Name: הערכה של מדינת הדישון באמצעות מורפולוגיה גרעינית של הזרע בערידופזיס הפריה כפולה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 s
Description: למדו להעריך מצב הפריה בערידופזיס באמצעות מורפולוגיה גרעינית של הזרע. שיטה זו מאפשרת איסוף נתונים מהיר לניתוח סטטיסטי ולזיהוי גורמי הפריה לא ידועים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי החברה היפן לקידום המדע KAKENHI מענק (JP17H05832 T. I.) ועל ידי מימון של תוכנית קידום המחקר בעדיפות אסטרטגית על פיטוכימיקלים הצמח מדעי מולקולרית, אוניברסיטת צ'יבה (יפן).

1. האבקה מלאכותית
הערה: לפני שמתחילים בתהליך, נדרש זוג מלקחיים של No. 5.
<ol><li>הגדל thaliana (Col-0) ב -22 ° c תחת מחזור כהה של 16-h בחדר הגידול. הערה: גזור ולהסיר את קנה הפרח הראשון שפותח עם מספריים כדי לקדם את הפיתוח של ניצנים השחי. צמחים הגדלים במרץ (2-3 שבועות לאחר חיתוך של הקנה הראשון; גובה הצמח כ -25 ס מ) מתאימים לניתוח.</li>
	<li>כדי לסרס, להסיר עלי גביע (איור 1b), כותרת (איור 1b), ו אבקן (איור 1b) של ניצנים פרח בשלב 118 (איור 1b) באמצעות מלקחיים מס ' 5. ניצן עם פיסות של עלי כותרת לראות בראש הוא הטוב ביותר. הערה: השתמש המתאים הנקבה סמן קו הסימון. בפרוטוקול זה, השתמשנו בצמח סוג פראי כמו ההורה הנשי.</li>
	<li>15 עד 18 שעות לאחר אה, לקחת את אבקן של DMP9KD/HTR10-mrfp פרח בשלב 138 על ידי צובט את חוט הלהט עם מלקחיים.</li>
	<li>כדי להאביק, בעדינות ללטף את הסטיגמה של מסורס פיסטיל מספר פעמים עם ביטול הריח.</li>
</ol>2. הכנת ביצית להשגחה
הערה: הפריטים הבאים נדרשים: זכוכית שקופית עם קלטת כפולה מחוברת, מלקחיים מס ' 5, מחט הזרקת G 27, ומיקרוסקופ מבתר.
<ol><li>7 כדי 8 h לאחר האבקה (האפ), לאסוף את פיסטיל ולמקם אותו על קלטת כפולה, ולאחר מכן לחץ בעדינות עם מלקחיים כדי לתקן את הפיסטיל על הקלטת (איור 2a, A '). הערה: רוב הברגי מקבל לפחות צינור אבקה אחד 10 האפ9. אם שניהם או כל אחד מתאי הזרע מן הצינור אבקה הראשון להיכשל להפרות, צינור אבקה השני יימשך על ידי הביצית בשל ההפריה הפריה מערכת10. כדי לנתח את המבנה של גרעין הזרע מצינור האבקה הראשון, מומלץ להשלים את ההכנה באמצעות 10 האפ לאחרונה.</li>
	<li>חותכים את הקצוות העליונים והתחתונים של השחלה באמצעות מחט הזרקה תחת מיקרוסקופ מבתר (איור 2B, B ').</li>
	<li>לחתוך את חומת השחלה לאורך שני צידי השזיף (איור 2c, C) על ידי הזזת קצה המחט הזריקה. הערה: הכנס את המחט הזריקה שתאפשר כדי למנוע הפרדה ביצית מן המחיצה.</li>
	<li>אוורט את חומת השחלה באמצעות מחט ההזרקה (איור 2D, D ').</li>
	<li>צבוט את בסיס המחיצה שאליה מחוברים המחוברים, והרימו אותו בזהירות עם מלקחיים (איור 2E).</li>
	<li>העבר את המכסה לתוך טיפת מים על זכוכית שקופית, ובעדינות לכסות עם זכוכית כיסוי להתבוננות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטית (איור 2E, E ').</li>
</ol>3. מיקרוסקופיה
הערה: בפרוטוקול זה, השתמשנו מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטית מצויד קוביית מסנן פלואורסצנטית (ראה טבלת חומרים), מצלמה דיגיטלית, ואת התוכנה המלווה.
<ol><li>השיגו תמונות של שימוש בגרעינים המכילים גרעיני זרע עם mRFP באמצעות עדשת המטרה 20x או 40x ומצלמה דיגיטלית מצוידת.</li>
	<li>אשר את מספר גרעיני הזרע המסומנים ב-mRFP בתוך שק העובר. הערה: ניתן לכלול בגודל האוכלוסיה שני גרעיני זרע בעלי תוויות של mRFP לניתוח סטטיסטי.</li>
	<li>אשר את הצורה והמיקום של כל גרעין הזרע שכותרתו mRFP בתוך שק העובר. הערה: מיד לאחר ששוחרר מצינור האבקה, זוג גרעיני זרע מרוכז בעלי תוויות של mRFP מותאמים לבין הביצה לתא המרכזי. גרעין הזרע של mRFP מסומן על ידי שזיהה בצד של הצ מציין הפריה תא מרכזית, למשל. על-ידי שימוש בשורה מתאימה בצורת סמן ממברנה, כפי שמוצג באיור המשלים 1, בין אם תא הזרע עובר פלמוסוגמיה (לאחר היתוך ממברנה אבל לפני קריומיה) ניתן לפקח בבירור.</li>
</ol>

<ol><li>Mori, T., Kawai-Toyooka, H., Igawa, T., Nozaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamete+dialogs+in+green+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Gamete dialogs in green lineages.</a> Molecular Plant. 8, 1442-1454 (2015).</li>
<li>Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+mechanisms+in+flowering+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Fertilization mechanisms in flowering plants.</a> Current Biology. 26, R125-R139 (2016).</li>
<li>Mori, T., Kuroiwa, H., Higashiyama, T., Kuroiwa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GENERATIVE+CELL+SPECIFIC+1+is+essential+for+angiosperm+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 is essential for angiosperm fertilization.</a> Nature Cell Biology. 1, 64-71 (2006).</li>
<li>von Besser, K., Frank, A. C., Johnson, M. A., Preuss, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+HAP2+%28GCS1%29+is+a+sperm-specific+gene+required+for+pollen+tube+guidance+and+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis HAP2 (GCS1) is a sperm-specific gene required for pollen tube guidance and fertilization.</a> Development. 133, 4761-4769 (2006).</li>
<li>Mori, T., Igawa, T., Tamiya, G., Miyagishima, S. Y., Berger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamete+attachment+requires+GEX2+for+successful+fertilization+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Gamete attachment requires GEX2 for successful fertilization in Arabidopsis.</a> Current Biology. 24, 170-175 (2014).</li>
<li>Takahashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+male+gamete+membrane+protein+DMP9%2FDAU2+is+required+for+double+fertilization+in+flowering+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The male gamete membrane protein DMP9/DAU2 is required for double fertilization in flowering plants.</a> Development. 145, dev170076(2018).</li>
<li>Ingouff, M., Hamamura, Y., Gourgues, M., Higashiyama, T., Berger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+dynamics+of+HISTONE3+variants+between+the+two+fertilization+products+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct dynamics of HISTONE3 variants between the two fertilization products in plants.</a> Current Biology. 17, 1032-1037 (2007).</li>
<li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+flower+development+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Early flower development in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 2, 755-767 (1990).</li>
<li>Kasahara, R. D., Maruyama, D., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+recovery+system+is+dependent+on+the+number+of+pollen+grains+for+efficient+reproduction+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Signaling+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">Fertilization recovery system is dependent on the number of pollen grains for efficient reproduction in plants.</a> Plant Signaling & Behavior. 8, e23690(2013).</li>
<li>Kasahara, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+recovery+after+defective+sperm+cell+release+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Fertilization recovery after defective sperm cell release in Arabidopsis.</a> Current Biology. 22, 1084-1089 (2012).</li>
<li>Hamamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+reveals+the+dynamics+of+two+sperm+cells+during+double+fertilization+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana.</a> Current Biology. 21, 497-502 (2011).</li>
<li>Igawa, T., Yanagawa, Y., Miyagishima, S., Mori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gamete+membrane+dynamics+during+double+fertilization+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Research%22%5BJournal%5D)">Analysis of gamete membrane dynamics during double fertilization of Arabidopsis.</a> Journal of Plant Research. 126, 387-394 (2013).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

HTR10-mRFP תוויות כרומטין אבהי (כלומר, לדמיין גרעיני תא זרע), ואת הדינמיקה הפריה כפולה דווחו7. מיד לאחר שחרורו מצינור אבקה, גרעיני זרע HTR10-mRFP עדיין צפוף. עם זאת, כל גרעין הזרע הוא לפרק עם מיזוג עם הגרעין הנקבי מגיים הנקבה בקאריומיה שלוש עד ארבע שעות לאחר פיוז ' ן קרום ממברנה7. תאי זרע לא מופרות נשארים מעובה, כפי שניתן לראות בתוך שק העובר שבו gcs1 תאי זרע נעצרו ללא הפריה (איור 3d). בדרך כלל, כאשר HTR10 פורייה-mrfp משמש ההורה אבקה, 5...

צמחים פורחים לייצר זרעים באמצעות הפריה כפולה, תהליך זה נשלט ישירות על ידי אינטראקציות בין חלבונים מקומי על ממברנה פלזמה תא רבייה1,2. פורח מפעל גברי, זוג תאים זרע, לפתח אבקה. שפופרת אבקה הצומחת לאחר האבקה מספקת זוג תאי זרע למשחק נקבה, תא ביצה ותא מרכזי, המתפתחים לתוך שק העובר. לאחר המשחק הגברי והנשי נפגשים, חלבונים על פני משטח גמטות לקדם הכרה, החזקה, והיתוך להשלים הפריה כפולה. במחקרים קודמים, קרום המשחק הגברי חלבונים תא מסוים 1 (GCS1)/הסיס 2 (HAP2)3,4 ו-תא רבייה ביטא 2 (GEX2)5 זוהו כרגולטורים הפריה מעורבים היתוך תא רבייה ו מצורף, בהתאמה. לאחרונה זיהינו מDUF679 זכר הממברנה הספציפי חלבון, תחום ממברנה חלבון 9 (DMP9), כמו וסת הפריה מעורב אינטראקציה תא רבייה. מצאנו כי ירידה של DMP9 ביטוי התוצאות עיכוב משמעותי של הפריה תא ביצה במהלך הפריה כפולה ב . thaliana6.
כמו הפריה כפולה מתרחשת שק העובר, אשר מוטבע בתוך ביצית כי הוא עטוף עוד עם רקמת שחלות, קשה להתבונן ולנתח את מצבי תהליכים הפריה כפולה. מסיבה זו, עדיין יש הרבה נקודות ברורות שיגבילו הבנה מלאה של המנגנון כולו של בקרת הפריה כפולה. הקמת טכניקות התבוננות כדי לעקוב אחר התנהגותו של גמטות במהלך הפריה כפולה תחת בתנאים vivo היא הכרחית לניתוח פונקציונלי של מועמדים פוטנציאליים הפריה ווסת. מחקרים שנעשו לאחרונה הניבו קווי סמן שבו מבנים subcellular המשחק מסומנים עם חלבונים פלורסנט. במאמר זה, אנו מדגימים פרוטוקול פשוט ומהיר להתבוננות הפריה כפולה שהתרחשה שק העובר נגזר מpistils מלאכותית מלאכותי. באמצעות תא זרע הגרעין סמן קו HTR10-mRFP7, מצב הדישון של כל מגיים נקבה יכול להיות מופלים על בסיס של זרע המבנה הגרעיני האותות. הפרוטוקול שלנו מתמקד בשינוי מורפולוגי כזה של גרעיני הזרע בהפריה יכול להשיג ביעילות כמות מספקת של נתונים עבור הוכחה סטטיסטית. קו DMP9-מיקוד עם רקע HTR10-mrfp (DMP9KD/HTR10-mrfp) שימש צמחים זכרים כדי להראות דפוס הפריה יחיד. הפרוטוקול מתאים גם לניתוח פונקציונלי של מוסבי הפריה אחרים.

<table><tbody><tr><td>BX51</td><td>אולימפוס</td><td></td><td>אפיפלואורסצנטי מיקרוסקופ</td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית</td><td>זכוכית מטסונאמי</td><td>C018181</td><td></td></tr><tr><td>DMP9KD/HTR10-mRFP</td><td></td><td></td><td>Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background Takahashi et al. (2018)6</td></tr><tr><td>קלטת דו צדדית</td><td>Nichiban</td><td>NW-15S</td><td>15 מ"מ רוחב</td></tr><tr><td>DP72</td><td>Olympus</td><td></td><td>Degital מצלמה</td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>Vigor</td><td></td><td>כל מלקחיים מס' 5 זמינים</td></tr><tr><td>תא גדילה</td><td>Nihonika</td><td>LPH-411PFQDT-SP</td><td></td></tr><<tr><td>em>HTR10-mRFP<</td><td></td><td></td><td>em>Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 (Col-0) background Ingouff et al. ( 2007)7</td></tr><tr><td>מחט הזרקה</td><td>Terumo</td><td>NN-2719S</td><td>27 G</td></tr><tr><td>זכוכית שקופיות</td><td>זכוכית מטסונאמי</td><td>S9443</td><td></td></tr><tr><td>SZX9</td><td>מיקרוסקופ</td><td>ניתוח אולימפוס</td><td></td></tr><tr><td>U-MRFPHQ</td><td>קוביית מסנן פלואורסצנטי אולימפוס (עירור: BP535-555, פליטה: BA570-625, מראה דיכרומטית: DM565)</td><td></td> UPlanFL N 40x אולימפוס <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>עדשת אובייקט (NA 1.3), טבילה בשמן</td></tr><tr><td>UPlanSApo 20x</td><td>עדשת אובייקט אולימפוס</td><td></td><td>(NA 0.75), יבשה</td></tr></tbody></table>

הערכה של מדינת הדישון באמצעות מורפולוגיה גרעינית של הזרע בערידופזיס הפריה כפולה

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

צמחים פורחים יש מערכת ייחודית רבייה מינית בשם ' הפריה כפולה ', שבה כל אחד מתאי הזרע מנתיכים בדיוק עם תא ביצה או תא מרכזי. לפיכך, שני אירועי הפריה עצמאיים מתרחשים כמעט בו זמנית. תא הביצית המופרית והתא המרכזי מתפתחים לזיגוטה ולאנדוזרע, בהתאמה. לכן, שליטה מדויקת של הפריה כפולה חיונית להתפתחות הזרעים שלאחר מכן. הפריה כפולה מתרחשת בתוך הנקבה המאובמת (שק העובר), אשר מוסתרים עמוקות מכוסה ברקמה עבה ורקמות שחלות. הבנייה הזאת רקמת העור עושה התבוננות וניתוח של הפריה כפולה די קשה ויצר את המצב הנוכחי שבו שאלות רבות לגבי המנגנון של הפריה כפולה נותרו ללא מענה. עבור הערכה תפקודית של מועמד פוטנציאלי לווסת הדישון, ניתוח פנוטימית של הפריה חשוב. כדי לשפוט את השלמת ההפריה ב Arabidopsis thaliana, הצורות של אותות פלואורסצנטית תיוג גרעינים זרע משמשים אינדיקטורים. תא זרע שאינו מגיע להפרות מצוין על-ידי אות מעובה מחוץ למשחק הנשי, ואילו תא זרע שמפרה בהצלחה מצוין על-ידי אות שאינו מעובד כתוצאה מקריסוגמיה בגרעין המגיים הנשי. השיטה המתוארת כאן מספקת כלי לקביעת הפריה מוצלחת או כושלת שנכשלה תחת בתנאים vivo.

מתוך פיסטיל מואבקים עם DMP9KD/HTR10-mrfp נאספו ב 7-8 האפ ו נצפתה.
רוב בעלי התפקידים הכילו שני גרעיני זרע mRFP המסומנים בתווית על תא הביצית (מיקרופיללר בצד) והתא המרכזי (צד הקצה של charazal), בהתאמה (איור 3A), המציין הפריה כפולה מוצלחת. בנוסף, המכיל את גרעין הזרע של mRFP מתויג בגרעין התא המרכזי בתוספת גרעין מרוכז mRFP בתווית הזרע מחוץ לתא ביצה (איור 3B</stron...

אנו מדגימים שיטה לקביעת הפריה מוצלחת או כושלת שנכשלה על בסיס מורפולוגיה גרעינית של הזרע בערידרופזיס הפריה כפולה באמצעות מיקרוסקופ אפיפייתי.

Flowering plants have a unique sexual reproduction system called &#8216;double fertilization&#39;,&#160;in which each of the sperm cells precisely fuses ...

פרוטוקול זה מספק דרך להעריך את מעורבותו של גורם מסוים להפריה כפולה של ערבידופסיס. מצב ההפריה יכול להישפט על ידי המורפולוגיה של גרעיני הזרע במבט חטוף, ולכן קבלתם המהירה של הנתונים לניתוח סטטיסטי אפשרית. שיטה זו ספציפית להערכה של פנוטיפ הפריה ב Arabidopsis.יש עדיין רגולטורים לא ידועים להפריה, גם אם ערבידופסיס. שיטה זו תהיה שימושית לניתוח תפקודי של גורמי הפריה לא ידועים בעתיד. כדי לשלוט במיומנות של טיפול מהיר שלם של הביציות חשובים להצלחת ניתוח זה.כדי להתחיל, לגדל ערבידופסיס thaliana ב 22 מעלות צלזיוס תחת מחזור אור 16 שעות ושמונה שעות חשוך בתא צמיחה. חותכים ומסירים את גבעול הפרחים המפותח הראשון עם מספריים כדי לקדם את הפיתוח של ניצנים ביתר. שבועיים עד שלושה שבועות לאחר ניתוק הגבעול הראשון, למדוד את גובה הצמח.צמחים בגובה מעל 25 ס"מ נחשבים לצמחים הגדלים במרץ ומתאימים לניתוח. כדי לסרס, לחפש ניצנים בשלב 11 עם פיסות עלי כותרת לראות בחלק העליון. השתמש במספר חמש מדפים כדי להסיר עלי גביע, עלי כותרת, אבקן של ניצני פרחים.15 עד 18 שעות לאחר סיכול, לקחת את היכל של קו נוקאאוט DMP9 עם רקע של פרח HTR10-mRFP בשלב 13 על ידי צביטת התסיסה עם ממטרות. כדי להאביק, לטפוח בעדינות את הסטיגמה של pistil מקורס מספר פעמים עם anther dehiscent. שבע עד שמונה שעות לאחר ההאבקה, לאסוף את pistil ולמקם אותו על הקלטת דו צדדית.לאחר מכן, לחץ בעדינות עם מדפים כדי לתקן את pistil בקלטת. תחת מיקרוסקופ לנתח, לחתוך את הקצוות העליונים והתחתונים של השחלה באמצעות מחט הזרקה. להזיז את קצה מחט ההזרקה כדי ל חסוף את קיר השחלה לאורך שני הצדדים של replum.חותכים בזהירות כדי לא להפריד את funiculus ואת דרכי המשדר. אוורט קיר השחלה. צובטים את בסיס המחיצה שאליו מחוברות הביציות, ומרימים אותו בזהירות במלקחיים.מעבירים את הביציות לטיפה של מים על מגלשה, ומכסים בעדינות בכיסוי לתצפית תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. במיקרוסקופ epifluorescence המצויד בקוביית מסנן פלואורסצנטיות, התאימו את העדשה האובייקטיבית ל-20x או 40x. לרכוש תמונות של הביציות המכילות גרעיני זרע שכותרתו עם mRFP.אשר את מספר גרעיני הזרע המסווים ב- mRFP בוואק עובר. אשר את הצורה והמיקום של כל גרעין זרע המסווים ב- mRFP בוואק עובר. במחקר זה, פנוטיפים הפריה נשפטו על ידי מורפולוגיה אות גרעיני זרע ביצית.רוב הביציות הכילו שני גרעיני זרע עם תווית mRFP בצד המיקרו-pylar של תאי הביצה ובצוד הקצה השרנזלי של התא המרכזי. הדבר מצביע על הפריה כפולה מוצלחת. בנוסף, נצפו ביציות המכילות גרעין זרע עם תווית mRFP מנומק בגרעין התא המרכזי בתוספת גרעין זרע מרוכז עם תווית mRFP מחוץ לתא הביצית, מה שמצביע על הפריה יחידה.במקרה של הפריה כפולה כושלת, שני גרעיני זרע מרוכזים עם תווית mRFP נצפו בגבול תא הביצית והתא המרכזי. בניתוח באמצעות קו נוקאאוט DMP9-knockdown עם רקע של אבקה HTR10-mRFP, ביציות המכילות גרעין זרע אחד מרוכז mRFP שכותרתו או שלושה או יותר mRFP שכותרתו גרעיני זרע נצפו לעתים רחוקות. בשילוב עם השימוש בקווי סמן נקביים, ניתן לנתח מצב הפריה מדויק יותר.לדוגמה, מצב ההפריה לאחר היתוך gamete ולפני karyogamy ניתן לשפוט. כן, תהליך ההפריה מחולק למספר שלבים. השאלות שכל רגולטור הפריה מעורב בהם ניתן לענות על צעדים בשיטה משופרת זו.זה יספק תובנה עמוקה יותר על הרבייה המינית של הצמח.

evaluation-fertilization-state-tracing-sperm-nuclear-morphology

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

החתמה היא תופעה במפעל ורבייה יונק. מתילציה DNA ממלא תפקיד חשוב במנגנוני של הטבעה. האנדוספרם בידוד וקביעת מעמד מתילציה של גנים...

קביעת מתילציה DNA של גנים מוטבעים ארבידופסיס האנדוספרם

בחיפוש יסודי ביולוגיה של התא היא להגדיר את המנגנונים העומדים בבסיס זהותה של האברונים המרכיבים התאים האיקריוטים. כאן אנו מציעים שיטה לזהות את הגנים האחראים על תקינות מורפולוגית ופונקציונלית של אברונים צמחים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ואת הדור הבא של כלים רצף.

פלואורסצנטי, מיקרוסקופ הקרנת ואת הדור הבא הרצף: כלים שימושיים לזיהוי גנים המעורבים אברון Integrity

אנו מדווחים שיטה יעילה ופשוטה לבודד את העוברים בשלבים מוקדמים של פיתוח...

בידוד יעיל ומהיר של עוברים משלבים מוקדמים<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; זרעים

אנו מספקים כאן פרוטוקול יעיל ואמין עבור immunostaining, הקרינה הכלאה באתר, מכתים DNA ואחרי הדמיה בביציות thaliana ארבידופסיס כל הר כמותיים, ברזולוציה גבוהה. שיטה זו השתמשה בהצלחה כדי לנתח שינויי הכרומטין ואדריכלות גרעינית.

שיטה יעילה לניתוח כמותי, תא בודד של הכרומטין שינוי ואדריכלות גרעינית בהר שלם-ביציות ב<em&gt; ארבידופסיס</em

פרוטוקול זה מתאר שיטת התבוננות מופרה ב תודרנית באמצעות סיווג ביצית ואחריו את הבדיקה של היווצרות תבנית העובר תחת מיקרוסקופ.

שיטת אפיון מופרה ב תודרנית

כתב יד זה מתאר במבחנה ביצית טיפוח שיטה המאפשרת הדמיה לחיות תאים של תודרנית מופרות, העוברים. בשיטה זו הוא מנוצל כדי להמחיש את הדינמיקה תאיים במהלך זיגוטה קיטוב מפרט הגורל תא בפיתוח עוברי.

במבחנה ביצית טיפוח עבור Live-תא הדמיה של הזיגוטה קיטוב והמתבנת העובר ב תודרנית לבנה

ב פרוטוקול זה, אנחנו מתארים טכניקות ניתוח ראוי תודרנית פרחים, siliques, כמה טכניקות ניקוי בסיסי, ונבחר מכתים נהלי כולה-הר תצפיות מבני הרבייה.

כולה-הר ניקוי, כתמים של תודרנית פרח איברים, Siliques

כאן, אנו מתארים שיפור של שיטת Semi-in vitro (SIV) לצפייה בהנחיית צינור אבקה וקליטה ב- Arabidopsis thaliana, אשר מגביר את הקבלה של הביציות. ניתן לשלב את שיטת SIV cum septum בעלת תפוקה גבוהה עם קווי סמן gametophyte וחיישנים ביולוגיים מקודדים גנטית כדי לפקח על התהליך הדינמי של ההפריה.

הדמיה חיה של קליטת צינור אבקה Arabidopsis והפריה כפולה בשיטת Semi-in vitro cum septum

שיטה משופרת למדידת פרופילי הידרציה של אבקה ב- Arabidopsis thaliana מתוארת כאן. השיטה החדשה מציעה רזולוציה גבוהה יותר, אינה פולשנית וניתנת לשחזור רב. הפרוטוקול מהווה כלי חדש לניתוח עדין יותר של התהליכים המווסתים את השלבים המוקדמים של ההאבקה.

בדיקה ביולוגית ברזולוציה גבוהה, מדגן יחיד, In Vivo אבקת הידרציה עבור Arabidopsis thaliana

פרוטוקול זה מתאר הכנת דגימות שלמות של שכבת תאי האנדוספרם בזרעי Arabidopsis thaliana . השיטה דורשת רק ציוד מעבדה נפוץ, כגון מחט הזרקה ומלקחיים מדויקים, ומאפשרת הדמיה של תאים חיים פלואורסצנטיים ברזולוציה גבוהה של תאי אנדוספרם בזרעים מתפתחים ובוגרים כאחד.

הכנת רקמה שלמה לאנליזה מיקרוסקופית של שכבת תאי האנדוספרם בזרעי ארבידופסיס מתפתחים ובוגרים

תנועת כרומוזומים במהלך פרופאזה מיוטית היא תופעה לא מובנת היטב שהיא בסיסית להיווצרות נבגים. פרוטוקול זה מתאר שיטה לרכישה, ניתוח וכימות של תנועות צנטרומר במהלך פרופאזה מיוטית במיוציטים זכריים של Arabidopsis thaliana .

אפיון הדמיה חיה של תנועות צנטרומר במהלך פרופאזה מיוטית זכרית ב- Arabidopsis thaliana

למדו להעריך מצב הפריה בערידופזיס באמצעות מורפולוגיה גרעינית של הזרע. שיטה זו מאפשרת איסוף נתונים מהיר לניתוח סטטיסטי ולזיהוי גורמי הפריה לא ידועים.

הערכה של מדינת הדישון באמצעות מורפולוגיה גרעינית של הזרע בערידופזיס הפריה כפולה

גלה סרטונים נוספים