הערכה של מדינת הדישון באמצעות מורפולוגיה גרעינית של הזרע בערידופזיס הפריה כפולה
29 באוגוסט 2019
אנו מדגימים שיטה לקביעת הפריה מוצלחת או כושלת שנכשלה על בסיס מורפולוגיה גרעינית של הזרע בערידרופזיס הפריה כפולה באמצעות מיקרוסקופ אפיפייתי.
פרוטוקול זה מספק דרך להעריך את מעורבותו של גורם מסוים להפריה כפולה של ערבידופסיס. מצב ההפריה יכול להישפט על ידי המורפולוגיה של גרעיני הזרע במבט חטוף, ולכן קבלתם המהירה של הנתונים לניתוח סטטיסטי אפשרית. שיטה זו ספציפית להערכה של פנוטיפ הפריה ב Arabidopsis.
יש עדיין רגולטורים לא ידועים להפריה, גם אם ערבידופסיס. שיטה זו תהיה שימושית לניתוח תפקודי של גורמי הפריה לא ידועים בעתיד. כדי לשלוט במיומנות של טיפול מהיר שלם של הביציות חשובים להצלחת ניתוח זה.
כדי להתחיל, לגדל ערבידופסיס thaliana ב 22 מעלות צלזיוס תחת מחזור אור 16 שעות ושמונה שעות חשוך בתא צמיחה. חותכים ומסירים את גבעול הפרחים המפותח הראשון עם מספריים כדי לקדם את הפיתוח של ניצנים ביתר. שבועיים עד שלושה שבועות לאחר ניתוק הגבעול הראשון, למדוד את גובה הצמח.
צמחים בגובה מעל 25 ס"מ נחשבים לצמחים הגדלים במרץ ומתאימים לניתוח. כדי לסרס, לחפש ניצנים בשלב 11 עם פיסות עלי כותרת לראות בחלק העליון. השתמש במספר חמש מדפים כדי להסיר עלי גביע, עלי כותרת, אבקן של ניצני פרחים.
15 עד 18 שעות לאחר סיכול, לקחת את היכל של קו נוקאאוט DMP9 עם רקע של פרח HTR10-mRFP בשלב 13 על ידי צביטת התסיסה עם ממטרות. כדי להאביק, לטפוח בעדינות את הסטיגמה של pistil מקורס מספר פעמים עם anther dehiscent. שבע עד שמונה שעות לאחר ההאבקה, לאסוף את pistil ולמקם אותו על הקלטת דו צדדית.
לאחר מכן, לחץ בעדינות עם מדפים כדי לתקן את pistil בקלטת. תחת מיקרוסקופ לנתח, לחתוך את הקצוות העליונים והתחתונים של השחלה באמצעות מחט הזרקה. להזיז את קצה מחט ההזרקה כדי ל חסוף את קיר השחלה לאורך שני הצדדים של replum.
חותכים בזהירות כדי לא להפריד את funiculus ואת דרכי המשדר. אוורט קיר השחלה. צובטים את בסיס המחיצה שאליו מחוברות הביציות, ומרימים אותו בזהירות במלקחיים.
מעבירים את הביציות לטיפה של מים על מגלשה, ומכסים בעדינות בכיסוי לתצפית תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. במיקרוסקופ epifluorescence המצויד בקוביית מסנן פלואורסצנטיות, התאימו את העדשה האובייקטיבית ל-20x או 40x. לרכוש תמונות של הביציות המכילות גרעיני זרע שכותרתו עם mRFP.
אשר את מספר גרעיני הזרע המסווים ב- mRFP בוואק עובר. אשר את הצורה והמיקום של כל גרעין זרע המסווים ב- mRFP בוואק עובר. במחקר זה, פנוטיפים הפריה נשפטו על ידי מורפולוגיה אות גרעיני זרע ביצית.
רוב הביציות הכילו שני גרעיני זרע עם תווית mRFP בצד המיקרו-pylar של תאי הביצה ובצוד הקצה השרנזלי של התא המרכזי. הדבר מצביע על הפריה כפולה מוצלחת. בנוסף, נצפו ביציות המכילות גרעין זרע עם תווית mRFP מנומק בגרעין התא המרכזי בתוספת גרעין זרע מרוכז עם תווית mRFP מחוץ לתא הביצית, מה שמצביע על הפריה יחידה.
במקרה של הפריה כפולה כושלת, שני גרעיני זרע מרוכזים עם תווית mRFP נצפו בגבול תא הביצית והתא המרכזי. בניתוח באמצעות קו נוקאאוט DMP9-knockdown עם רקע של אבקה HTR10-mRFP, ביציות המכילות גרעין זרע אחד מרוכז mRFP שכותרתו או שלושה או יותר mRFP שכותרתו גרעיני זרע נצפו לעתים רחוקות. בשילוב עם השימוש בקווי סמן נקביים, ניתן לנתח מצב הפריה מדויק יותר.
לדוגמה, מצב ההפריה לאחר היתוך gamete ולפני karyogamy ניתן לשפוט. כן, תהליך ההפריה מחולק למספר שלבים. השאלות שכל רגולטור הפריה מעורב בהם ניתן לענות על צעדים בשיטה משופרת זו.
זה יספק תובנה עמוקה יותר על הרבייה המינית של הצמח.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מספק שיטה להערכת סטטוס ההפריה ב-Arabidopsis באמצעות בחינת המורפולוגיה של גרעין תאי הזכר. הוא מאפשר איסוף מהיר של נתונים לצורך ניתוח סטטיסטי, ובכך מסייע בניתוח תפקודי של גורמי הפריה שאינם ידועים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של צמחים
- ביולוגיה רבייתית
- ביולוגיה של התא
רקע
- הפריה כפולה היא תהליך קריטי בצמחים פורחים.
- הבנה של מנגנוני הפריה עשויה לחשוף רגולטורים שאינם ידועים.
- Arabidopsis משמשת כאורגניזם מודל לחקר הרבייה בצמחים.
- הערכת המורפולוגיה של גרעיני הזרע יכולה להעיד על הצלחת ההפריה.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה לקביעת הצלחת ההפריה ב-Arabidopsis.
- סיוע בזיהוי של רגולטורים לא ידועים של ההפריה.
- מתן אפשרות לאיסוף נתונים מהיר לצורך ניתוחים המשך.
שיטות שהושתמשו
- מיקרוסקופיית אפי-פלואורסצנציה להדמיית גרעיני זרעים.
- הערכת מורפולוגיית הגרעין לקביעת מצב ההפריה.
- ניתוח סטטיסטי של הנתונים שנאספו.
- הכשרה בטכניקות לטיפול בלוּליות להשגת תוצאות מדויקות.
תוצאים עיקריים
- זיהוי מוצלח של סטטוס ההפריה על בסיס מורפולוגיה של תאי זרע.
- הדגמה של יעילות באיסוף נתונים לצורך ניתוח.
- אספקת מסגרת למחקר של גורמי הפרייה לא ידועים.
- הדגשת החשיבות של הטיפול בולומה בתוך המתודולוגיה.
מסקנות
- שיטה זו יעילה להערכת ההפריה ב-Arabidopsis.
- היא פותחת נתיבים לחקירת ווסתים לא ידועים של ההפריה.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על פרוטוקול זה לצורך אנליזות פונקציונליות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הערכה מדויקת של מצב ההפריה ב-Arabidopsis באמצעות מורפולוגיית הגרעין של תאי הזרה מספקת מדד כמותי ומהיר לניתוח תפקודי של רגולטורים של ההפריה. גישה זו מאפשרת סריקה פנוטיפית בהספק גבוה והערכה סטטיסטית של גנים מועמדים או גורמים המעורבים בהפריה כפולה. השיטה תומכת בגילוי מוקדם ובצמצום סיכונים מכניסטיים בממשק שבין ביולוגיה של רבייה בצמחים לבין תהליכי הנדסת תכונות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה פנוטיפית ישירה של רגולטורים מועמדים של ההפריה in vivo.
- תומך בהסרת סיכונים מכניסטיים על ידי הבחנה בין אירועי הפריה מוצלחים, חלקיים וכשלוים.
- מקל על מיון מהיר של הפרעות גנטיות או כימיות המשפיעות על הפריה כפולה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק בדיקה סטנדרטית מבוססת פלואורסצנציה לכימות תוצאות הפריה.
- מספק נקודות קצה מבוססות תמונה הניתנות לשחזור ומתאימות לניתוח סטטיסטי ולהשוואה בין מחקרים.
- מאפשר סריקה ניתנת להרחבה של קווים מוטנטיים או טרנסגניים לצורך זיהוי פנוטיפים של הפריה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתיישב עם יעדים תרגומיים על ידי קישור התערבויות מולקולריות לתוצאות רבייתיות במערכת מודל.
- תומך ברצף מהשלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של מטרות הקשורות להפרייה.
- מציע ערך ניבוי לאסטרטגיות לשיפור תכונות בביוטכנולוגיה של גידולים חקלאיים כאשר הוא מותאם כראוי.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד (Pipeline)
שיטה זו משתלבת ברצף התהליכים מהגילוי ועד לתיקוף עבור הנדסת תכונות רבייה בצמחים וגנומיקה תפקודית.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת היפותזות של רגולטורים של הפריה ומרכיבי מסלולים.
- סריקה: מספקת קריאות כמותיות וניתנות לשחזור לצורך פיתוח בדיקות וסריקת מוטציות.
- אנליטיקה: תומכת בהשוואה סטטיסטית של פנוטיפים של הפריה בין תנאים ניסיוניים שונים.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין ממצאים מנגנוניים לתיקוף של תכונות פרה-קליניות במערכות מודל.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה לשימוש חוזר עבור אנליזה פונקציונלית שוטפת של גורמי הפריה חדשים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בתיקוף המטרה ומפחית עמימות במנגנוני ההפריה.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של הערכה פנוטיפית ומאפשר איסוף נתונים מהיר ובקנה מידה רחב.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של "המשך/עצור" (go/no-go) עבור רגולטורים מועמדים ומשפר את הקצאת המשאבים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון של התערבויות גנטיות או כימיות בנתיבי פיתוח של ביולוגיה של הרבייה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול ב-Arabidopsis ובמיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- מחייב גישה לתשתורת דימוג אפי-פלואורסצנטית (epifluorescence) ולניתוח תמונות.
- מצריך פרוטוקולים סטנדרטיים לדיסקציה של לועים ולהכנת דגימות.
- עשוי לדרוש התאמה לשימוש במיני צמחים אחרים או במערכות מודל אחרות.
- תלוי בזמינות של קווי סמן פלואורסצנטיים לסימון גרעיני הזרע.
