מדידת אינטראקציות בין הפלורסנט לליגנין בסעיפים צמחיים על ידי sFLIM בהתבסס על מבוסס על קרינה פלואורסצנטית מקורית
2 בינואר 2020
פרוטוקול זה מתאר התקנה מקורית המשלבת מדידות ספקטרליות ולאורך החיים כדי להעריך förster תהודה העברת אנרגיה (לדאוג) בין מבוססי rhodamine בבדיקות פלורסנט ליגנין פולימר ישירות בסעיפים צמח עבה.
בביומסה lignocellulosic הפעילות של אנזימים המנתחים פוליסכרידים מוגבלת על ידי קיומן של אינטראקציות לא ספציפיות עם ליגנין. ניתוח FRET הוא גישה רלוונטית לאבולוציה בסולם הננו. קבלת כל החלקים לאחר יכול להיות אתגר בהתאם ביומסה.
קח את הזמן שלך עושה את הסעיף עם microtome ולבצע שטיפה עדינה. איסוף מדידות אורך חיים וספקטרום פלואורסצנטי מאפשר קביעת FRET רגישה כמותית וחד משמעית בין מולקולות ליגנין ו- TAG במקום. שיטה זו משתמשת בטכניקות מסובכות, כמו ניתוח מדגם על רכישת מיקרוסקופיה רב מימדית וניתוח שיכול להיות קל ללמוד עם הדגמה חזותית.
כדי להכין דגימות צמחים מעץ, חיטה, סיבים או שברים, השתמשו בסכיני גילוח כדי לחתוך דגימות ארוכות בסנטימטר אחד מבלי לפגוע במבנה החומר ולמקם את הדגימות תחת ואקום כדי להסיר כל אוויר. להטביע את הדגימות במשך 24 שעות רצופות 30%ו 50% ריכוזים של PEG מדולל במים בטמפרטורת החדר עם ערבוב עדין. ואחריו 24 שעות שקוע בריכוז של 100% PEG ב 70 מעלות צלזיוס.
לאחר טבילת 100%PEG, מניחים את הדגימות בכמוסות על פלטה חמה של 70 מעלות ומקטינים בהדרגה את טמפרטורת הלוח במרווחים של חמש מעלות צלזיוס עד שהצלחת מגיעה לטמפרטורת החדר. כאשר הדגימות התקררו, השתמש במיקרוטום ובלהבים חד פעמיים כדי להשיג בזהירות חלקים שטוחים בעובי 30 עד 60 מיקרומטר מכל בלוק PEG. הסר את PEG מהקטעים עם שלוש חמש דקות מים עדינים שוטף.
לאחר הכביסה האחרונה, דגירה עד שלושה חלקים לצינור עם 500 microliters של בדיקה פלואורסצנטי מוכן טרי במשך 72 שעות מוגן מפני אור. בסוף דגירה ויטראז', להשתמש במברשת כדי להעביר את החלקים לשקופית לפני הרכבה את החלקים בין שקופית זכוכית מספר 1.5H כיסוי להחליק. כדי לקבוע את רוחב החלון הספקטרלי של גלאי SFLIM, מניחים גבישי אוריאה בתיבת תרבות עם תחתית זכוכית 0.17 מיקרומטר וממקמים את התיבה על מחזיק דגימת מיקרוסקופ.
בחר את המטרה 20X לייזר ספיר מנומנם טיטניום עם אורך גל 900 ננומטר ו 2% כוח ולהדליק את הסריקה. לביצוע מדידות SFLIM, העברו את המערכת למצב SFLIM. כדי לאסוף את האות ההרמוני השני בגלאי sFLIM, התאימו בהדרגה את אורך גל העירור בלייזר מ-900 ל-980 ננומטר עד לאסוף את האות ההרמוני השני בערוץ הספקטרלי השני.
לאחר מכן קבע את אורך החלון הספקטרלי. עבור למצב סרוק שאינוD כדי לשלוח פוטונים פלואורסצנטיים לגלאי SFLIM. הגדר את רכישת sFLIM למצב הפוך לזמין כדי לאפשר לפוטון לסמוך על מונה הפוטון הבודד.
כאשר המכשיר מוכן, מניחים קטע צמח בקרה מקורי קש חיטה לבד בין השקופית ואת החלקת המכסה על שלב המיקרוסקופ ולהגדיר את המערכת למצב רציף כדי לאפשר את סריקת הלייזר. הגדר אוסף זמן של 30 שניות ובדוק שמפלה השבר הקבוע הוא בין 10 ל- 10 לרביעית ופעם אחת 10 עד השישית. לאחר מכן בחרו באזור המדידה בדגימה ולחצו על 'התחל'.
בסוף המדידה, שמרו את קובץ ה-sdt וחזרו על המדידה לתשע דגימות נוספות לפחות. יש למצוא איזון בין השגת מספיק פוטונים שנאספו עבור הפוטון תוך הימנעות דופק לקנות את אפקטים המושרה תמונה שיכולים לשנות את חיי florescence. למעלה לנתח את הנתונים sFLIM שנרכשו, לייבא את קש החיטה המקומי לבד קבצי נתונים לתוך תוכנת מונה פוטון יחיד לפתוח אפשרות מצב לבחור לא שלם Multi מעריכי 12.5 ננו שניות.
תחת אפשרויות והעדפות, בחרו 'חשב תגובה אינסטרומנטלית אוטומטית' ובחרו במודל 'התאמה מעריכית'. עבור כל ערוץ, החל את מודל ההתאמה ושמור את פרמטרי ההתאמה בגיליון אלקטרוני. לשם השוואה בין הערוצים והניסויים לחשב את חיי הפלואורסצנטיות העיקריים בגיליון אלקטרוני.
כדי לחשב את אורך החיים הממוצע עבור לפחות 10 דגימות בכל הערוצים, נתח את אורך החיים הפלואורסצנטי העיקרי בערוצים התורמים כדי לקבוע את ערך הערוץ הייעודי שבחר את מספר הפוטון הגבוה ביותר ומתאים לתנוכה המרבית של ליגנין. כדי להשוות את ערכי SFLIM ו- EFRET בין דגימת קש החיטה המקורית של הבקרה לבין מדגם ניסיוני, שקול EFRET חיובי הקשור לירידה הומוגנית לכל החיים בין הפקד לבין הדגימות הניסיוניות שיש לנתח כאירוע FRET. בניסוי מייצג זה, עקומות sFLIM מראות חלק מהשינויים שניתן להשיג בין מדגם הייחוס לבין שני מקרי האינטראקציה.
ואכן, עליית הפלואורסצנטיות באזורים ספקטרליים המתאימים לטווח פליטת רודאמין הם דמיינו בקלות. התבוננות זהירה של שלוש עקומות ריקבון פוטון הערוץ הראשון, גם מגלה פיתול חזק יותר עבור קש חיטה מקומי עם דקסטרין מתויג עם רודאמין, מאשר עבור קש חיטה ילידי דגירה עם PEG מתויג עם רודמין. לאחר התאמת עקומות ריקבון פוטון וחישוב כל ערוץ הראשי פלואורסצנטיות זמן החיים, חתימת FRET הופך להיות ברור יותר.
לדוגמה, בעוד שזמן החיים של הפלואורסצנטיות לחילופין עולה ויצטמצם לאורך הספקטרום הפלואורסצנטי עבור דגימת קש החיטה המקומית, חתימת FRET ברורה נצפית עבור שני חלקי קש חיטה מקומיים עם PEG מתויגים עם רודאמין וקש חיטה מקומי עם דקסטרין מתויג עם דגימות רודמין. בהקשר של הידרוליזה ביומסה lignocellulosic, שיטה זו יכולה בקלות להיות מועברת מחקרים אינטראקציה אנזים בדגימות ביומסה שונות הדורשות אפיון קפדני של כל ביומסה חדשה. מאז SFLIM אינו דורש קיבעון של המדגם הוא סולל את הדרך למחקרי אינטראקציה אנזים דינמי ליגנין והוא עשוי להנחות אסטרטגיות הנדסת אנזימים ביומסה טרום טיפולים.
כמו רוב הזמן, מדידות זמן החיים דורשים שימוש במקורות לייזר אינפרא אדום דופק. יש לנקוט באמצעי הבטיחות המתאימים בהתאם.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר גישה חדשנית המשלבת מדידות ספקטרליות ומדידות של זמן חיים של פלואורסצנציה כדי להעריך העברת אנרגיה בתהודה של פרסטר (FRET) בין גששים פלואורסצנטיים מבוססי rhodamine לבין ליגנין בחתכים עבים של צמחים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה של הצומח
- מיקרוסקופיית פלואורסצנציה
רקע
- ביומסה ליגנו-צלולוזית מציבה אתגרים בשל אינטראקציות לא ספציפיות עם ליגנין.
- ניתוח FRET שימושי לחקר אינטראקציות בקנה מידה ננומטרי.
- הכנת דגימות וחיתוכן הן קריטיות למדידות מדויקות.
- מדידות של זמן חיים פלואורסצנטי מספקות תובנות לגבי אינטראקציות מולקולריות.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה להערכת FRET בין ליגנין לבין גששים פלואורסצנטיים in situ.
- הקלת מחקרי אינטראקציה של אנזימים בדגימות ביומסה שונות.
- שיפור ההבנה של אינטראקציות דינמיות בין אנזימים לליגנין.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת דגימה הכוללת חדירת PEG וחיתוך במיקרוטום.
- אינקובציה של גשושים פלואורסצנטיים לצורך אנליזת FRET.
- שימוש ב-sFLIM למדידות ספקטרליות ומדידות זמן חיים.
- ניתוח נתונים באמצעות מודלי התאמה (fitting) לקביעת זמני חיים של פלואורסצנציה.
תוצאים עיקריים
- נצפו חתימות FRET ברורות בין ליגנין לבין דגימות rhodamine מסומנות.
- שינויים בזמן חיים של פלואורסצנציה מעידים על אירועי FRET מוצלחים.
- השיטה מאפשרת ניתוח השוואתי בין דגימות ביקורת לדגימות ניסוי.
- הושגו תובנות לגבי אינטראקציות של אנזימים עם ביומסה ליגנו-צלולוזית.
מסקנות
- השיטה שפותחה יעילה לחקר אינטראקציות בין אנזימים לליגנין.
- ניתן לבצע מחקרים דינמיים ללא קיבוע של הדגימה.
- גישה זו יכולה לספק מידע לאסטרטגיות של הנדסת אנזימים וטיפול מקדים בביומסה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
אינטראקציות לא ספציפיות בין אנזימים לליגנין מגבילות את יעילות ההידרוליזה בביומסה ליגנוצלולוזית, ובכך יוצרות צוואר בקבוק בייצור דלקים ביולוגיים וכימיקלים ביולוגיים. כימות של אינטראקציות אלו באמצעות FRET המבוסס על sFLIM מספק הפחתת סיכונים מכניסטית עבור הנדסת אנזימים ואופטימיזציה של טיפולים מקדימים. דבר זה מאפשר ביטחון חיזוי בתיקוף מטרות ובזיהוי מובילים עבור אנזימים מפרקי ביומסה.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות באמצעות מדידת זיקת קישור של אנזים לליגנין במטריצות צמחים טבעיות.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות חתימות FRET כמותיות ללא סימון חיצוני של הליגנין.
- ערך חיזוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי זיהוי וריאנטים של אנזימים עם אינטראקציות ליגנין לא ספציפיות מופחתות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: הכנת חתכי צמחים שעברו תיקוף לסריקה ברגישות גבוהה של אינטראקציות בין גששים פלואורסצנטיים לליגנין.
- שחזוריות: סטנדרטיזציה של מדידות ספקטרליות ומדידות זמן חיים כדי להבטיח זיהוי FRET עקבי בין סוגי ביומסה שונים.
- יכולת הרחבה: מאפשרת שימוש חוזר בפלטפורמה לצורך ניתוח השוואתי של מועמדים לאנזימים תחת תנאים מבוקרים.
מחקר טרנסלציונלי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מגשר בין נתוני אינטראקציה משלב הגילוי להערכות יעילות של אנזימים בשלב הפרה-קלני באמצעות סובסטראטים מורכבים.
- הלימה של סמנים ביולוגיים: מקשר בין שינויים בחיי הזריחה (fluorescence lifetime) לבין אירועי קישור פונקציונליים של אנזים לליגנין.
- קידום מותאם סיכונים: מסייע בקבלת החלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) על ידי הפחתת אי-ודאות מכניסטית במסלולי הידרוליזה.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים על ידי מתן אפשרות להערכה כמותית של אינטראקציות בין אנזימים לליגנין לפני אופטימיזציה של תרכיבים מובילים, ובכך תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים ובביטחון חיזוי בבחירת מועמדים אנזימטיים.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת השערות לגבי ספציפיות של אנזימים באמצעות כימות FRET בין ליגנין לבין גששים המסומנים ברודמין in situ.
- סריקה: מספקת חתכי צמחים המוכנים לבדיקה עם רכישת sFLIM סטנדרטית להערכה מהימנה של אינטראקציה בין תרכובות לאנזימים.
- אנליטיקה: מייצרת קריאות של זמן חיים של פלואורסצנציה וקריאות ספקטרליות המאפשרות השוואה של עוצמות אינטראקציה בין וריאנטים של אנזימים.
- מחקר תרגומי: מקשרת נתוני אינטראקציה מולקולרית להמשכיות פרה-קלינית על ידי מתן מידע לאסטרטגיות להנדסת אנזימים לשיפור הידרוליזה של ביומסה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת יכולת לשימוש חוזר לסריקת אינטראקציות של ליגנין על פני מקורות ביומסה מגוונים וספריות אנזימים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית באינטראקציות בין אנזימים לליגנין באמצעות מדידה ישירה בקנה מידה ננומטרי.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה והדירות באמצעות דימות ספקטרלי ודימות זמן חיים מתואמים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) על ידי אספקת נתונים כמותיים על אינטראקציות לצורך סינון אנזימים יעיל מבחינת הון.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון של מועמדים לאנזימים בהתבסס על פרופילי אינטראקציה עם ליגנין.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדימות זמן חיים של פלואורסצנציה ובניתוח ספקטרלי לצורך פרשנות מדויקת של נתוני sFLIM.
- תלוי במקורי לייזר אינפרא-אדום פולסטיים ובתשתית ספירה של פוטון בודד למדידות זמן חיים.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הכנת דגימות, חדירת PEG וחיתוך.
- כולל שיקולי התאמה עבור רמות שונות של אוטופלואורסצנציה של ליגנין בסוגי ביומסה שונים, כגון עץ, חיטה וסיבים.
- כולל מגבלות מעשיות הקשורות לניהול תקציב פוטונים כדי למנוע pulse pile-up וארטיפקטים מושרי-אור במהלך הרכישה.
