשר. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן היה לראות את הדינמיקה הארבע מימדית של קולטני תאי T על משטח של תאי T. היתרון העיקרי של מיקרוסקופ זה טמון ביכולת לעקוב אחר יחידות פני השטח המדמיינות של קולטני תאי T ולקבל נתונים מכומתים מגודלם, תנועתם, עוצמת האות והפרשתם.

הדבר החשוב ביותר שיש לזכור הוא איכות היישור שלך. יש ליישר את גיליון תאורת הסריג מדי יום ולא לעשות זאת כראוי יגרום להדמיה מעוותת. באופן דומה, איכות PSF שנאסף משפיע ישירות על איכות de-convolution אשר בסופו של דבר תוצאות איכות התמונה הסופית שלך.

אחת הסיבות שיטה זו היא כל כך חזקה היא כי כל תא ותווית ניתן להחליף כדי לדמיין סוגים רבים של תאים ומולקולות. לכן, שיטה זו יכולה לשמש כדי לענות על כל שאלה הקשורה למעקב ארבע מימדי של מולקולות. אנו חושבים כי טכניקה זו תסלול את הדרך לחוקרים לחקור שאלות חדשות בתחום הסחר המולקולרי.

זה עדיין לא בשימוש נרחב בשל המערכת המסובכת אז אנחנו מקווים וידאו זה Jove ישפר את הנגישות לטכניקה. הלייזרים המשמשים במערכת הם מחלקה ארבע ולכן יש לנקוט זהירות מוחלטת כדי להבטיח בטיחות לייזר. נא בצע את אימוני בטיחות הלייזר הדרושים לפני השימוש בשיטה זו.