NMR-מבוסס על פעילות מבוססת על קביעת עיכוב מורכבים, IC₅₀ ערכים, פעילות פרועובדתית, ואת הפעילות התא כולו של נוקלאוטילסייד הריבוליטיות

מסיאי פעילות מבוססי NMR מספקים שיטה יעילה לזיהוי, הערכה ואימות מעכבים עבור אנזים נתון. הם מתאימים במיוחד להקרנת קטעים. מסיאי NMR נוחים לריכוזים התרכובת הגבוהים הנדרשים למעכבים חלשים יותר.

בנוסף, המחסור באנזימים עיתונאיים הופך אותם לפחות נוטים לחיוביות שגויות. אנו משתמשים בבדיקות NMR במעבדה שלנו כדי לזהות ולאפיין את המעכבים של שני אנזימים מ- Trichomonas vaginalis. שני האנזימים מייצגים מטרות חדשות לתרופות אנטי-טריכומונליות חדשניות.

ה- NMR מקשה בדרך כלל על כל תחום מחקר המערב אנזימים, והם יכולים אפילו לשמש לחקר האנזימים בתוך התאים. ההיבטים החשובים ביותר של הטכניקה הם להבטיח כי כרכים ריאגנט הנכון הם pipetted ואת רכיבי התגובה מעורבבים ביסודיות. כדי להכין את המצע ואת תרכובות הבדיקה, להוסיף 12 microliters של מצע לכל אחד מארבעה צינורות microfuge 1.5 מיליליטר ולהוסיף שישה microliters של DMSO deuterated לבקרה אפס דקות צינורות בקרה 30 דקות.

הוסף שישה מיקרוליטרים של תרכובת הבדיקה לצינור הניסוי הראשון ושלושה מיקרוליטרים של תרכובת הבדיקה ושלושה מיקרוליטרים של DMSO deuterated לצינור הניסוי השני. לאחר מכן, להוסיף 300 microliters של תחמוצת דיטריום לצינור 15 מיליליטר המכיל 2.59 מיליליטר של חיץ תגובה, ואחריו 25 microliters של פתרון אנזים. בעדינות להפוך את הצינור פעמיים כדי לערבב פתרון מלאי התגובה ולהוסיף 10 microliters של 1.5 חומצה הידרוכלורית טוחנת צינור 1.5 מיליליטר המכיל 582 microliters של פתרון מלאי התגובה.

לאחר מכן, להעביר את כל הנפח של פתרון מלאי התגובה וחומצה לצינור הבקרה אפס דקות בו זמנית ליזום ולהרוות את תגובת השליטה אפס דקות. שאפתן וחלוקת המדגם פעמיים בצורה איטית אך מכוונת. ליזום ולהפעיל את שלוש התגובות הנותרות בצורה מזעזעת, מיד להעביר 582 microliters של פתרון מלאי התגובה לצינור הניסוי הראשון ערבוב המדגם פעמיים כפי שהוכח רק.

שאיפה זהירה וחלוקה מבטיחה ערבוב מלא במהלך שלבי החניכה. היו עקביים עם כל דגימה כדי להבטיח ערבוב דיפרנציאלי אינו משתנה. לאחר 30 שניות, להעביר 582 microliters של פתרון מלאי התגובה לצינור הניסוי השני לערבב, ואחריו תוספת של עוד 582 microliters של פתרון מלאי התגובה לצינור הבקרה 30 דקות 30 שניות לאחר ייזום התגובה בצינור הניסוי השני.

לאחר 30 דקות, מוסיפים 10 מיקרוליטרים של חומצה הידרוכלורית 1.5-טוחן לצינור הניסוי הראשון, חוזרים על מרווה במרווחים של 30 שניות עבור צינורות הבקרה הניסיוניים השניים ו -30 דקות. כאשר כל התגובות כבר מרווה, להעביר 600 microliters של פתרון מכל תגובה צינורות NMR. כדי לחשב את המרת האחוזים של המצע עבור ספקטרום הבקרה, טען את הדגימות לספקטרומטר, אסוף את ספקטרום ה- NMR ו שכב את הספקטרום עבור הפקדים של אפס ו- 30 דקות.

שנה את קנה המידה של אות המצע בפקד של אפס דקות כך שיתאימו לפקד של 30 דקות ושים לב לאחוז זה. לאחר מכן, חשב את המרת האחוזים כ- 100 פחות האחוז מהתאמת אותות המצע. כדי לחשב את ההמרה באחוזים של המצע לתגובות המכילות את תרכובת הבדיקה, שכב את הספקטרום לבקרה של אפס דקות ואת התגובה הראשונה המכילה את תרכובת הבדיקה 500 מיקרומולר וקנה מידה של אות המצע בפקד של אפס דקות כדי להתאים את הספקטרום עם תרכובת הבדיקה.

שים לב לאחוז זה, ולהשתמש בו כדי לחשב את המרת האחוזים כפי שהודגם זה בלבד. לאחר מכן, שכב את הספקטרום לשליטה של אפס דקות ואת התגובה הראשונה המכילה את תרכובת הבדיקה 250 מיקרומולאר, וקנה מידה של אות המצע בשליטה של אפס דקות כדי להתאים את הספקטרום עם תרכובת הבדיקה. לאחר שים קץ לאחוז, השתמש בו כדי לחשב את המרת האחוזים.

כדי לחשב את התגובה אחוז ועיכוב אחוז עבור כל ריכוז תרכובת בדיקה, הראשון, לחשב את התגובה אחוז כמו המרה אחוז של מתחם הבדיקה, מחולק על ידי המרה אחוז של פעמים הבקרה 100. לאחר מכן לחשב את עיכוב אחוז כמו 100 מינוס התגובה אחוז. כדי לבצע בדיקת מסך נגד חומר ניקוי, להוסיף 300 microliters של תחמוצת deuterium ו 25 microliters של פתרון אנזים לצינור 15 מיליליטר המכיל 2.59 מיליליטר של חיץ תגובה.

בעדינות להפוך את הצינור פעמיים כדי לערבב את פתרון מלאי התגובה, ולהוסיף שני microliters של דטרגנט טריטון X-100 ל 20 מיליליטר של חיץ תגובה. לאחר מכן, הוסיפו 2.59 מיליליטר של חיץ תגובה, המכיל 0.01% חומר ניקוי טריטון X-100 לצינור חרוט חדש של 15 מיליליטר. לאחר מכן הוסיפו 300 מיקרוליטרים של תחמוצת דיטריום ו-25 מיקרוליטרים של תוסף אנזים לצינור.

בעדינות להפוך את הצינור פעמיים כדי לערבב פתרון מלאי התגובה. לאחר מכן, לקבוע את אחוז העיכוב עבור 100 מיקרומולר ו 50 מיקרומולרים תרכובות הבדיקה כפי שהוכח רק. שימוש בפתרון מלאי התגובה ללא חומר ניקוי, עבור קבוצה אחת של ארבעה צינורות ופתרון מלאי התגובה עם חומר ניקוי עבור קבוצה שנייה של ארבעה צינורות.

כדי לבצע דילול קפיצה, להעביר 468 microliters של חיץ תגובה ו 60 microliters של תחמוצת דיטריום לצינור המכיל 53.8 microliters של חיץ תגובה, חמישה microliters של פתרון אנזים, ו 1.2 microliters של DMSO כי כבר דגירה במשך 30 דקות. שאפו ופזרו את התערובת פעמיים בצורה איטית אך מכוונת. לפני העברת 468 microliters של חיץ תגובה ו 60 microliters של תחמוצת דיטריום לצינור המכיל 53.8 microliters של חיץ תגובה, חמישה microliters של פתרון אנזים, ו 1.2 microliters של תרכובת הבדיקה כי כבר דגירה במשך 30 דקות.

מערבבים את התגובה השנייה פעמיים כפי שהוכח. ומיד להעביר 588 microliters של פתרון מצינור הבקרה DMSO דילול קפיצה לצינור המכיל 12 microliters של מצע עם ערבוב. המשך להעביר 588 מיקרוליטרים ממבחנה תרכובת תרכובת דילול קפיצה, צינור הבקרה DMSO לא מדולל, ואת צינור תרכובת הבדיקה undiluted לכל אחד משלושה צינורות 1.5 מיליליטר, המכיל 12 microliters של מצע לצינור עם ערבוב במרווחים של 30 שניות לאחר מכן.

ואז לחכות 30 דקות לפני מרווה את התגובות, איסוף ספקטרום NMR, וחישוב עיכוב אחוז עבור כל תרכובת כפי שהוכח רק. כאן התוצאות לבדיקת שתי תרכובות נגד AgNH בבדיקה ראשונית תרכובת בדיקה באמצעות פרוטון NMR כפי שהוכח מוצגים. תגובת האנזים נצפית בקלות רבה וכמתה על ידי היעלמותו של סינגל אדנוסין ותהודה כפולה ב 8.48 ו 6.09 חלקים למיליון בהתאמה.

ואת המראה של מגורים סינגל אדנין ב 8.33 חלקים למיליון כפי שנצפה בספקטרום הבקרה 30 דקות. בנתון זה, התוצאות לבדיקת תרכובת בשני ריכוזים נגד AgNH בבדיקה נגד מסך דטרגנט באמצעות פרוטון NMR כפי שהוכח מוצגים. רק הבדלים מינימליים נצפים בהתעצמות של אותות המצע והמוצר באמצעות שני התנאים, מה שמצביע על כך שעיכוב האנזים שנצפה אינו חפץ של צבירה מורכבת.

שים לב כי תהודה הנובעת מהתרכובת שנבדקה וחומר הניקוי אינם מפריעים למצע או לתהודה של המוצר. התוצאות לבדיקת תרכובת בבדיקה דילול קפיצה נגד AGNH באמצעות פרוטון NMR כפי שהוכח לחשוף עוצמה מופחתת של אות המצע בתגובה 20 מיקרומולר לעומת התגובה 200 מיקרומולר, המציין כי העיכוב הוא הפיך. מדגם שלם ערבוב במהלך החניכה של כל תגובה עבור דילול קפיצה הוא קריטי.

נדרשת שאיפה וחלוקה זהירות ועקביות. ניתן להשתמש ב- NMR גם כדי למדוד את פעילות האנזים בתאים שלמים, באמצעות פתרון המכיל תאים מושעים במקום מאגר התגובה והאנזים. מאמצי גילוי התרופות האנטי-טריכומונליות שלנו ממשיכים להסתמך על בדיקות אלה כדי למדוד את העוצמה של תרכובות מסונתזות חדשות נגד האנזימים ריבוהידרולאז.

למרות שהוא משמש רק בכמויות קטנות מאוד, חומצה הידרוכלורית המשמשת כדי להתוות את התגובות הוא מסוכן ויש להשתמש בו עם ציוד מגן אישי הנכון.